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Article de méthode

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

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DOI :

10.3791/56508

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6 février 2018

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1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

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Résumé

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Résumé

Anticorps monoclonaux (ACM) sont de puissants outils utiles pour les deux la recherche fondamentale et en biomédecine. Leur spécificité élevée est indispensable lorsque l’anticorps doit faire la distinction entre les structures fortement connexes (p. ex., une protéine normale et une version mutée de celle-ci). La façon actuelle de générer ces mAbs discriminatif implique une vaste sélection de multiples cellules productrices de Ab B, qui est coûteux et fastidieux. Nous vous proposons ici une méthode rapide et rentable pour la génération de discriminatoire, mAbs entièrement humain à partir de sang humain, les lymphocytes B circulants. L’originalité de cette stratégie est due à la sélection des cellules de liaison B antigène spécifique combinée à la Counter-sélection de toutes les autres cellules, à l’aide de facilement disponible Peripheral Blood mononucléaires cellules (PBMC). Une fois que les cellules B spécifiques sont isolés, cDNA (l’acide désoxyribonucléique complémentaire) séquences codant pour le mAb correspondant sont obtenus utilisant la technologie de cellule unique Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) et par la suite exprimé en homme cellules. Dans aussi peu que 1 mois, il est possible de produire des milligrammes de hautement discriminatoires mAbs humain dirigé contre pratiquement n’importe quel antigène désiré naturellement détectée par le répertoire des cellules B.

Introduction

La méthode décrite ici permet la production rapide et versatile de pleinement humains anticorps monoclonaux (ACM) contre un antigène désiré (Ag). mAbs sont des outils essentiels dans beaucoup de demandes de recherche fondamentale in vitro et in vivo: flow cytometry, histologie, expériences western-blot et blocage par exemple. En outre, mAbs sont utilisés plus en médecine pour traiter les maladies auto-immunes, cancer et de contrôler le rejet de greffe1. Par exemple, ACM anti-CTLA-4 et anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) ont été récemment utilisés comme inhibiteurs de point de contrôle immunitaire cancer traitements2.

Le mAbs première ont été produit par les immunoglobulines (Ig)-sécrétant des hybridomes obtenus des cellules spléniques de souris immunisées ou de rats. Cependant, la forte réponse immunitaire contre ACM murin ou rat entrave leur utilisation thérapeutique chez l’humain, en raison de leur apurement rapide et l’induction probable d’hypersensibilité réactions3. Pour résoudre ce problème, des séquences de protéines animales du mAbs ont été partiellement remplacées par humain pour produire ce qu’on appelle anticorps chimériques de souris-humain ou humanisés. Toutefois, cette stratégie ne diminue que partiellement immunogénicité, tout en augmentant considérablement le coût et les délais de production. Une meilleure solution consiste à générer le mAbs humaine directement à partir de cellules B humaines et il existe plusieurs stratégies pour cela. L’un d’eux est l’utilisation de l’affichage bactériophage ou de la levure. Cela implique l’affichage variables domaines auprès d’une bibliothèque combinatoire d’aléatoire Ig humaine lourde et des chaînes de lumière sur les phages ou levures et effectuer une étape de sélection à l’aide de l’antigène spécifique d’intérêt. Un inconvénient majeur de cette stratégie est que les chaînes lourdes et légères sont aléatoirement associés, conduisant à une augmentation très importante de la diversité des anticorps générés. Les anticorps obtenus ne devraient pas correspondent à celles qu’induirait une réponse immunitaire naturelle contre une Ag particulier. En outre, le repliement des protéines humaines et modifications post-traductionnelles ne sont pas systématiquement reproduites chez les procaryotes ou même chez les levures. Une deuxième méthode de production de mAb humaine est l’immortalisation des cellules B humaines naturelles, par infection à virus Epstein - Barr ou expression des facteurs anti-apoptotique BCL-6 et BCL-XL4. Toutefois, cette méthode est applicable uniquement aux cellules B mémoire et est inefficace, exigeant que le dépistage des nombreux mAb immortalisées B cellules productrices d’identifier les clones mAb peu (ou pas) avec la spécificité antigénique désirée. La méthode est donc coûteuses et chronophages.

