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Article de méthode

Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+

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DOI :

10.3791/56420

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27 décembre 2017

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

Dans cet article

Résumé

Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Une méthode pour CD34+ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.

Résumé

Production de plaquettes se produit principalement dans la moelle osseuse dans un processus appelé Thrombopoïèse. Au cours de la Thrombopoïèse, cellules progénitrices hématopoïétiques différencient aux précurseurs de plaquettes de forme appelés mégacaryocytes, qui se différencient en phase terminale pour libérer les plaquettes des processus longs cytoplasmiques appelés proplaquettes. Mégacaryocytes sont rares cellules confinés à la moelle osseuse et sont donc difficiles à récolter en nombre suffisant pour utilisation en laboratoire. Une production efficace de mégacaryocytes humaines peut être obtenue in vitro en cultivant CD34+ des cellules dans des conditions appropriées. Le protocole détaillé ici décrit l’isolement des CD34+ cellules par cellule magnétique de tri des échantillons de sang de cordon ombilical. Les mesures nécessaires pour produire des mégacaryocytes extrêmement purs, matures dans des conditions sans sérum sont décrites. Détails des analyses phénotypiques de la différenciation du mégacaryocyte et détermination des proplaquettes production formation et plaquettes sont également fournis. Effecteurs qui influencent la différenciation mégacaryocyte et/ou formation proplaquettes, tels que les anticorps antiplaquettaires ou mimétiques de la thrombopoïétine, peuvent être ajoutés à des cellules cultivées à examiner la fonction biologique.

Introduction

Isolement d’un nombre suffisant de mégacaryocytes humains primaires (MK) pour une utilisation régulière de laboratoire n’est pas possible en raison de leur faible fréquence dans la moelle osseuse, où ils représentent ~0.01% de cellules nucléées1. Une alternative commode est l’ex vivo de l’expansion et la différenciation des souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices en présence de facteurs de croissance spécifiques. Un certain nombre de cytokines dont stem cell factor (SCF ; c-kit ligand) et interleukine (IL) -3 et IL-11 ont été utilisés dans les systèmes de culture pour produire MKs. thrombopoïétine (TPO) est le facteur de croissance et la différenciation plus efficace pour les cultures megakaryocytic et est efficace seul ou avec d’autres cytokines, telles que le SCF et l’IL-32. TPO peut agir sur les populations de cellules souches se traduire par la prolifération et la maturation de MKs2.

Plaquettes produits MK de protubérances cytoplasmiques appelées proplaquettes et, in vivo, environ 1 x 1011 plaquettes sont formés tous les jours pour soutenir les numérations plaquettaires de 150-400 x 109/l. plaquettes production in vitro est jusqu'à 1000 -plier plus bas que in vivo estime à3, et cela a donné lieu à nombreuses conditions de culture à l’aide de CD34+ cellules progénitrices hématopoïétiques pour améliorer MK et plaquettes production in vitro. La source initiale de CD34+ cellules utilisées pour la différenciation MK était de sang périphérique humain4. Autres sources de cellules incluent la moelle osseuse5,6, les cellules souches embryonnaires et induits pluripotentes cellules souches (ESC/iPSC)7et cordon ombilical sang (UCB)8,9,10 . La moelle osseuse humaine CD34+ 11 et la souris lignée négative la moelle osseuse des cellules5 produits MK et plaquettes in vitro; Néanmoins, le manque de disponibilité de la moelle osseuse humaine limite son utilisation comme source de CD34+ cellules. En revanche, ESC et iPSC représentent une source illimitée de cellules pour la production de plaquettes in vitro . Production de plaquettes de ces cellules nécessite des cellules nourricières tels que les cellules murines OP9 et de plus longues périodes de culture. Plaquettes dérivées dans des conditions sans chargeur semblent être moins fonctionnel12. iPSC-dérivé des plaquettes sont susceptibles d’être d’utilisation en milieu clinique, puisqu’ils peuvent être étendus à grande échelle. Ce processus nécessite transduction LENTIVIRAUX médiée par des facteurs de transcription et à long terme de la culture de cellule13.

