Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+

Résumé

Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34⁺ cellules. Une méthode pour CD34⁺ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.

Résumé

Production de plaquettes se produit principalement dans la moelle osseuse dans un processus appelé Thrombopoïèse. Au cours de la Thrombopoïèse, cellules progénitrices hématopoïétiques différencient aux précurseurs de plaquettes de forme appelés mégacaryocytes, qui se différencient en phase terminale pour libérer les plaquettes des processus longs cytoplasmiques appelés proplaquettes. Mégacaryocytes sont rares cellules confinés à la moelle osseuse et sont donc difficiles à récolter en nombre suffisant pour utilisation en laboratoire. Une production efficace de mégacaryocytes humaines peut être obtenue in vitro en cultivant CD34⁺ des cellules dans des conditions appropriées. Le protocole détaillé ici décrit l’isolement des CD34⁺ cellules par cellule magnétique de tri des échantillons de sang de cordon ombilical. Les mesures nécessaires pour produire des mégacaryocytes extrêmement purs, matures dans des conditions sans sérum sont décrites. Détails des analyses phénotypiques de la différenciation du mégacaryocyte et détermination des proplaquettes production formation et plaquettes sont également fournis. Effecteurs qui influencent la différenciation mégacaryocyte et/ou formation proplaquettes, tels que les anticorps antiplaquettaires ou mimétiques de la thrombopoïétine, peuvent être ajoutés à des cellules cultivées à examiner la fonction biologique.

Introduction

Isolement d’un nombre suffisant de mégacaryocytes humains primaires (MK) pour une utilisation régulière de laboratoire n’est pas possible en raison de leur faible fréquence dans la moelle osseuse, où ils représentent ~0.01% de cellules nucléées¹. Une alternative commode est l’ex vivo de l’expansion et la différenciation des souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices en présence de facteurs de croissance spécifiques. Un certain nombre de cytokines dont stem cell factor (SCF ; c-kit ligand) et interleukine (IL) -3 et IL-11 ont été utilisés dans les systèmes de culture pour produire MKs. thrombopoïétine (TPO) est le facteur de....

Protocole

Ce protocole a été approuvé par la South Eastern Sydney Human Research Ethics Committee et ratifiée par le University of New South Wales' Human Research Ethics Committee. Sang de cordon ombilical provenant de donneurs sains a été fourni par le cordon sang Bank de Sydney (Sydney, NSW, Australie). Volumes d’environ 100 mL ont été utilisés pour cette procédure.

NOTE : Les travaux dans une placard à l’aide d’une technique aseptique de biosécurité classe II. Décontaminer l’extérieur du sac de sang de cordon avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des instruments stériles (ciseaux, pince à épiler) pour cette procédure.

1. prépar....

Résultats

Ce protocole permet la préparation de cultures très pures de MK de cordon dérivés du sang CD34⁺ cellules. Le pourcentage de CD34⁺ des cellules dans le cordon sang est d’environ 1,3 %¹⁵ (Figure 1 a) et le nombre total de cellules mononucléées (étape 1.8) s’étend de 90-300 x 10⁶ unitaire de l’UCB. La pureté du CD34 + / CD45 + cellules après isolement s’étend de 90 à 99 % (Figure 1 b

Discussion

Le protocole décrit ici est adapté pour une production constante de MK et de plaquettes dans la culture du sang de cordon ombilical. Ces cellules peuvent servir à étudier les divers processus tels que l’effet de drogues ou d’activités biologiques sur MK prolifération, différenciation, proplaquettes formation et production de plaquettes.