Un nouveau protocole a été décrite récemment pour la production du mAbs humaine de simple isolé de cellules B5. Elle s’appuie sur une optimisée unicellulaires Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour l’amplification des deux la lourds - et chaînes légères encodage des segments d’une seule cellule B triée. Il est suivi par le clonage et l’expression de ces segments dans un système d’expression eucaryote, permettant ainsi la reconstitution d’un mAb pleinement humain. Ce protocole a été utilisé avec succès à partir de cellules de B de donneurs vaccinés. Les cellules ont été récoltées plusieurs semaines après la vaccination pour obtenir des fréquences plus élevées des lymphocytes B dirigés contre le Ag souhaitée et de limiter ainsi le temps nécessaire pour le dépistage de6. Autres mAbs pleinement humaines ont également été produites de patients7 et mélanome les patients infectés par le VIH+ (Virus de l’immunodéficience humaine)8. Malgré ces avancées, toujours aucune procédure n’est disponible que permet l’isolement Ag spécifiques de cellules de B indépendamment de leur phénotype mémoire ou la fréquence.

La procédure décrite ici conduit à l’isolement efficace ex vivo de cellules B circulantes humaines fondée sur leur spécificité BCR, suivie par la production de pleinement humain mAbs antigène-spécifiques dans le rendement élevé et avec un temps de projection basse. La méthode ne se limite pas aux cellules B mémoire ou les cellules B sécrétant des anticorps induits après une immuno-réaction, mais peut également être appliquée pour le répertoire de cellules B naïves humaines. Qu’il fonctionne même à partir de cellules de B Ag spécifiques présents à très basses fréquences est une bonne indication de son efficacité. Le principe de la méthode est la suivante : les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont colorées avec deux tétramères présentant l’antigène d’intérêt, chacun marqué avec un fluorochrome différent (p. ex., phycoérythrine (PE) et Allophycocyanin (APC)), et un troisième tétramère présentant un antigène étroitement apparenté conjugué avec un fluorochrome tiers (p. ex., Brillant Violet 421 (BV421)). Pour enrichir pour cellules de liaison de l’antigène, les cellules sont ensuite incubées avec perles recouvertes d’anti-PE et Abs anti-APC et triés dans les colonnes de séparation cellulaire. La fraction de cellules APC PE+ + est sélectionnée, colorées avec une variété de mAbs spécifiques pour différents types de cellules PBMC permettre l’identification des cellules B et soumis à l’écoulement cytometry cellule Tri. Les lymphocytes B qui sont PE+ et APC+, mais brillant Violet-, sont isolés. Cette étape sélectionne dans les cellules qui ne sont pas des cellules B ou ne se lient pas à l’antigène tétramères, mais faire un bind PE ou APC (ces cellules sera PE+ – d’APC ou PE– APC+) ou à la partie non-antigène des tétramères utilisé (ces les cellules seront BV421+). Cellules B pas très spécifiques pour l’épitope d’intérêt sont également Counter-sélectionnés à cette étape (ces cellules seront également BV421+). Ainsi, cette méthode peut purifier hautement spécifique B cellules exprimant des récepteurs de B-cellule (RCO) capables de distinguer les deux antigènes très étroitement apparentées. Des cellules de B spécifiques uniques sont recueillis dans des tubes et leurs ADNc amplifié par PCR Ig (complémentaires acides désoxyribonucléiques) cloné et exprimé par une lignée cellulaire humaine comme sécrétées IgG mAbs.

Comme une preuve de concept, cette étude décrit la génération efficace du mAbs humaine, qui reconnaît un peptide présenté par une classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-je) molécule et peut distinguer ce peptide et d’autres peptides chargés sur le même MHC-j’ai allèle. Même si le niveau de complexité de cette Ag est important, cette méthode (i) permet la récupération de rendement élevé du mAbs Ag spécifiques ; (ii) la production du mAbs capables de distinguer deux Ags structurellement proches. Cette approche peut être étendue aux patients vaccinés ou infectés sans aucune modification du protocole et a également déjà été implémentée avec succès dans un système de rat humanisé9. Ainsi, cette étude décrit une approche polyvalente et efficace pour générer des mAbs entièrement humains qui peut être utilisés en immunothérapie et de la recherche fondamentale.

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Protocole

Tous les échantillons de sang périphérique humain proviennent de donneurs adultes anonymes après consentement éclairé, selon le Comité d’éthique local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procédure PLER NTS-2016-08).

1. isolement des cellules mononucléaires de sang périphérique humain

Remarque : Matériel de départ peut être du sang périphérique humain total ou échantillons de cytaphérèse. Échantillons ne soient pas plus de 8 h et complétée avec des anticoagulants (par exemple, héparine).