UCB est une source accessible de CD34+ cellules qui peuvent être facilement utilisés dans les paramètres de recherche. TPO seul peut favoriser la différenciation du cordon de dérivés du sang CD34+ cellules et cela donne lieu à MKs extrêmement pur, mature sans besoin de supplémentation de sérum ou de co-culture avec des cellules nourricières. Autres cytokines telles que le SCF peut diminuer la différenciation de l’UCB CD34+ cellules, tandis que Flt-3 ligand et IL-11 favorisent la production de mégacaryocytes immatures14. Ce protocole décrit la production de cultures de MK très pures de sang de cordon ombilical CD34+ cellules dans des conditions de milieu sans sérum.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par la South Eastern Sydney Human Research Ethics Committee et ratifiée par le University of New South Wales' Human Research Ethics Committee. Sang de cordon ombilical provenant de donneurs sains a été fourni par le cordon sang Bank de Sydney (Sydney, NSW, Australie). Volumes d’environ 100 mL ont été utilisés pour cette procédure.

NOTE : Les travaux dans une placard à l’aide d’une technique aseptique de biosécurité classe II. Décontaminer l’extérieur du sac de sang de cordon avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des instruments stériles (ciseaux, pince à épiler) pour cette procédure.

1. préparation des cellules sanguines et l’isolement des CD34 de cordon de cellules+

  1. Préparer le tampon de séparation stérile (SB) avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), pH 7,2 et contenant 0,5 % bovine serum albumine et 2 mM EDTA.
  2. Diluer 10 mL de SB dans un tube conique de 50 mL (un tube par 10 mL de sang est nécessaire). À l’aide d’une aiguille émoussée G18, montée sur une seringue de 10 mL, 10 mL de sang faire sortir du sachet et verser dans les tubes de 50 mL contenant 10 mL de SB.
  3. Ajouter 15 mL de médias de séparation de lymphocytes (voir Table des matières) jusqu’au fond du tube contenant le sang dilué, créant deux couches.
    Remarque : Distribuer les médias lentement au fond du tube pour éviter de mélanger les différentes couches.
  4. Centrifuger les tubes à 1 200 × g pendant 30 min à température ambiante (RT) avec aucune coupure et pas d’accélération.
  5. Transférer la couche près du centre du tube contenant des cellules mononucléaires (environ 5-10 mL de chaque tube) dans un nouveau tube de 50 mL à l’aide d’une pipette Pasteur. Ajouter SB dans chaque tube pour un volume total de 50 mL.
  6. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min à RT. jeter le surnageant.
  7. Resuspendre les granules cellulaires soigneusement avec une pipette Pasteur en 5-10 mL de moissonneuse-batteuse SB. les cellules en suspension et porter le volume à 50 mL avec SB.
  8. Comte de cellules en utilisant une coloration bleu Trypan et un hémocytomètre ou automatisée de cellules encontre (voir Table des matières). Pour déterminer le pourcentage de CD34+ des cellules dans l’échantillon, remettre 2,5 × 105 cellules dans 100 µL de SB et tache en ajoutant 10 µL d’anticorps anti-CD34-PE de 15 à 30 min à 4 ° C. Analyse par cytométrie en flux (Figure 1 a).
