Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Summary

Ce protocole donne des mesures expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à effectuer du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) analyse des variations numéros de copie plantes.

Abstract

Les mutants sont inestimables ressources génétiques pour les études de fonction de gènes. Pour générer des collections de mutants, trois types d’agents mutagènes peuvent être utilisés, y compris biologiques telles que l’ADN-T ou transposon, chimique notamment le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), ou physique comme le rayonnement de l’ionisation. Le type de mutation observée varie selon le mutagène utilisé. Des mutants de rayonnement induit par ionisation, mutations incluent délétion, duplication ou réarrangement. T-DNA ou mutagenèse axée sur le transposon est limitée aux espèces qui sont sensibles à la transformation, mutagenèse chimique ou physique peut être appliquée à une vaste gamme d’espèces. Cependant, la caractérisation des mutations dérivé de mutagenèse chimique ou physique traditionnellement repose sur une approche de clonage positionnel, qui est le travail intensif et beaucoup de temps. Ici, nous montrons qu’une plate-forme de basées sur l’hybridation génomique comparative (aCGH) haute densité génome peut être appliquée pour efficacement détecter et caractériser les variations numéros copie (CNV) chez les mutants dérivés de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans Medicago truncatula, une espèce de légumineuse. Le séquençage du génome entier montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes ou modèles de gènes chez le M. truncatula. À présents, induite par le FNB mutants chez le M. truncatula proviennent de plus de 150 000 lignes M1, ce qui représente de précieuses ressources génétiques pour l’étude fonctionnelle de gènes dans le génome. La plate-forme aCGH décrite ici est un outil efficace pour la caractérisation des mutants induite par le FNB chez le M. truncatula.

Introduction

Légumineuses (Fabaceae) sont la troisième plus grande famille de plantes dicotylédones, avec de nombreuses espèces économiquement importantes telles que le soja (Glycine max) et de la luzerne (Medicago sativa). Plantes légumineuses peuvent interagir avec les bactéries du sol fixatrices d’azote, généralement appelées Rhizobia pour développer des nodules racinaires où le diazote atmosphérique est réduit à l’ammoniaque pour utilisation par la plante-hôte. Ainsi, la culture des légumineuses nécessite peu d’apport d’engrais azotés et contribue ainsi à une agriculture durable. Les cultures de légumineuses produisent des feuilles et les gr....

Protocol

Remarque : la Figure 1 illustre les cinq étapes pour le tableau protocole CGH. Ils sont : 1) préparation du matériel végétal ; 2) isolation haute qualité d’échantillons d’ADN ; Labeling 3) et la purification des échantillons d’ADN ; 4) hybridation, lavage et balayage des tableaux du génome entier ; et 5) analyse de données HGC. Tableaux de carrelage pour le génome entier M. truncatula contiennent un total de 971 041 sondes oligo unique ciblant plus de 50 000 gènes ou modèles de gène dans le génome (voir le tableau des matériaux). Les sondes uniques sont espacées approximativement chaque 150 paires de bases (bp)....

Results

La figure 2 montre la répartition des ratios₂ journal normalisée du mutant contre WT signaux au sein du génome entier. Analyse des données CGH a révélé une approximation annoté de 22KO délétion sur le chromosome 4 qui englobe l' ensemble du gène SUNN ³³ et plusieurs autres gènes chez le mutant FN6191 (Figure 2, Figure 3). La région candidate portait 73 sond.......

Discussion

Nous avons développé une plate-forme CGH array pour la détection et la caractérisation du bombardement de neutrons rapides (FNB)-induite des mutants chez M. truncatula CV Jemalong A17. Pour illustrer l’utilisation du tableau méthode CGH dans la détection des mutations du gène, nous avons réalisé aCGH analyse du mutant FN6191, qui présentaient un phénotype hyper nodulation contrairement aux plantes de type sauvage, lorsqu’ils sont inoculés avec S. meliloti Sm1021. Pour l’analyse de la segmentation, un se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula réseau génomique, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant)	Maison	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (référence)	Maison	A17
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
Spectrophotomètre Nanodrop	Thermo Scientific	1000D
SureTag Kit de marquage ADN	Agilent	5190-3400
Amorce aléatoire	Agilent	5190-3399
Acétonitrile	Sigma-Aldrich	271004-1L
Thermocycleur	MJ research	PTC-200
Centrifugeuse	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Solution de stabilisation et de séchage	Agilent	5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit d’hybridation	Agilent	5188-5380
Lames d’étanchéité de la chambre d’hybridation	Agilent	G2505
Human Cot-1 DNA	Agilent	5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 et 2	Agilent	5188-5221
Chambre d’hybridation, acier inoxydable	Agilent	G2534A
Four d’hybridation	Agilent	G2545A
Colonnes de purification	Agilent	5190-3391
Scanner laser	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Carte	des signaux 5225035001
1.9	Roche Nimblegen	Signalmap1.9