  1. Diluer le sang et 2 volumes (sang périphérique humain) ou 5 volumes (échantillon de cytaphérèse) du milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Soigneusement la couche 35 mL de suspension cellulaire dilué sur 15 mL de milieu de gradient de densité dans un tube conique de 50 mL. Faire des tubes autant que nécessaire pour distribuer tout le sang dilué. Centrifuger à 1 290 x g pendant 25 min à température ambiante dans un rotor oscillant-seau avec frein.
  3. Aspirer la couche de cellules mononucléées à l’interface entre le milieu de gradient de densité et de la couche de plasma avec précaution et les cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  4. Remplir le tube avec milieu RPMI, mélanger et centrifuger à 1 290 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant.
  5. Resuspendre le culot dans 20 mL de milieu RPMI et centrifuger à 200 x g pendant 10 min enlever les plaquettes. Retirer délicatement le surnageant. Répétez cette opération une fois.
  6. Resuspendre le culot dans un milieu RPMI avec 10 % sérum bovin fœtal (SVF).
    Remarque : Passez directement a l’étiquetage tétramère ou maintenir les cellules à 4 ° C durant la nuit à une concentration de 107 cellules/mL.

2. tétramère associées à l’enrichissement magnétique des lymphocytes B spécifiques Ag

  1. Préparer, Ag-tétramères en ajoutant soit PE ou APC-étiqueté premium grade streptavidine ou streptavidine marquée BV421 à un rapport molaire de 1:4 aux monomères d’antigène biotinylé. Ajouter la quantité appropriée de conjugué streptavidine-en trois parties distinctes, ajoutant une aliquote de chaque 10 min à température ambiante.
  2. Distribuer des cellules (jusqu'à 3 x 108 par tube) dans les tubes coniques 15 mL et centrifuger à 460 x g pendant 5 min.
    Remarque : Le protocole suivant est pour un seul tube.
  3. Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS (Phosphate Buffered Saline) avec 2 % FBS. Ajouter PE - APC- et BV421-conjugués tétramères, chacun à une concentration finale de 10 µg/mL. Bien mélanger et laisser incuber 30 min à température ambiante.
  4. Préparer le tampon de séparation cellule glacée (SB) à l’aide de PBS avec 0,5 % de BSA (albumine sérique Bovine) et EDTA (acide éthylènediamine tétra-acétique) 2 mM.
  5. Ajouter 10 mL de cellules SB. Pellet par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
  6. Remettre en suspension les cellules de 500 µL glacee SB. Ajouter 50 µL d’anti-PE et 50 µL de microbilles magnétiques anti-APC.
  7. Bien mélanger et laisser incuber 20 min à 4 ° C.
  8. Répétez l’étape 2.5 deux fois.
  9. Éliminer le liquide surnageant avec soin andresuspend le culot cellulaire à une concentration de 2 x 108 cellules/mL dans la glace froide SB.
  10. Equilibrer une longue colonne magnétique placée sur un aimant avec 3 mL de SB.
  11. Transfert en suspension cellulaire de 2,9 sur la partie supérieure de la colonne équilibrée et laissez-le s’égoutter complètement. ÉTAPE critique : Pour éviter les grumeaux de la colonne, passent des cellules par une maille en nylon de 70 µm.
  12. Rincer le tube qui contient les cellules avec 3 mL de glace froide SB et transférer le tampon directement sur la colonne (dans le cas d’une filtration, rinçage des 70 µm en nylon mesh).
  13. Lorsque le tampon est complètement vidangé dans la colonne, ajouter un autre 3 mL de SB froid de glace à la colonne.
  14. Répétez l’étape 2.13 pour un autre lavage de 3 mL.
  15. Supprimez la colonne de l’aimant et le déposer sur un tube collecteur conique de 15 mL.
  16. Ajouter 5 mL de glace froide SB sur le dessus de la colonne et rincer les cellules de la colonne à l’aide du piston. Répétez cette opération une fois.
  17. Centrifuger les cellules recueillies (fraction de cellules positives enrichi tétramère pertinentes) à 460 x g pendant 5 min et procéder à la coloration des anticorps supplémentaires.
    NOTE : Piscine recueilli les cellules de tous les tubes, le cas échéant.