  9. Tubes à centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    Remarque : si ce n’est nécessaire immédiatement, les cellules mononucléaires peuvent être congelés à ce stade.
  10. Remettre en suspension les cellules dans 300 µL de SB par 108 cellules. Ajouter 100 µL de FcR IgG humaines (blocage réactif, voir la Table des matières) et 100 µL de billes magnétiques CD34 par 108 cellules. Mélanger doucement et laisser incuber à 4 ° C pendant 30-40 min.
    Remarque : Une suspension monocellulaire est nécessaire (si nécessaire, passer les cellules même si un filtre de 30 µm avant d’ajouter les réactifs). Utiliser les volumes de réactifs décrits ici pour 10 cellules de8 ou moins. Pour plus de 108 cellules, échelle des réactifs (SB, bloquant la solution et CD34 billes magnétiques) en conséquence.
  11. Préparer la colonne de séparation LS au cours de la période d’incubation en plaçant la colonne LS dans un support magnétique et de lavage avec 3 mL du SB. jeter l’effluent.
    Remarque : Les colonnes de séparation LS peuvent être chargés avec jusqu'à 2 × 108 cellules total. Petites et grandes colonnes sont disponibles.
  12. Ajouter 5 à 10 mL de SB au mélange cellulaire et centrifuger à 400 × g pendant 10 min. éliminer le surnageant.
  13. Remettre en suspension des cellules dans 1,5 mL de SB et charger la suspension cellulaire (1,5 mL) sur la colonne de LS. Recueillir le débit à travers contenant les cellules non marquées dans un tube de prélèvement de 15 mL (fraction négatif #1). Laisser le liquide vider et laver la colonne avec 1,5 mL de SB.
  14. Charger le flux collecté à travers (3 mL) dans la colonne et collecter le débit à travers dans le même tube de prélèvement de 15 mL (fraction négatif #1). Laver la colonne LS 3 fois avec 3 mL de SB.
    Remarque : Si nécessaire, les cellules de la fraction négative (12 mL) peuvent être colorés avec un anticorps anti-CD34 à savoir la capture de CD34+ des cellules de la colonne de LS.
  15. Retirer la colonne du séparateur magnétique et rincer les cellules lentement avec un piston de la seringue dans un nouveau tube de 15 mL avec 2 mL de SB.
  16. Replacer la colonne sur séparateur magnétique et charge le 2 mL de cellules dans la colonne. Recueillir le débit à travers et laver avec 2 mL SB. Il s’agit de la fraction négative #2 (4 mL).
  17. Supprimer colonne LS séparateur magnétique et ajouter 2 mL de cellules SB. chasse d’eau régulièrement et fermement avec un piston de la seringue pour recueillir le CD34+ fraction cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan et un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées.
  18. Tube à centrifuger avec la fraction positive à 400 × g pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un milieu sans sérum pour CD34+ cellules (gestion durable des forêts, voir la Table des matières).
    Remarque : si ce n’est nécessaire immédiatement, les cellules peuvent être congelés dans l’azote liquide à ce stade.

