Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Résumé

Ce protocole décrit les différentes techniques nécessaires à la microscopie électronique en transmission dont une coloration négative, coupes ultraminces pour structure détaillée et l’immuno-or étiquetage afin de déterminer les positions des protéines spécifiques dans les exosomes.

Résumé

Exosomes sont de taille nanométrique des vésicules extracellulaires sécrétées par les fluides corporels et sont connus pour représenter les caractéristiques des cellules qui sécrètent les. Le contenu et la morphologie des vésicules sécrétées reflètent le comportement cellulaire ou l’état physiologique, par exemple la croissance cellulaire, migration, clivage et la mort. Rôle des exosomes peut dépendre fortement de taille, et la taille des exosomes varie de 30 à 300 nm. La méthode la plus utilisée pour l’imagerie de l’exosome est une coloration négative, tandis que les autres résultats sont basés sur la microscopie à Force atomique, microscopie électronique à balayage et Cryo-microscopie électronique. Morphologie de l’exosome typique évaluée au moyen d’une coloration négative est une forme de coupe, mais davantage de détails ne sont pas encore claires. L’exosome bien caractérisée par l’étude structurelle est nécessaire notamment dans le domaine médical et pharmaceutique. Par conséquent, morphologie fonction dépendant doit être vérifiée par des techniques de microscopie électronique tels que l’étiquetage d’une protéine spécifique dans la structure détaillée de l’exosome. Pour observer la structure détaillée, images coupes ultraminces et images colorées négatives des exosomes ont été comparés. Dans ce protocole, nous vous suggérons de microscopie électronique à transmission pour l’imagerie des exosomes dont une coloration négative toute monture immunomarquage, préparation de bloc, lame mince et étiquetage immuno-or.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules de bicouche lipidique sécrétées par les cellules, et leur taille varie entre 30 et 300 nm. EVs ont été pour la première fois en 1978, avec preuve de vésicules des patients atteints de maladie de Hodgkin¹. Ces vésicules ont été signalés à être 40 à 120 nanomètres dans la taille. En 1980, il a été signalé que les EVs sont impliqués dans le système de coagulation et de la thrombose, la formation d’un caillot de sang à l’intérieur d’un vaisseau sanguin dans le cancer patients². Après 30 ans, les EVs ont été signalés à être un facteur important pour promouvoir l’invasion....

Protocole

1. bloc préparation, coupes, coloration et d’imagerie de l’Exosome

1. Pellet les exosomes de surnageant de culture de cellules HCT116 par centrifugation à 100 000 x g pendant 1,5 h²³. Retirer le surnageant de culture et de Difficulté soigneusement le culot de l’exosome purifié avec 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % en solution de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,0) pendant 1 h à 4 ° C. Pour cacodylate de sodium 0,1 M, dissoudre 4,28 g d’acide cacodylique dans 160 mL d’eau distillée (DW). Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 M HCl puis faire jusqu'à 200 mL d’eau distillée.
2. Retirez le fixateur et rincez les boulettes avec 1 mL de tampon d....

Résultats

Actuellement, les exosomes sont classées en catégories de taille et la forme par microscopie électronique à transmission. La figure 2 illustre négatifs colorés exosome et immunitaire marqué exosome support entier du statut. La figure 3 montre l’exosome sectionné et immuno-étiqueté exosomes après lamélisation mince. Immuno-or en utilisant des anticorps des protéines spécifiques de coloration est utilisée pour identifier un exosome.......

Discussion

Cet article présente un protocole pour observer la structure de l’exosome détaillée et le marquage de ses protéines spécifiques. Une coloration négative a été considérée comme la meilleure méthode pour exosome d’imagerie¹⁷. Cette technique classique a montré la structure en forme de tasse des exosomes. Cependant, cette forme de coupe est une forme d’artefact qui peut se produire en raison du processus de séchage. Résultats de la Cryo-TEM ont montré que les exosomes ont une structure parfaitement s.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glutaraldéhyde	EMS	16200
Cacodylate de sodium  ;	EMS	12300
Tétroxyde d’osmium 1 g cristal	EMS	19100	Utilisation uniquement dans la hotte
acétone	JUNSEI	1B2031
Spurr medium	TED PELLA	18108
Ultra-microtome	Leica	UCT
Acétate d’uranyle	EMS	22400	Produit chimique dangereux
Citrate de plomb	EMS	17900
Microscopie électronique à transmission	Hitachi	H7600
de nickel	EMS	G200-Ni
Grille de cuivre	EMS	G200-Cu
glycine	SIGMA	022K5404
Tampon phosphate salin	SIGMA	P4417
Albumine sérique bovine	Aurion	25557
1ère			en manuel  ;
Anticorps anti-humain CD274 purifié (B7-H1,-L1)	BioLegend	329710	Monture entière Immumogold
Souris purifiée IgG2b, &kappa ; Isotype Ctrl	BioLegend	401202	Monture entière Immumogold (Contrôle)
2ème Anti-souris igG conjugué 9-11 nm particule d’or	sigma	G7652
Microscopie électronique à transmission	JEOL	JEM2200FS
Déchargeur de lueur	JEOL	JFC1100E
Grille carbone	EMS	121119
Paraformaldéhyde	EMS	19210
Formvar Grille en Cuivre Carbone (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Formvar Revêtement Carbone  ; Grille en nickel (200 mesh)	EMS	FCF200-NI

grille purification d’anticorps