3. la coloration des cellules B humaines Ag spécifiques et le tri des cellules

  1. Resuspendre le culot cellulaire avec un cocktail d’anticorps anti-humains CD3 (dilution finale : 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50) et 7AAD (1 : 1000) dans un volume final de 100 µL de PBS contenant 2 % FBS. Incuber 30 min à 4 ° C.
  2. Ajouter 10 mL de PBS aux cellules, centrifuger à 460 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Répétez cette opération une fois. Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS, filtre sur les mailles de nylon 70 µm.
  3. Passez à trier des cellules B spécifiques au niveau de la cellule unique sur un cytomètre de trieur de cellules avec une buse 100 µm et une pression de 20 lb/po2 sans dépasser 1 000 événements/s9.
    Remarque : La stratégie de blocage utilisée est illustrée à la Figure 1. Cellules ont été tout d’abord bloquées sur CD14–CD16 7AAD–– cellules d’exclure des monocytes, NK et les cellules mortes (non illustrés dans la Figure 1). Puis CD19+ B cellules ont été sélectionnés avant déclenchement sur doubles cellules colorées par PE et APC pertinentes Ag-tétramères. Cellules B non spécifiques ont été exclues par blocage sur BV421 les cellules négatives (non souillées enregistrés par Ag-tétramère non pertinent).
  4. Prélever des cellules de B unique dans 8-bande PCR tubes précédemment rempli de 10 µL de solution 1 PBS x et 10 unités d’inhibiteur de RNAse et placés sur une étagère pour 96 microtubes. Geler immédiatement les tubes PCR à-80 ° C.
    Remarque : Les masques de tri choisis sur l’instrument cytomètre sont masque de rendement : 0, masque pureté : 32 et masque de phase : 0. ce dépôt de cellule unique pourrait être ajusté à une plaque PCR 96 ou 384 puits si nécessaire. Cellules B doivent être gelés aussi rapidement que possible et peuvent être laissés à-80 ° C pendant plusieurs semaines, si nécessaire.

4. cellule RT-PCR

  1. Lyse des cellules en chauffant directement les échantillons congelés dans les bandes PCR à 70 ° C pendant 5 min dans un bain sec.
  2. Transfert de bandes pour glace et procéder à la transcription (RT) inverse en ajoutant 10 µL par tube de 2 x mélange principal tampon contenant 1 mM dNTP, amorces de oligod(T) 25 µg/mL, 5 µM aléatoire hexamères, 20 unités d’inhibiteur de RNAse et 400 unités de la transcriptase inverse.
    Remarque : Après la cellule de décongélation, RT doit être effectuée rapidement afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
  3. Incuber à 25 ° C pendant 5 min permettre au hasard hexamères à hybrider, puis incuber pendant 1 heure à 50 ° C et terminer par une incubation à 95 ° C pendant 3 min arrêter la réaction.
  4. Procéder à deux séries de l’amplification par PCR imbriquée pour chacune des régions codant pour la variable lourde (vH) et kappa (vLκ) ou chaînes légères lambda (vLλ).