2. pureté cocher de CD34 isolé des cellules+

  1. 2 x 104 cellules de la fraction positive avec les anticorps anti-CD34-PE µL et les anticorps anti-CD45-PerCP 20 µL pendant 15 min à 4 ° C (utiliser un autre tube pour isotype contrôles) 10 (Figure 1 b).
  2. Ajouter 1 mL de SB à laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min. remettre culot dans 200 µL de SB.
  3. Effectuer l’analyse en cytométrie en flux et porte la population de cellules vivantes pour exclure les débris (Figure 1 b). Fixer la porte pour PE et PerCP les populations positives en utilisant les contrôles d’isotype PE et PerCP (Figure 1 b) et déterminer le pourcentage de CD34+/CD45+ cellules.

3. mégacaryocyte différenciation

  1. Graines de 5 × 105 cellules/mL CD34+ cellules dans 2 mL de l’AFD additionné de 50 ng/mL thrombopoïétine humaine recombinante (rhTPO) / puits dans une plaque de 12 puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Si les cellules sont confluentes avant qu’ils soient nécessaires pour l’analyse, récolter les cellules et divisé en plusieurs loges avec supports neufs et rhTPO.
    NOTE : Deux ou trois puits devraient être établis spécifiquement pour surveiller la différenciation à des moments différents (p. ex., 7, 9 et 10 jours).
  2. Récolter les cellules provenant des puits mis de côté pour surveiller la différenciation sans déranger les cellules dans les autres puits.
  3. Cellules de tache avec anticorps anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µL et 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 l’anticorps dans un volume final de 100 µL. mis en place un contrôle tube à l’aide de l’anticorps de contrôle respectifs isotype. Incuber pendant 15 à 30 min à 4 ° C.
  4. Ajouter 1 mL de SB à laver.
Centrifuger à 400 × g pendant 10 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 200-300 µL de l’utilitaire Analyze SB. par cytométrie en flux.
  • Pour chaque fluorophore, analyser les contrôles isotype pour définir le processus de blocage pour les populations positives FITC et Alexa farine 647. Analyse des échantillons de cellules colorées afin de déterminer le pourcentage de CD41+/CD42a+ double de cellules positives, qui représentent MK mature (Figure 1).
  • Pour une visualisation microscopique des cellules marqueurs de surface tachent cellules tel que décrit à la 3.3.
    1. Ajouter 1 mL de SB à laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min. Resuspendre le culot dans 100 µL de SB et un essorage sur une lame de verre à 1 000 x g pendant 5 min. Fix cellules sur la diapositive en plongeant dans le méthanol pour 30 s. de l’Air sec, ajouter 20 µL de milieux contenant du DAPI de montage (voir Table des matières) , recouvrir d’un lamelle couvre-objet et visualiser à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 2 a).
  • Pour la visualisation des antigènes intracellulaires, remettre en suspension les cellules dans du PBS et fixer avec du paraformaldéhyde (concentration finale de 1 %) pendant 15 min à température ambiante. Pour permeabilize des cellules, ajouter triton-X 100 (0,1 %) et incuber pendant 15 min. cellules de lavage avec 2 mL PBS/0.1% triton-X 100. Remettre en suspension dans 100 µL de PBS/0.1% triton-X 100, ajouter anti vWf et anti CD62p anticorps (dilution 1 : 200) et incuber 30 min à température ambiante.
    1. Laver avec 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 et centrifuger à 400 × g pendant 10 min, resuspendre dans 100 µL de tampon de la même et ajouter de anti-souris IgG-Alexa 594 et anti-lapin IgG-Alexa 488 (1/100). Incuber 30 min à température ambiante, laver avec 2 mL PBS/0.1% triton-X 100, remettre en suspension dans 100 µL de tampon de la même et ajouter 20 µL d’anti-CD42b-APC. Puis faites tourner les cellules sur des lames de verre comme indiqué au point 3.6.1 et préparer les échantillons pour la visualisation microscopique comme indiqué au point 3.6.1.
  • Pour la détermination de la ploïdie, récolter les cellules au jour 12 ou 13 de différenciation. Ajouter 1 mL de SB à laver. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min et tache avec 20 anticorps d’anti-GPIIb/CD41-FITC µL dans un volume final de 100 µL. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    1. Laver une fois avec 1 mL de SB et Resuspendre le culot dans 300 µL de citrate hypotonique tampon (1,25 mM du citrate de sodium, chlorure de sodium 2,5 mM, dextrose de 3,5 mM) contenant 20 µg/ml d’iodure de propidium et 0,05 % Triton X 100. Incuber pendant 15 min à 4 ° C, abri de la lumière.
    2. Ajouter RNase à une concentration finale de 20 µg/mL et incuber 30 min à 4 ° C, abri de la lumière. Déterminer l’intensité de l’iodure de propidium par cytométrie en flux de collecte des événements de 30 000 à 50 000 de la population de CD41-FITC+ (Figure 2).

    • 4. proplaquettes décompte, énumération plaquettaire et l’Activation des plaquettes

