Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.
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Article de méthode
Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’obésité maternelle est associée à un risque accru de complications périnatales qui sont vraisemblablement médiés par compromis fonction placentaire qui peut être attribuée, en partie, le dérèglement de l’autophagie. Aberrants changements dans l’expression des régulateurs de l’autophagie dans le placenta de grossesses obèses pourraient être régulés par des processus inflammatoires associées à l’obésité et la grossesse. Décrit ici est un protocole d’échantillonnage du tissu villeux et isolement des villeux cytotrophoblastes du placenta humain à terme pour culture de cellules primaires. Elle est suivie d’une méthode pour simuler le milieu inflammatoire dans l’environnement intra-utérin obèse en traitant les trophoblastes primaires de grossesses maigres avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), une cytokine pro-inflammatoire qui est élevé dans l’obésité, en grossesse. En mettant en œuvre le protocole décrit ici, il est constaté que l’exposition à exogène TNFα régule l’expression de Rubicon, un régulateur négatif de l’autophagie, trophoblastes de grossesses maigres avec des foetus féminins. Alors que divers facteurs biologiques dans l’environnement intra-utérin obèse maintenir la possibilité de moduler les voies critiques trophoblastes, ce système ex vivo est particulièrement utile pour déterminer si l’expression patterns observée in vivo dans des placentas humains souffrant d’obésité maternelle sont une conséquence directe de la signalisation de TNFα. En fin de compte, cette approche permet d’analyser les implications réglementaires et moléculaires de l’inflammation associées à l’obésité maternelle sur autophagie et autres voies cellulaires critiques dans les trophoblastes qui ont le potentiel d’influencer fonction placentaire.
Introduction
L’obésité est un état inflammatoire caractérisé par une inflammation chronique bas grade, découlant de l’excès de tissu adipeux et la disponibilité des nutriments. Dans l’obésité, cytokines pro-inflammatoires sont élevées dans les tissus métaboliques ainsi que systémique en circulation. Un corps robuste de la preuve a démontré que TNFα est significativement élevée dans le cadre de l’obésité avec des implications dans la résistance à l’insuline et le dysfonctionnement métabolique1. Activation du TNFα contribue également à la pathogenèse de la maladie dans des conditions telles que le cancer et l’auto-immunité, ce qui en fait une cible thérapeuti....
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Protocole
placenta ont été prélevé dans le travail et l’unité de prestation à l’hôpital universitaire en vertu d’un protocole approuvé par les institutionnels Review Board of Oregon Health Science University, Portland, Oregon, avec le consentement éclairé de la les patients.
1. collection de tissu placentaire
- préparation
Remarque : tout l’équipement qui rencontre le tissu doit être stérile.- Stériliser le matériel de dissection à l’autoclave pendant 60 min à 121 ° C.
- Utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) : lab coats/robes/scrubs, gants et masque avec une visière ou des lunettes.
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Résultats
Terme des placentas humains de maigre (indice de masse corporelle de pré-grossesse (IMC) < 25) mères avec des grossesses sans complication transportant des femelles ont été recueillies et échantillonnées dans les 15 minutes de l’accouchement par césarienne (aucun travail). Les placentas ont été examinés pour l’absence de calcification et de développement typique : pesant entre 300-600 g avec le cordon ombilical et les membranes enlevés, ronde en forme, entre 15 et 25 cm de diamètre et .......
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Discussion
Le placenta, responsable de la régulation de la croissance du fœtus, pièces fonction fragilisée dans l' environnement obèses6. Malgré la forte demande métabolique des trophoblastes, placentas avec l’obésité maternelle pièce dysfonctionnelle de la respiration mitochondriale6,19. Changements dans le métabolisme placentaire peuvent contribuer à l’augmentation de l’incidence des complications et des complications foetales observées chez les ob.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient les femmes qui ont fait don de leur placenta pour cette étude. Nous remercions également le travail et le service de livraison au OHSU et la maternelle et fœtale recherche équipe pour coordonner la collecte des placentas. Nous sommes reconnaissants à Eric Wang, Ph.d. et Kelly Kuo, MD pour la prise en charge et aider avec les méthodes expérimentales et optimisation.
Ce travail a été financé par le NIH HD076259A (AM) et AHA GRNT29960007 (AM).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (analysant) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsine | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | ||
| Inhibiteurs de la protéase/phosphatase | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Désoxycholate de sodium. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove' s Dulbecco modifié' s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Sérum de veau néonatal (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Pénicilline/Streptomycine (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10 % Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNF et alpha ; | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA tubes de prélèvement sanguin Vacutainer | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| plaques de puits | Corning | ||
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2,0 mL, naturel | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-CL | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Kit d’acrylamide, 12 % | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Chambre Multi-Casting | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Tampon d’échantillon | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Lait écrémé instantané en poudre | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Technologie | de signalisation cellulaire | 8465S | |
| Anticorps monoclonal anti-&bêta ;-actine produit chez la souris | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| IgG anti-lapin, Anticorps liés à la HRP | Technologie de signalisation cellulaire | 7074S | |
| IgG anti-souris, Anticorps | liés à la HRPTechnologie de signalisation cellulaire | 7076S | |
| Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico PLUS Thermo | Scientific | 34578 |
Références
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M.
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Réimpressions et autorisations