    NOTE : Sinon, RT échantillons peuvent être congelés à-20 ° C et gardés pendant une semaine.
    1. Pour le premier tour de la PCR, ajouter 3 µL d’ADNc pour un volume final de 40 µL contenant 1,5 mM MgCl2dNTPs 0,25 mM, 2,5 unités de l’ADN polymérase et 200 nM d’amorces externes (voir la Figure 2 et Tableau des matières pour les séquences d’amorces).
      NOTE : Composition du mélange amorces externe. Pour l’amplification de la chaîne lourde : 4 avant amorces (HVG mix 5') et 2 marche arrière amorces (3' CµCγ mix). Pour l’amplification de chaîne légère kappa, 3 vers l’avant des amorces (5' LV | mix) et 1 marche arrière amorce (3' Cκ543-566). Pour l’amplification de chaîne légère lambda, 7 avant amorces (mélange de LVl 5') et 1 marche arrière amorce (3' Cl).
      NOTE : Les amorces ont été conçus par motoculteur et coll. pour l’amplification de tous les gènes de la famille des chaînes lourdes et légères5.
    2. Appliquer les conditions suivantes de cyclisme : 94 ° C pendant 4 min, suivie de 40 cycles de 30 s à 94 ° C, 30 s à 58 ° C pour VH VLκ (60 ° C pour les VLλ) et 55 s à 72 ° C, avec une élongation finale étape à 72 ° C pendant 7 min.
    3. Pour la deuxième ronde PCR, utiliser 3 µL du premier produit d’amplification pour un volume final de 40 µL contenant 1,5 mM MgCl2dNTPs 0,25 mM, 2,5 unités de l’ADN polymérase et 200 nM d’amorces internes contenant des enzymes de restriction des sites pour le clonage dans l’expression vecteurs (voir la Figure 2 et Tableau des matières pour les séquences d’amorces).
      NOTE : Composition du mélange amorces internes. Pour l’amplification de la chaîne lourde : 9 avance amorces (mélange de AgeIVH de 5') et 3 retour amorces (3' SalIJH mix). Pour l’amplification de chaîne légère kappa, 9 en avant des amorces (5' AgeIV | mélanger) et 3 marches arrière amorces (3' BsiWIJκ mix). Pour l’amplification de chaîne légère lambda, 6 avant amorces (mélange de AgeIVl de 5') et 1 marche arrière amorce (3' XhoICl).
      NOTE : Amorces ont été conçus par motoculteur et al., pour l’amplification de l’ensemble de la chaîne lourde et légère gènes de la famille5.
    4. Appliquer les conditions suivantes de cyclisme : 94 ° C pendant 4 min, suivie de 40 cycles de 30 s à 94° C, 30 s à 58 ° C pour VH et LCκ (60 ° C pour LCλ) et 45 s à 72 ° C avec une élongation finale étape à 72 ° C pendant 7 min.
  5. Identifier les puits positifs en migration 5 μL des produits PCR de vH, vLκ et vLλ sur un gel d’agarose de 1,5 % (500 produits de bp pour les segments encodage variable chaîne lourde) et un produit bp 350 pour la variable chaîne légère segments d’encodage.
  6. Purifier les produits PCR 35 restants de µL restants de puits positifs à l’aide de membranes d’ultrafiltration conçues pour la purification de produits PCR.
  7. Éluer les produits PCR avec 60 µL d’H2O.