    1. Récolter les cellules (de l’étape 3.1) aux jours 8 ou 9 de différenciation et de semences à 1 × 104 cellules/puits dans les plaques de 48 puits dans 200 µL de GDF frais additionné de 50 ng/mL rhTPO. Culture pendant 5 jours à 37 ° C, 5 % CO2.
      Remarque : À des fins de quantification, graine de puits en triple exemplaire. Cette faible densité est nécessaire pour la visualisation et le comptage des proplaquettes-roulement MK proplaquettes habituellement commencent à apparaître après 2 jours de culture. Le pic est entre 4 et 5 jours.
    2. Compter le nombre de porteurs proplaquettes MK dans l’ensemble bien sur un microscope inversé de lumière à l’aide de 10 X ou 20 X objectifs.
      Remarque : Une platine du microscope chaud (37 ° C) est préférable puisque gardant les cellules à température ambiante pendant une période prolongée provoque le rétrécissement des proplaquettes extensions. Proplaquettes sont observés comme des longues extensions du corps de MK. Chaque MK peut avoir plusieurs protubérances proplaquettes. Développent des proplaquettes, le corps du MK diminue en taille.
    3. Récolter les cellules et centrifuger à 400 g pendant 10 min à température ambiante. Colorer les cellules anticorps anti-humain CD41-FITC 20 µL comme décrit aux points 3.3 et 3.4. Calculer le pourcentage des proplaquettes-roulement MK (pbMK) : pbMK (%) = [(Proplatelet-roulement MKs/bien) / (Total CD41+ cellules / puits)] x 100
    4. Pour compter les plaquettes libérées dans le milieu de culture, délicatement mélanger les cellules avec une pipette Pasteur et prélever 100 µL au jour 14 ou 15 de la culture.
      1. Coloration à l’anticorps de l’ITCF CD41 anti-humain de 20 µL pendant 20-30 min à 4 ° C. Préparer un tube de contrôle à l’aide de l’anticorps de contrôle respectifs isotype.
      2. Ajouter 150 µL de SB et 50 µL de compter les perles.
      3. Pour cytométrie, régler la FSC et le SSC se connecter échelle. Utilisation normale des plaquettes de sang humains de plasma riche en plaquettes colorées au CD41-FITC comme décrit dans section 4.4.1 pour définir le processus de blocage pour les plaquettes (Figure 3 a).
      4. Analyser les plaquettes colorées avec le comptage des perles par cytométrie en flux. Collecter 1 000 événements de compter les perles à l’aide de la FSC versus diagramme de dispersion des SSC (Figure 3 a). Calculer le nombre de plaquettes basé sur des événements positifs CD41-FITC (Figure 3 b) selon la formule suivante :
        Plaquettes par µL = [(nombre d’événements positifs CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/volume de l’échantillon)]
    5. Pour analyser l’activation plaquettaire, délicatement mélanger les cellules avec une pipette Pasteur et prélever 100 µL au jour 14 ou 15 de la culture. Ajouter 1 mL de tampon (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glucose, pH 6,5) et la centrifugeuse Tyrode à 200 x g pendant 5 min granuler des cellules.
      1. Récupérer le surnageant et centrifuger à 800 g pendant 10 min granuler particules plaquettaire.
      2. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 100 µL de tampon de Tyrode. Ajouter 20 µL d’anticorps PAC1-FITC et adénosine diphosphate (ADP) à une concentration finale de 20 µM. Incuber à température ambiante pendant 20 min. analyse par cytométrie de flux pour déterminer le pourcentage d’événements positifs FITC. Utiliser les plaquettes humaines fraîches traitées de la même manière qu’un contrôle positif (Figure 3).

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    Résultats

    Ce protocole permet la préparation de cultures très pures de MK de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Le pourcentage de CD34+ des cellules dans le cordon sang est d’environ 1,3 %15 (Figure 1 a) et le nombre total de cellules mononucléées (étape 1.8) s’étend de 90-300 x 106 unitaire de l’UCB. La pureté du CD34 + / CD45 + cellules après isolement s’étend de 90 à 99 % (Figure 1 b

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    Discussion

    Le protocole décrit ici est adapté pour une production constante de MK et de plaquettes dans la culture du sang de cordon ombilical. Ces cellules peuvent servir à étudier les divers processus tels que l’effet de drogues ou d’activités biologiques sur MK prolifération, différenciation, proplaquettes formation et production de plaquettes.

    Une variété de combinaisons de cytokines et de milieux de culture ont été présentés dans la littérature. Addition de cytokines telles que le facteur des cellul...

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    Déclarations de divulgation

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Remerciements

    Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’Australian Health and Medical Research Council (projet subvention 1012409 liée au BHC).

