Un protocole pour le développement d’un Biocapteur électrochimique d’ADN comportant une électrode de carbone acide-stabilisé, or de nanoparticules modifiés, sérigraphié de polylactique pour détecter les Vibrio parahaemolyticus est présenté.
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Article de méthode
Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) est un pathogène d’origine alimentaire commune qui contribue à une grande partie des problèmes de santé publique dans le monde, affectant de manière notable le taux de morbidité et de mortalité humaine. Les méthodes conventionnelles pour la détection de V. parahaemolyticus tels que les méthodes axées sur la culture, tests immunologiques et moléculaires des méthodes nécessitent la manipulation des échantillons complexes et sont long, fastidieux et coûteux. Récemment, les biocapteurs ont prouvé être une méthode de détection prometteurs et complet avec les avantages d’une détection rapide, coût-efficacité et praticité. Cette recherche porte sur l’élaboration d’une méthode rapide de détection V. parahaemolyticus avec une sélectivité élevée et une sensibilité en utilisant les principes de l’hybridation de l’ADN. Dans le travail, caractérisation des nanoparticules or des stabilisés acide polylactique synthétisés (PLA-AuNPs) a été réalisée à l’aide de la Diffraction des rayons x (DRX), spectroscopie Ultraviolet-visible (UV-Vis), microscopie électronique à Transmission (TEM), émission de champ Microscopie électronique à balayage (FESEM) et la voltampérométrie cyclique (CV). Nous avons effectué également nouveaux essais de stabilité, la sensibilité et la reproductibilité de la PLA-AuNPs. Nous avons trouvé que le PLA-AuNPs forment une structure solide de nanoparticules stabilisées en solution aqueuse. Nous avons également observé que la sensibilité améliorée grâce à la plus petite valeur de la résistance (Rct) transfert de charge et une augmentation de la surface active (0,41 cm2). Le développement de notre biocapteur ADN reposait sur la modification d’une électrode de carbone sérigraphié (SPCE) avec PLA-AuNPs et à l’aide de bleu de méthylène (MB) comme indicateur rédox. Nous avons évalué les événements de l’immobilisation et l’hybridation par voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV). Nous avons constaté que complémentaires, non complémentaires et oligonucléotides dépareillées étaient particulièrement distingués par le biocapteur fabriqué. Elle a également montré fiable de sensibilité de détection dans les études de réactivité croisée contre divers pathogènes d’origine alimentaire et dans l’identification de V. parahaemolyticus dans les coques fraîches.
Introduction
Un important sujet de débat public et scientifique au cours des dernières années, l’intoxication alimentaire est principalement associée à 3 principes : microorganismes1, produits chimiques2et parasites3. Des aliments contaminés peuvent provoquer des conséquences graves pour la santé chez les humains, en particulier dans le groupe à risque plus élevé de ceux qui ont un système immunitaire faible, les personnes âgées, les femmes enceintes, bébés et jeunes enfants4. Avec plus de 1 million de cas de diarrhée aiguë survenant chaque année chez les enfants âgés de moins de 5 ans ....
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Protocole
Remarque : Tous les réactifs chimiques et biochimiques à utiliser doivent être de qualité analytique et utilisés sans davantage de purification. Préparer toutes les solutions à l’aide de l’eau désionisée stérile. Autoclave toute la verrerie avant la stérilisation.
ATTENTION : S’il vous plaît utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des activités de laboratoire, y compris l’utilisation de contrôles (hotte aspirante, boîte à gants) d’ingénierie et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse, pantalons pleine longueur, fermé-orteil chaussures).
1. fabrication....
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Résultats
Formation de AuNPs a été révélée par le changement de couleur de la solution aqueuse avec du citrate de sodium présent. Cela a provoqué la couleur changer du jaune clair au rouge rubis profond. La génération de PLA-AuNPs a été confirmée dans les spectres UV-vis (Figure 1) où la croissance du pic surface plasmon resonance (SPR) a été trouvée à environ 540 nm. La formation et l’existence de PLA-AuNPs a été indiqué aux gammes de longueur d’onde 500-600 nm, selon.......
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Discussion
Les étapes essentielles dans un cadre de mise au point de ce type de biocapteurs électrochimiques sont le choix des éléments de reconnaissance biologique approprié pour le transducteur (acide nucléique ou ADN ici) ; approche chimique pour la construction de la couche sensible du capteur ; matériel de transduction ; optimisation de l’immobilisation de l’ADN et l’hybridation ; et la validation de la biocapteur développé en utilisant des échantillons réels.
De base de la réussite d’un biocapteur .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à souligner l’appui de l’Universiti Putra Malaysia.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide acétique | Merck | 100056 | |
| Chloroforme | Merck | 102445 | |
| Diaminoethane acide tétraacétique | Promega | E5134 | |
| Phosphate de sodium dibasique ; | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Hydrogénophosphate disodique | Sigma-Aldrich | 255793 | |
| Éthanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Chlorure d’or (III) trihydraté | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Acide chlorhydrique | Merck | 100317 | |
| Bleu de méthylène | Sigma-Aldrich | M44907 | |
| Phosphate de sodium monobasique | monohydraté Sigma-Aldrich | S3522 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate | Sigma-Aldrich | P5119 | |
| Résine poly(acide lactique), qualité commerciale 4042D | NatureWorks | 4042D | |
| Chlorure de potassium | R& M Chemicals | 59435 | |
| Dihydrogénophosphate de potassium | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Hexacyanoferrate de potassium III | R& M Chemicals | 208019 | |
| Acétate de sodium sel anhydre | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Citrate trisodique | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Tris(hydroxyméthyl) aminométhane | Fisher Scientific | T395-100 | |
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| 2X PCR Master Mix avec Dual-Dye | Norgen Biotek | 28240 | |
| Gel d’agarose | Merck | 101236 | |
| Bolton Agar | Merck | 100079 | |
| Bolton Broth | Merck | 100079 | |
| CHROMagar Vibrio | CHROMagar | VB910 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Eau sans nucléases | Thermo Scientific | R0581 | |
| Éosine bleu de méthylène agar ; | Merck | 101347 | |
| GelRed | Biotium | 41001 | |
| Glycérol | Merck | 104092 | |
| Go Taq Buffer | Promega | M7911 | |
| Colorant de chargement 100 pb Échelle d’ADN | Promega | G2101 | |
| Colorant de chargement 1kb Échelle d’ADN | Promega | G5711 | |
| Chlorure de magnésium | Promega | 91176 | |
| Mannitol jaune d’oeuf gélose polymyxine | Merck | 105267 | |
| McConkey Agar | Merck | 105465 | |
| Taq polymérase | Merck | 71003 | |
| Trypticase Bouillon de soja | Merck | 105459 | |
| Trypticase Agar | Merck | 105458 |
Références
- Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
- Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A.
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