5. expression clonage

  1. Préparer des Inserts
    NOTE : Digérer 60 µL de chaque PCR purifié produit dans un volume final de 100 µL contenant le tampon de l’enzyme de restriction appropriées.
    1. Pour les produits PCR vH, ajouter 50 unités de AgeI et 50 unités de SalI et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    2. Pour vLλ les produits PCR, ajouter 50 unités de AgeI et 50 unités de XhoI et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    3. Pour vLκ les produits PCR, ajouter 50 unités de AgeI et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Purifier les produits de digestion à l’aide de membranes PCR 96 et éluer avec 60 µL d’H2O. Digest éluat 60 µL dans un volume final de 100 µL de tampon d’enzyme de restriction BsiWI, ajouter 50 unités de BsiWI et incuber pendant 1 heure à 55 ° C.
    4. Inactiver les enzymes par chauffage à 80 ° C pendant 15 min.
  2. Préparation d’exprimer les vecteurs
    Remarque : les amplicons vH sont clonés dans un vecteur d’expression contenant la chaîne lourde de la constante Cγ1 de IgG1 (HCγ1). vLκ produits PCR sont clonés dans un vecteur d’expression contenant la chaîne légère constante Cκ (LCκ). vLλ produits PCR sont clonés dans un vecteur d’expression contenant la chaîne légère constante Cλ (LCλ).
    1. Effectuez les digestions suivantes :
      1. Mélanger 1 µg d’expression vector HCγ1 avec 10 unités de AgeI et 10 des endonucléases SalI dans un volume total de 20 µL de tampon de restriction recommandée par le fabricant et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
      2. Mélanger 1 µg de vecteur d’expression LCκ avec 10 unités d’enzyme de restriction AgeI dans un volume total de 20 µL de tampon de restriction recommandée par le fabricant et incuber pendant 1 heure à 37° C. Ajouter 10 unités d’enzyme de restriction BsiWI et incuber pendant 1 heure à 55 ° C.
      3. Mélanger 1 µg de vecteur d’expression LCλ avec 10 unités de AgeI et 10 des endonucléases XhoI dans un volume total de 20 µL de tampon de restriction recommandée par le fabricant et incuber pendant 1 heure à 37 ° C
    2. Faire chauffer chaque mélange de digestion à 65 ° C pendant 10 min inactiver les enzymes de restriction.
    3. Effectuer la ligature de 5 µL du produit PCR digéré avec 2 µL (100 ng) du vecteur d’expression linéarisé correspondante dans un volume total de 20 µL de 1 x tampon de DNA ligase avec 1 unité de T4 ADN-Ligase par incubation pendant une nuit à 4 ° C.
      NOTE : Vous pouvez également la ligature est effectuée pendant 3 h à 4° C.
  3. Le clonage
    1. Oligonucléotides 1 µL du mélange ligature 20 µL dans 45 µL de maison electrocompetent TOP10 e. coli (protocoles actuels en biologie moléculaire, section 1.8.4-1.8.8). Immédiatement ajouter 500 µL de milieu de YT X 2 et incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min. bactéries propagation transformée sur 2 x plaques ampicilline YT. Incuber une nuit à 37 ° C.
    2. Pour chaque transformation, écran huit colonies par PCR.
      1. Mettre en place un prémélange de réaction comme suit sur la glace : 45 µL de 5 x 12 µL de MgCl2 (25 mM), 4 µL des dNTPs (à partir d’un stock contenant 10 mM chacun), tampon PCR, 10 µL d’apprêt avant (stock de 10 µM) s’hybridant à la séquence de vecteur (amorce sens Ab-vec) et 10 µL d’apprêt inverse (stock de 10 µM) visant la région constante de chaîne lourde ou légère (voir Table des matières pour les séquences d’amorces). Maquillage pour un volume final de 200 µL avec H2O. Puis ajouter 4 µL d’enzyme ADN polymérase (5 U/µL).
      2. Distribuer 25 µL de prémélange de réaction par tube PCR 8-bande sur la glace.
      3. Utiliser un cure-dent stérile pour ramasser des colonies individuelles. Ensemencer le cure-dents sur une plaque d’ampicilline 2 x TY à constituer une plaque répétée et puis trempez-le dans un tube de réaction PCR.
      4. Effectuer le dépistage PCR dans les conditions suivantes de cyclisme : 94 ° C pendant 10 min, suivie de 25 cycles de 30 s à 94 ° C, 30 s à 55 ° C et 50 s à 72 ° C.
      5. Identifier les bactéries grampositives de migration 5 µL des produits PCR sur un gel d’agarose de 1,5 %.
        NOTE : Colonies positifs donnent un produit PCR environ 850 bp pour le vecteur de la chaîne lourde et 600 bp pour le vecteur de la chaîne légère.
    3. Ensemencer des quatre colonies positives de la plaque de répliquer dans 2 mL de milieu LB et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    4. Extraire les plasmides des cultures liquides à l’aide d’un kit de purification de plasmide, tel qu’indiqué par le fabricant.
    5. Vérifier la pose adéquate des domaines variables par Sanger séquençage des plasmides avec l’amorce de l’Ab-vec-sens.
      NOTE : Plasmides avec l’insert correct (codant pour le HC et la LC correspondant) doivent être cotransfectés dans des cellules 293 a de sécrétion. La spécificité de petite échelle-produit mAbs est analysée par ELISA. Puis, la production à grande échelle est exécutée le cas échéant.

