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Article de méthode

Mesurer l’effet des produits chimiques sur la croissance et la Reproduction de Caenorhabditis elegans

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⸱

DOI :

10.3791/56437

⸱

5 octobre 2017

 , 
1Systems Biotechnology Research Center, Korea Institute of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Un protocole de base pour évaluer la toxicité des produits chimiques chez un animal modèle, Caenorhabditis elegans, est décrite. La méthode est pratique et utile pour le développement de produits pharmaceutiques ainsi que pour l’évaluation des risques de divers polluants environnementaux.

Résumé

Évaluation toxicologique est cruciale pour comprendre les effets des produits chimiques sur les organismes vivants dans les domaines des sciences biologiques fondamentales et appliquées. Un sol non-mammifère rond ver, Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle précieux pour les études de toxicologie en raison de sa commodité et des questions d’éthique animale par rapport aux systèmes animaux mammifères. Dans ce protocole, une procédure détaillée d’évaluation toxicologique des produits chimiques chez c. elegans est décrite. Un médicament anticancéreux clinique, étoposide, qui cible humaine topoisomérase II et inhibe la réplication de l’ADN des cellules cancéreuses humaines, a été choisi comme un modèle de tests chimiques. Âge-synchronisé c. elegans oeufs ont été exposés le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou étoposide, et ensuite la croissance de c. elegans a été surveillée tous les jours pendant 4 jours par l’observation microscope stéréo. Le nombre total de œufs mis c. elegans traités avec le DMSO ou étoposide a aussi compté en utilisant le microscope stéréo. Etoposide traitement affecté significativement la croissance et la reproduction de c. elegans. En comparaison du nombre total de œufs pondus de worms avec des périodes de traitement différent des produits chimiques, il peut être décidé que la toxicité pour la reproduction des produits chimiques sur la reproduction de c. elegans est réversible ou irréversible. Ces protocoles peuvent être utiles pour l’élaboration de divers médicaments et évaluation des risques des substances toxiques environnementaux.

Introduction

Évaluation toxicologique est essentielle pour le développement de produits pharmaceutiques, nutraceutiques et cosméceutiques, ainsi que l’évaluation des risques des différentes toxines environnementales. Le modèle de rongeur est l’un des systèmes plus populaires en vivo expérimental pour l’étude de toxicologie ; Alternativement, non-mammifère organismes comme c. elegans sont également largement utilisés. Modèles non mammifère évaluation toxicologique sont bénéfiques en raison non seulement des questions éthiques animales, mais aussi leur convenance et utilité étant donné le rapport coût/efficacité, maintenabilité, vitesse et reproductibilité1,2 ,3,4.

C. elegans, un sol rond ver, a été exploitée comme un animal modèle dans diverses recherches de biologie et chimie fondamentale et appliquée. C’est un 1 mm de long, le nématode transparent, qui est simplement maintenue en solide ou liquide nématode croissance Media (NGM) nourri avec la souche bactérienne Escherichia coli OP50. C. elegans a un cycle de vie court et sauvage N2 c. elegans Pond environ 300 œufs. Par conséquent, il se multiplie facilement pour être utilisés comme supports expérimentaux3,4,5. C. elegans a également été largement utilisé dans les études toxicologiques de beaucoup de médicaments et de polluants de l’environnement6,7,8,9.

Car de nombreux médicaments anticancéreux ciblent division rapide des cellules cancéreuses, ils peuvent également endommager les cellules normales comme la moelle osseuse, épithélium intestinal et les cellules du follicule pileux se divisant rapidement. Par exemple, les médicaments anticancéreux inhibiteur de topoisomérase ciblent le processus de réplication de l’ADN des cellules cancéreuses ; donc, ils inhibent aussi les cellules normales se divisant rapidement. Chaque organisme vivant possède les topoisomérases et ces topoisomérase inhibiteurs plus probable impact environnemental écosystèmes6,10,11. Ainsi, une plate-forme d’évaluation toxicologique de drogue utilisant un animal modèle est précieuse pour le développement de produits pharmaceutiques et d’évaluation des risques environnementaux.

Dans cet article, nous décrivons les protocoles détaillés afin de tester la toxicité de l’étoposide, qui est un agent anticancéreux clinique que cibles topoisomérase II, comme un produit chimique toxique de modèle chez c. elegans. Pour cela, nous allons décrire la méthode de mesure de la taille et le nombre total de œufs pondus chez c. elegans , traités avec l’étoposide.

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Protocole

Remarque : l’expérience entière doit être effectuée dans un laboratoire isolé propre maintenu à 20 ° C, avec peu de poussière et minimisation de contamination au cours du ver et manipulation bactérienne. À cette fin, les expériences doivent être effectuées sous la flamme d’une lampe à alcool ou à l’aide d’un banc propre.

