Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Summary

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

Abstract

Étude sur les divers événements de régulation du cycle cellulaire en fonction de la phase fournit une compréhension claire de la division et la croissance des cellules. La synchronisation des populations cellulaires à des stades spécifiques du cycle cellulaire s’est avérée pour être très utile dans ces efforts expérimentaux. Synchronisation des cellules par un traitement avec des produits chimiques qui sont relativement moins toxique peut être avantageuse sur l’utilisation de médicaments inhibiteurs pharmacologiques pour l’étude des événements de cycle de cellules qui en résulte et obtenir l’enrichissement spécifique de certains stades mitotiques. Nous décrivons ici le protocole de synchronisation des cellules humaines à des stades différents de la cellule du cycle, comprenant à la fois en phase S et phase M avec un bloc double thymidine et libérer la procédure pour l’étude de la fonctionnalité des protéines mitotiques dans l’alignement des chromosomes et la ségrégation. Ce protocole a été extrêmement utile pour étudier les rôles mitotiques des protéines multifonctionnelles qui possèdent des fonctions interphase établies. Dans notre cas, le rôle mitotique de Cdt1, une protéine essentielle pour la réplication origine licences en phase G1, peut être étudié efficacement que lorsque Cdt1 G2/M-spécifiques peuvent être épuisés. Les auteurs décrivent le protocole détaillé pour épuisement des Cdt1 G2/M-spécifique à l’aide de la synchronisation de la thymidine double. Aussi, nous expliquer le protocole de la fixation de la cellule et vivre l’imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie confocale haute résolution après la sortie de la thymidine. La méthode est également utile pour analyser la fonction des protéines mitotiques sous des conditions physiologiques et perturbées comme pour Hec1, une composante de la Ndc80 complexe, car elle permet d’obtenir de grands échantillons de taille des cellules mitotiques pour fixe et de cellules vivantes l’analyse que nous montrons ici.

Introduction

Dans le cycle cellulaire, les cellules subissent une série d’événements fortement réglementées et contrôlées dans le temps pour la reproduction exacte de leur génome et leur multiplication. Chez les mammifères, le cycle cellulaire se compose de l’interphase et de la phase M. En interphase, qui se compose de trois phases G1, S et G2, la cellule duplique son génome et subit une croissance qui est nécessaire à la progression de cycle cellulaire normal^1,2. Dans la phase M, qui se compose de la mitose (prophase prométaphase, métaphase, anaphase et télophase) et la cytocinèse, une cellule parentale produit deux cell....

Protocol

1. double bloc de Thymidine et libération : préparations de réactif

1. Faire 500 mL que Dulbecco modified Eagle moyen (DMEM) additionné avec 10 % FBS, la pénicilline et la streptomycine.
2. Faire le stock de 100 mM de la thymidine dans l’eau stérile et magasin en aliquotes à-80 ° C.

2. protocole d’imagerie cellulaire fixe de Progression mitotique (Figure 1 a)

1. Jour 1, semence ~ 2 x 10⁵ les cellules HeLa dans les puits d’une plaque de 6 puits avec une lamelle couvre-objet (stérilisé avec l’éthanol à 70 % et l’irradiation UV) et 2 mL de milieu DMEM. Cultiver les cellules da....

Results

Étude de la progression mitotique et de la stabilité des microtubules dans les cellules fixées après la sortie de double bloc de thymidine
Cdt1 est impliqué dans les licences des origines de réplication de l’ADN en phase G1. Elle est dégradée au cours de la phase S mais re-s’accumule en phase G2/M. Afin d’étudier son rôle lors de la mitose, la Cdt1 endogène doit être épuisé spécifiquement à la phase de G/M en utilisant la technique de synchronisation de cellule plus ap.......

Discussion

L’avantage essentiel de la synchronisation de la thymidine double, c’est qu’il fournit un échantillon accrue des cellules mitotiques dans une fenêtre de peu de temps avec plusieurs de ces cellules entrant dans la mitose à l’unisson, également permettant ainsi des analyses de l’alignement du chromosome, bipolaire avec un rendement beaucoup plus élevé d’axe formation et la ségrégation des chromosomes.

De nombreux complexes de protéine régulatrice et voies de signalisation sont consacrés à assure.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Magasin à 4 ° ; C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Stocker à 4 ° ; C
Leibovitz' s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Magasin à 4 ° ; C
Sérum réduit moyen (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Conserver à 4 ° ; C
Pénicilline et streptomycine	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Stocker à 4 ° ; C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissous dans de l’eau distillée stérile
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
Cellules HeLa exprimant GFP-H2B
Cellules HeLa exprimant la GFP-&alpha ;-tubuline et mCherry H2B	Don généreux du Dr Kozo Tanaka de Tohoku université, Japon
Solution de formaldéhyde	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxique, nécessite la prudence
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxique, nécessite la prudence
Souris anti-&alpha ;-tubuline	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	Dilution 1:1 000
Fourmi de lapin Zwint1	Bethyl	A300-781A	dilution 1:400
Souris anti-phospho-&gamma ; H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	dilution 1:300
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		dilution 1:250
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		dilution 1:250
BioLite 6 puits multiparabole	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Plat à fond en verre	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Microscope inversé Nikon Eclipse TiE	Instruments Disque
rotatif pour caméra confocale	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Andor		iXon Ultra EMCCD 4 longueur d’onde
laser	Agilent Technologies
Système d’incubation pour microscopes	Tokai Hit	TIZB
Logiciel NIS-elements	Nikon Instruments