6. la production d’ACM

  1. Production à petite échelle pour le contrôle de la spécificité
    1. La veille de la transfection, rein embryonnaire humain de semences 15 000 293 a (HEK 293 a) cellules dans 200 µL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % FBS / puits dans les plaques à 96 puits. Incuber pendant la nuit dans un incubateur à CO2 (5 % CO2) à 37 ° C.
    2. Cotransfect 293 a cellules dans un milieu DMEM contenant 10 % BF utilisant un dérivé de polyéthylènimine linéaire comme réactif de transfection.
      Remarque : Effectuez la transfection dans réanalysés. Le protocole suivant est pour un puits d’une plaque de 96 puits de fond plat.
      1. Diluer 0,5 µL de réactif de transfection d’ADN en 10 µL de NaCl 150 mM. Diluer 0,125 µg de vH et 0,125 µg de vecteurs exprimant vL dans 10 µL de NaCl 150 mM. Vortex chaque dilution pour 10 s.
      2. Ajouter 10 µL dilué réactif de transfection d’ADN dans la solution d’ADN 10 µL. Vortex 15 s et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter le mélange de 20 µL goutte-à-goutte sur cellules 293 a et mélanger en agitant doucement la plaque.
    3. Remplacer le milieu 16 h après la transfection et cellules en culture pendant 5 jours dans un milieu sans sérum.
      NOTE : Utiliser un milieu sans sérum pour éviter sérum Igs contaminer les anticorps produits.
    4. Éliminer les cellules et les débris par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
    5. Récolter les surnageants par aspiration avec une pipette multicanaux et de les transférer dans une assiette à fond en V 96 puits.
    6. Manteau Ag pertinent durant la nuit à 4 ° C à 100 µL / puits de revêtement d’ELISA/ELISPOT reconstitué tampon 1 x à une concentration finale de 2 µg/mL en plaques ELISA 96 puits. Consultez les exemples dans 9.
    7. Puits de bloc avec milieu DMEM BF 10 % pendant 2 h à 37 ° C
    8. Ajouter 50 µL de surnageants de cellules transfectées 293 a partir de l’étape 6.1.5 et incuber pendant 2 h à température ambiante.
    9. Ajouter 100 µL d’une anti-humaine IgG Ab couplé à l’enzyme peroxydase de raifort (HRP) raifort à 1 µg/mL et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Ajoutez le substrat chromogénique de 50 µL (TMB) et incuber pendant 20 min.
    10. Lire la densité optique à 450 nm sur un spectrophotomètre.
      Remarque : Le mAbs spécifique révélé par l’analyse ELISA peut être également produit à grande échelle et purifié sur protéine une colonne présentant des affinités pour les IgG humaine.
  2. Production à grande échelle et la purification du mAbs spécifiques
    1. La veille de la transfection, rein embryonnaire humain de semences 6 x 106 293 a (HEK 293 a) des cellules dans des fioles de2 175 cm contenant 25 mL DMEM supplémenté de 10 % FBS. Incuber pendant la nuit dans un incubateur à CO2 (5 % CO2) à 37 ° C.
      Remarque : Les cellules doivent être anastomosé 70 % lorsque transfectées.
    2. Cotransfect 293 a cellules dans un milieu DMEM contenant 10 % BF utilisant un dérivé de polyéthylènimine linéaire comme réactif de transfection.
      1. Diluer 50 µL de réactif de transfection d’ADN en 450 µL de NaCl 150 mM. Diluer 10 µg de vH et 10 µg de vecteurs exprimant vL dans 500 µL de NaCl 150 mM. Vortex 10 s chaque dilution.
      2. Ajouter dilué réactif de transfection d’ADN à la solution d’ADN. Vortex 15 s et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter le mélange de 1 mL de titration aux cellules et mélanger en agitant doucement le flacon.
    3. Remplacer le milieu 16 h après la transfection et cellules en culture pendant 5 jours dans un milieu sans sérum.
    4. Moyen de récolte en aspirant avec une pipette 25 mL.
    5. Éliminer les cellules et les débris par centrifugation à 460 x g pendant 5 min.
    6. Purifier les anticorps en utilisant une colonne de 1 mL recouverte de protéine A un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide à 4 ° C.
      1. Equilibrer la protéine une colonne de Sépharose avec un tampon phosphate 20 mM (pH 7).
      2. Filtrer le milieu de culture cellulaire de 6.2.5 à l’aide d’un filtre de 1,22 m, puis un filtre de 0,45 µm.
      3. Charger le milieu filtré dans la colonne.
      4. Lavez avec un tampon phosphate 20 mM (pH 7) et éluer avec un tampon citrate de 0,1 M (pH 3,5).
      5. Lire les densités optiques à 280 nm sur un spectrophotomètre d’absorption et immédiatement neutraliser les fractions protéiques avec 1 M Tris tamponné (pH 9).
    7. Dialyser Ab purifié toute la nuit à 4 ° C dans une cassette avec un poids moléculaire de 3,5 K coupure contre tampon PBS (pH 7,4).
    8. Stériliser à 0,2 µm de filtration et contrôle de pureté par chromatographie d’exclusion stérique, telle qu’indiquée par le fabricant.

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Résultats

À partir de PBMC de donneurs sains, ce présente projet la génération du mAbs humaine, qui reconnaît le peptide Pp65495 (Pp65, du cytomégalovirus humain) présentés par la classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-I) molécule HLA - A * 0201 () HLA-A2). Ces mAbs peuvent distinguer entre ce complexe et complexes qui représentent les autres peptides chargés sur le même MHC-I molécule.

PBMC ont été colorées avec HL...