1. entretien de c. elegans et oeuf préparation pour le Test chimique

  1. maintenir N2 de c. elegans (var. Bristol) sur un plat d’agar NGM nourri avec live OP50 e. coli à 20 ° C 12 , 13.
  2. Prepare synchronisé âge oeufs à l’aide d’eau de Javel solution traitement 5 ou le temps des oeufs portant la méthode 6 , 14 , 15.
    Remarque : avant la préparation oeuf, manteau de la plaque NGM contenant de l’étoposide et inactivés par la chaleur OP50 d’e. coli comme indiqué ci-dessous. Inactivés par la chaleur E coli OP50 est utilisée pour réduire au minimum l’activité métabolique des e. coli 6 , 16.

2. Préparation d’inactivés par la chaleur des e. coli OP50 à flux C. elegans pendant l’essai de toxicité

  1. préparer 500 mL de levure double tryptone (DYT) milieu tel que décrit dans le tableau 1 et ensemencer une seule colonie d’Escherichia coli OP50 cultivés sur une gélose Luria-Bertani (LB) plaque 5.
  2. Incuber la OP50 d’e. coli dans un incubateur à agitation pendant 14 heures à 37 ° C et à 150 tr/min.
  3. Après centrifugation pendant 30 min à 3 220 x g et 20 ° C, enlever tout surnageant DYT milieu et ajouter un pré-mélange de 25 mL de tampon de S, 250 µL de 1 M MgSO 4 et 25 µL de cholestérol 5 mg/mL (dissous dans l’éthanol). Toutes ces solutions sont stériles.
  4. Remettre en suspension les bactéries et les transférer sur un tube de plastique jetable 50 mL.
  5. Pour inactivation par la chaleur, incuber les remises en suspension OP50 d’e. coli dans un bain-marie pendant 30 min à 65 ° C.
  6. Refroidir jusqu'à la température ambiante et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Cela peut être conservée pendant jusqu'à un mois.

3. Préparation de NGM plaques contenant soit 1 % DMSO ou 750 µM Etoposide

  1. Prepare deux bouteilles en verre propre de 200 mL. Ajouter 0,6 g de NaCl, 0,5 g de peptone, 3,4 g de gélose, 195 mL d’eau distillée et un agitateur magnétique à une bouteille. Ajouter un agitateur magnétique à l’autre bouteille vide.
  2. Bouteilles autoclave ces deux pendant 15 minutes à 121 ° C, puis refroidir les bouteilles dans un bain-marie pendant 30 min à 55 ° C.
  3. Ajouter 0,2 mL de 1 M CaCl 2, 0,2 mL de cholestérol 5 mg/mL, 0,2 mL de 1 M MgSO 4 et 5 mL, KPO 1 M 4 (toutes ces solutions sont stériles) et ensuite les mélanger par agitation magnétique sur une plaque de cuisson à 55 ° C.
  4. Diviser le milieu NGM mixte dans deux bouteilles avec le même volume (100 mL). Ensuite, ajouter 1 mL de DMSO dans une bouteille, mélangez-le à l’aide de l’agitateur magnétique. Conservez l’autre flacon dans un bain d’eau à 55 ° C jusqu’au niveau suivant. Aliquote 3 mL du milieu à chaque 35 x 10 mm 2 boîte de Pétri contenant du DMSO. Cette étape peuvent fabriquer environ 33 plaques contenant du DMSO NGM.
  5. Mélanger l’autre bouteille à l’aide de l’agitateur magnétique, ajouter 1 mL de 75 mM étoposide (stock dissous dans le DMSO), mélangez à nouveau et répéter l’aliquote (étape 3.4). Environ 33 étoposide (750 µM)-contenant des plaques NGM peut être faite de cette étape.
    Remarque : Dans la corrélation de papier précédent 6, nous avons testé 0, 250, 500 et 1 000 µM d’étoposide. D’après ces données, nous avons choisi le 750 µM d’étoposide dose dans cet article.
  6. Cool down les plaques NGM contenant du produit chimique à la température ambiante en les laissant à température ambiante pendant environ 3 h et les stocker à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
    Remarque : Dans le cas de produits chimiques sensibles à la lumière en bloquant la lumière pour minimiser la décomposition photo-induits.
    Remarque : Vous pouvez également faire une plaque NGM normale sans produits chimiques pour la ponte d’essai qui peut être effectuée à l’aide de deux conditions différentes de traitement chimique, tel que décrit ci-dessous.
  7. Ajouter 100 µL d’inactivés par la chaleur OP50 e. coli (comme décrit dans la section 2) et réparties sur chaque plaque NGM. Laisser sécher pendant la nuit dans un incubateur de c. elegans à 20 ° C pour le test chimique