Une variété de combinaisons de cytokines et de milieux de culture ont été présentés dans la littérature. Addition de cytokines telles que le facteur des cellul.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs de culture cellulaire
Recombinant Human TPO	Miltenyi Biotec	130-094-013
StemSpan SFEM II	Stem Cell Technologies	9605	Milieux sans sérum pour cellules CD34+
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
CD34 Réactifs d’isolation
CD34 MicroBead kit ultra-pur	Miltenyi Biotec	130-100-453	Ce kit comprend le réactif de blocage des IgG humaines FcR et des microbilles CD34. Ces billes contiennent le clone d’anticorps anti-CD34 QBEND/10. Utilisez un autre clone anti-CD34 pour le contrôle de pureté (par exemple, le clone 8G12).
Lymphoprep	Alere Technologies	1114545	Milieux de séparation des lymphocytes (densité 1,077 g/mL)
Tampon de séparation stérile (SB)	Miltenyi Biotec	130-091-221	Ce tampon contient une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2 contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine et 2 mM d’EDTA. Il peut être préparé à l’aide de composants stériles de qualité culture cellulaire. Dégazez avant utilisation car les bulles d’air peuvent bloquer la colonne.
Name	Company	>Numéro de catalogue	Comments
Cytométrie en flux et réactifs de coloration cellulaire
PE Souris anti-Human CD34	BD Biosciences	340669	Clone 8G12. Cela peut être utilisé pour le contrôle de la pureté du CD34. Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.
Souris PerCP anti-humaine CD45	BD Biosciences	347464	dilution 1:10
des isotypes PerCP	BD Biosciences	349044	dilution 1:10
FITC Souris anti-humaine CD41a	BD Biosciences	340929	Concentration finale d’anticorps Dilution 1:5.
APC Souris anti-Human CD42b	BD Biosciences	551061	Cet anticorps peut également être utilisé pour détecter les MK matures (le pourcentage de cellules positives est généralement inférieur à celui de l’anti CD42a). Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.
Alexa Fluor 647 Souris anti-Humain CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	Actuellement distribué par Bio-Rad. Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.
Alexa Fluor 647 Souris Contrôle Négatif	AbD Serotec	MCA928A647	Actuellement distribué par Bio-Rad. Anticorps de contrôle d’isotype
Anti von Willebrand facteur de lapin polyclonal	Abcam	AB6994	dilution 1:200
souris V450 anti-humna CD41a	BD Biosciences	58425	dilution 1:20
V450 contrôle d’isotype	BD Biosciences	580373	dilution 1:20
Anticorps PAC1-FITC BD	Biosciences	340507	dilution 1:10
souris Anti CD62p monoclonal	Abcam	AB6632	dilution 1:200
Alexa Fluor 488 chèvre anti lapin IgG	Invitrogen	A11008	dilution 1:100
Alexa Fluor 594 chèvre anti souris IgG	Invitrogen	A11020	dilution 1:100
Ig Isotype Control cocktail-C	BD Biosciences	558659	Isotype control anticorps Iodure
propidium	Sigma Aldrich	P4864
CountBright Perles de comptage absolues	Sondes moléculaires, Invitrogen	C36950	Perles de comptage
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Materials
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Des colonnes plus petites et plus grandes sont également disponibles dans le commerce
MidiMACS Aimant séparateur	Miltenyi Biotec	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Falcon 5mL tubes FACS en polypropylène à fond rond, avec Snap Cap, technologies	stériles in vitro	352063
Lames en	verreMenzel-Glaser	J3800AMNZ
Supports de montage avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Supports de montage anti-décoloration avec DAPI
strong>Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
>Equipment
Microscope inversé	Leica	DMIRB Microscope
à fluorescence	Zeiss	Vert.A1
Analyseur de cellules	BD Biosciences	FACS Canto II
Cytospin	centrifugeuse ThermoScientific Cytospin	4
Nom	Entreprise	Catalog Numéro	Commentaires
Software
Logiciel d’analyse de cellules	BD Biosciences	FACS Diva Software
Logiciel d’analyse de cellule unique	Tree Star	FlowJo
Logiciel de microscope fluorescent	Zeiss	Zen 2 blue edition

Contrôle de < Microscope inversé