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Discussion

Le projet de protocole est une méthode puissante pour la production d’ACM humains directement à partir de cellules spécifiques Ag B circulant dans le sang. Il combine trois aspects importants : (i) l’utilisation d’un enrichissement magnétique tétramère-associés, qui permet une isolation ex vivo des cellules de B de liaison Ag même rares ; (ii) une stratégie de blocage qui utilise trois tétramères Ag (deux des plus pertinentes et un non pertinent) étiquetés avec trois fluorochromes différents d’isoler, par cytomé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la Cytometry Facility « CytoCell » (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) d’assistance technique d’experts. Nous remercions également tout le personnel de production de protéines recombinantes (P2R) et des plates-formes des IMPACT (INSERM 1232, Santé SFR, Biogenouest, Nantes) pour leur soutien technique. Nous remercions Emmanuel Scotet et Richard Breathnach pour des commentaires constructifs sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le projet IHU-Cesti, financé par le gouvernement Français « Investissements d’avenir », géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire. Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme IGO LabEX pris en charge par l’Agence nationale de la recherche par l’intermédiaire de l’investissement du futur programme ANR-11-LABX-0016-01.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lignée cellulaire HEK 293AThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco’s Modified Eagle MediumGibco by life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Albumine sérique bovine (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Phosphate Saline Tamponné (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (Ethylènediaminetétraacétique) 0,5M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
Sérum fœtal bovin (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - séparation des lymphocytes densité moyenneEuroBioCMSMSL01-011,0777+/-0,001
streptavidine R-phycoérythrine conjuguéeInvitrogen par Life TechnologiesS21388premiun grade 1mg/ml contient 5mM d’azoture de sodium
Streptavidine, allophycocyanine conjuguéeInvitrogen par thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM azide premium grade
Violet brillant 421 streptavidineBiolegend405225conc : 0,5mg/ml
Microbilles magnétiques conjuguées anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801
Microbilles magnétiques conjuguées anti-APCMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs ou QuadroMACS separotorMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
Colonnes LSMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Dilution usagée 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Dilution usagée 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Dilution usagée 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Dilution usagée 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Dilution d’occasion 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter CytometerBD Biosciences
Tubes PCR à 8 bandelettesAxygen321-10-061
Racks pour 96 microtubesDominique Dutscher45476
RNAseOUT Inhibiteur de la ribonucléase (recombinant)Invitrogen by thermoFisher scientific10777-019qté :5000U (40U/ul)
Eau distillée Dnase/Rnase FreeGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Hexamères aléatoiresInvitrogen par thermoFisher scientificN8080127qté : 50uM, 5nmoles
Superscript III Transcriptase inverseInvitrogen par thermoFisher scientific18080-044qté : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymérasePromegaM7805
dNTP Set, Biologie moléculaire gradeThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Capteurs avancés
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Capteurs avancés
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Amorces avancées
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces externes -Amorces inverses pour Ig- Bactéries Dépistage PCR
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces externes -Amorces inverses pour Ig humaines
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces avant
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTAGCTGTTGGAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes -Amorces avant
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes -Amorces directes
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
Deuxième		tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces avant
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGAGCTGCAGCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces inversées
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGAGACGGTGACCATTG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces inversées
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces inversées
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces extérieures -Amorces avant
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces extérieures -Amorces avant
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces extérieures -Amorces directes
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces externes -Amorces inverses- Dépistage PCR des bactéries
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant
5'AgeIVk1_9_1&ndash ; 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces intérieures -Amorces avant
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes -Amorces avant
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTGTTGACACAGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces intérieures -Amorces avant
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes -Amorces
avant 5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTGTTGACGCAGTCT		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces directes
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces directes
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes -Amorces avant
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces intérieures -Amorces avant
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Forward amorces
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces avant
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces avant
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères & lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes
3'ClEurofins CACCAGTGTCC
TTGTTGGCTTG		Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Forward amorces
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes -amorces avant
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes -amorces avant
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes -Amorces inverses - Dépistage PCR des bactéries
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Dépistage PCR des bactéries
QA Agarose-TM, Biologie moléculaire GradeMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlaqueMacherey Nagel743.100.100
Enzyme Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzyme SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzyme Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzyme BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (Numéro d’enregistrement Genbank FJ475055)
LCk (Numéro d’enregistrement Genbank FJ475056 )
LCl (Adhésion Genbank nombre FJ517647)
T4 ADN ligaseInvitrogen par thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT mediumSigma AldrichY1003-500ML
AmpicillineSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nucleospin Plasmid ADN, ARN et purification des protéinesMacherey Nagel740588.250
Jet PEI Réactif de transfection d’ADNPolyPlus101-40
Fond platPlaque à 96 puitsFalcon353072
Plaque à fond en V à 96 puitsNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm2 flaconsNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT tampon d’enrobageeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp fond plat 96 puits Plaques ELISANunc/Thermofisher44-2404-21liaison protéique
élevée IgG Ab anti-humain conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
Substrat TMBBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 mL-HiTrap protein A colonne HPGE Healthcare17-0402-01
Ä ; KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GL colonneGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus Système de chromatographieBioRad7880003

Références

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Étiquettes

Cellules mononucléées du sang périphériqueRT-PCR sur cellule uniquetri par cytométrie en fluxtétramères HLA-A2/Pp65séparation par microbilles magnétiquesdosage ELISArésonance plasmonique de surfaceamplification des gènes des immunoglobulines
Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang
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