4. Mesure de la croissance de c. elegans

  1. transfert l' âge synchronisé c. elegans d’oeufs à la plaque NGM additionnée de 1 % DMSO ou 750 µM étoposide.
  2. Incuber c. elegans dans un incubateur à 20 ° C pendant 4 jours. Observer les vers à l’aide d’un microscope stéréo et prendre des images microscopiques tous les jours. 20 X grossissement (1 X objectif, un grossissement zoom X 2 et la lentille oculaire 10 X) est généralement appropriée pour l’observation de la croissance de c. elegans. Également prendre une image microscopique du micromètre de microscope pour l’étalonnage de taille de vis sans fin.
    Remarque : La famine affecte l’essai de toxicité. Par conséquent, nourrir avec bactéries suffisantes ou ajuster transfert c. elegans oeuf numéros au début. Observer jusqu'à 3 jours d’exclure la possibilité de mourir de faim.
  3. Mesurer la longueur du corps c. elegans traités avec le DMSO ou étoposide à chaque point de temps à l’aide de logiciels ImageJ.
    Remarque : Pour chaque mesure de l’échantillon, 50 vers suffisent pour l’analyse statistique.
    1. Dans ImageJ, ouvrez l’image de micromètre de stade microscopique (' File ' → ' ouvrir ').
      NOTE : Images de ver (étape 4.2) et de micromètre doivent être le même grossissement.
    2. Faites glisser une ligne de 1 000 µm sur l’image de calibration du micromètre en utilisant ' ligne droite ' outil.
    3. Click ' Analyze ' → ' échelle définie ' et entrée 1 000 et µm dans le ' la distance connue ' boîte et ' unité de longueur ' box, respectivement. Vérifier ' Global ', puis cliquez sur ' OK '.
    4. Ouvrez les images de ver (' File ' → ' Open '). Tracer une ligne le long de la caractéristique de chaque ver en utilisant ' ligne à main levée ' outil. Obtenir les données de longueur de corps en cliquant ' analyse ' → ' mesure '.
    5. Répétez ces étapes pour 50 vers.

5. Dosage de portant c. elegans oeufs

oeufs
  1. Incuber l’âge synchronisé sur le NGM plaque contenant DMSO ou étoposide pendant 64 h (avant la première naissance) jusqu’au stade jeune adult à 20 ° C.
    Remarque : Il est facultatif d’utiliser les vers de l’expériences de mesure de la croissance. Il est commode de faire la mesure de la croissance et de dosage de portant des œufs ensemble.
  2. 5 transfert vers adultes à la NGM nouvel plaques sans produits chimiques (condition 1, traitement chimique dans un certain délai de temps, des oeufs au stade adulte jeune) ou nouvelle plaque NGM contenant le même prétraitement chimique (condition 2, une exposition continue de produits chimiques par le biais de la période d’expérimentation dans l’ensemble) et puis les incuber pendant 24 h.
    Remarque : Il est recommandé de faire des répétitions à l’aide de plaques NGM 3-5 pour chaque traitement ; ces répétitions peuvent être utilisées pour l’analyse statistique.
  3. Transfert à la nouvelle plaque de NGM comme décrit ci-dessus et compter le nombre d’oeufs tous les jours. Compter les vers que rampé hors, mort et ont été intérieurement hatchéd.
  4. Répéter ces étapes jusqu'à ce que les vers pondent pas plus, généralement en 5 jours.
  5. Calculer le nombre de œufs pondus par ver de chaque plaque et somme de ces valeurs tous les jours pendant 5 jours pour déterminer le nombre total de œufs pondus.
    NOTE : Exclut le nombre de vers qui a rampé hors tension et en interne éclos dans le calcul.

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Résultats

Le traitement de l’étoposide (24-96 h) a considérablement retardé la croissance de c. elegans. Après 96 heures d’incubation, vers imprégnées d’étoposide a grandi à 0,86 mm dans la longueur du corps, tandis que les vers de véhicules traités a augmenté à 1,04 mm (Figure 1). Un retard de croissance a été observé aussi apparemment sous observation microscope stéréo (Figure 2). Nous avons commencé à voir les oeufs vers imprég...

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Discussion

Dans cet article, nous décrivons l’évaluation de la toxicité des produits chimiques chez c. elegans, un nématode du sol, utilisant l’étoposide comme un exemple de produits toxique. À cette fin, nous avons utilisé deux conditions expérimentales. Dans le premier set, c. elegans ont été cultivées sur étoposide contenant des plaques d’oeufs au stade adulte jeune, et puis les vers étaient autorisées à pondre sur des plaques NGM normales sans produits chimiques. Dans le deuxième set expérimental, c. elega...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par la subvention de recherche intra-muros Korea Institute of Science and Technology (2E27513) et la haute valeur ajoutée alimentaire technologie développement programme (IPET) financé par le ministère de l’Agriculture, des aliments et des affaires rurales (315067-03).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgarAffymetrix, États-Unis10906
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)type
CholesterolSigma, États-UnisC3045
Dimethyl sulfoxideSigma, États-UnisD2650
Escherichia coli OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
EtoposideSigma, États-UnisE1383
Image J software (ver 1.4)Natinoal Institute of Health, États-Unishttps://imagej.nih.gov/ij/
Caméra microscopeJenopitk, Progress Gryphax, Allemagne
PeptoneMerck, États-Unis107213
35 × ; 10 mm Boîte de PétriSPL Life Sciences, Corée du Sud10035
90 & times ; 15 mm Boîte de PétriSPL Life Sciences, Corée du Sud10090
StéréomicroscopeNikon, JaponSMZ800N
Extrait de levureBecton Dickinson, USA212750
Wild

Références

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