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Réactifs de culture cellulaire
    Recombinant Human TPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605Milieux sans sérum pour cellules CD34+
    NameCompanyNuméro de catalogueComments
    CD34 Réactifs d’isolation
    CD34 MicroBead kit ultra-purMiltenyi Biotec130-100-453Ce kit comprend le réactif de blocage des IgG humaines FcR et des microbilles CD34. Ces billes contiennent le clone d’anticorps anti-CD34 QBEND/10. Utilisez un autre clone anti-CD34 pour le contrôle de pureté (par exemple, le clone 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545Milieux de séparation des lymphocytes (densité 1,077 g/mL)
    Tampon de séparation stérile (SB)Miltenyi Biotec130-091-221Ce tampon contient une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2 contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine et 2 mM d’EDTA. Il peut être préparé à l’aide de composants stériles de qualité culture cellulaire. Dégazez avant utilisation car les bulles d’air peuvent bloquer la colonne.
    NameCompany>Numéro de catalogueComments
    Cytométrie en flux et réactifs de coloration cellulaire
    PE Souris anti-Human CD34BD Biosciences340669Clone 8G12. Cela peut être utilisé pour le contrôle de la pureté du CD34. Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.
    Souris PerCP anti-humaine CD45BD Biosciences347464dilution 1:10
    des isotypes PerCPBD Biosciences349044dilution 1:10
    FITC Souris anti-humaine CD41aBD Biosciences340929Concentration finale d’anticorps Dilution 1:5.
    APC Souris anti-Human CD42bBD Biosciences551061Cet anticorps peut également être utilisé pour détecter les MK matures (le pourcentage de cellules positives est généralement inférieur à celui de l’anti CD42a). Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.
    Alexa Fluor 647 Souris anti-Humain CD42aAbD SerotecMCA1227A647TActuellement distribué par Bio-Rad. Concentration finale d’anticorps dilution 1:10.
    Alexa Fluor 647 Souris Contrôle NégatifAbD SerotecMCA928A647Actuellement distribué par Bio-Rad. Anticorps de contrôle d’isotype
    Anti von Willebrand facteur de lapin polyclonalAbcamAB6994dilution 1:200
    souris V450 anti-humna CD41aBD Biosciences58425dilution 1:20
    V450 contrôle d’isotypeBD Biosciences580373dilution 1:20
    Anticorps PAC1-FITC BDBiosciences340507dilution 1:10
    souris Anti CD62p monoclonalAbcamAB6632dilution 1:200
    Alexa Fluor 488 chèvre anti lapin IgGInvitrogenA11008dilution 1:100
    Alexa Fluor 594 chèvre anti souris IgGInvitrogenA11020dilution 1:100
    Ig Isotype Control cocktail-CBD Biosciences558659Isotype control anticorps Iodure
    propidiumSigma AldrichP4864
    CountBright Perles de comptage absoluesSondes moléculaires, InvitrogenC36950Perles de comptage
    NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
    >Materials
    LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401Des colonnes plus petites et plus grandes sont également disponibles dans le commerce
    MidiMACS Aimant séparateurMiltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5mL tubes FACS en polypropylène à fond rond, avec Snap Cap, technologiesstériles in vitro352063
    Lames enverreMenzel-GlaserJ3800AMNZ
    Supports de montage avec DAPIVector LaboratoriesH-1200Supports de montage anti-décoloration avec DAPI
    strong>NameCompanyNuméro de catalogueComments
    >Equipment
    Microscope inverséLeicaDMIRB Microscope
    à fluorescenceZeissVert.A1
    Analyseur de cellulesBD BiosciencesFACS Canto II
    Cytospincentrifugeuse ThermoScientific Cytospin4
    NomEntrepriseCatalog NuméroCommentaires
    Software
    Logiciel d’analyse de cellulesBD BiosciencesFACS Diva Software
    Logiciel d’analyse de cellule uniqueTree StarFlowJo
    Logiciel de microscope fluorescentZeissZen 2 blue edition
    Contrôle de < Microscope inversé

    Références

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    Cellules CD34 positivesIsolement partir de sang de cordonTri cellulaire magn tiqueCytom trie en fluxFormation de proplaquettesCulture sans s rumSuppl mentation en thrombopo tineMicroscopie fluorescence
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