Article de méthode

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation

DOI :

10.3791/56600

⸱

21 décembre 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Dans cet article

Résumé

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Ce manuscrit décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions avec sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH est une méthode de visualisation qui permet la détection simultanée, de localisation et quantification des molécules d’ARNm uniques dans des cellules individuelles fixes.

Résumé

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On décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions chez les bactéries fixes pour utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH permet la mesure de la variabilité de la cellule-cellule au nombre de copies d’ADN messagère des gènes d’intérêt, ainsi que la localisation subcellulaire des transcriptions. Les principales étapes sont la fixation de la culture de la cellule bactérienne, la perméabilisation des membranes cellulaires et l’hybridation des transcriptions cible avec jeux de sondes oligonucléotidiques fluorescent marqué disponible dans le commerce du court. smFISH peut permettre à l’imagerie de la transcription de gènes multiples dans la même cellule, avec les limitations imposées par le chevauchement spectral de différents marqueurs fluorescents. Après avoir terminé le protocole illustré ci-dessous, les cellules peuvent être facilement photographiées à l’aide d’un microscope couplé avec un appareil photo destiné à faible intensité fluorescence. Ces images, ainsi que de la cellule des contours obtenus de segmentation d’images de contraste de phase, ou de coloration de membrane cellulaire, permettent le calcul de la distribution de nombre de copie ARNm d’un échantillon de cellules à l’aide de logiciels libres ou écriture personnalisée. La méthode étiquetage décrite ici peut également être appliquée aux transcriptions d’image avec la microscopie stochastique reconstruction optique (tempête).

Introduction

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Stochasticité est un aspect fondamental et incontournable de l’expression génique et donne naissance à des cellules hétérogénéité1, tant au niveau de transcription et protéines2,3. Quantification de la variabilité entre les cellules dans des conditions bien définies offre un guichet unique dans les processus de base qui sous-tendent l’expression des gènes et son règlement. Une importante source d’hétérogénéité des cellules chez les bactéries se déroule au niveau transcriptionnel. Nombres de transcription varient non seulement en raison de la stochasticité de transcription, mais aussi à ....

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Protocole

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1. conception de la sonde

Remarque : Ce protocole utilise des sondes oligonucléotidiques disponibles dans le commerce déjà étiquetés avec des fluorophores. Les sondes sont constitués d’un ensemble de séquences spécifiques complémentaires à une cible ADN messagère, chaque sonde étant conjugué à une seule molécule fluorescente. Alternativement, il est possible d’attacher des marqueurs fluorescents aux sondes, tel que décrit ailleurs5,16.

  1. Sondes de smFISH de conception en utilisant l’algorithme de16 sonde Designer développé par Arjun Raj (van Oudenaa....

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Résultats

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Nous avons effectué des mesures de smFISH de galK et sodB transcrits en cellules d’Escherichia coli . Les transcriptions ont été hybridées avec un ensemble de séquences spécifiques complémentaires de la séquence cible, chaque sonde étant conjugué à une seule molécule fluorescente (voir table des matières). La fluorescence et la phase de contrastent des images de MG1655 sauvage (WT) de la souche e. coli ou d’une souche de galK-supprimé de JW0740 (collection de Keio)

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Discussion

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Dans notre laboratoire, nous avons mesuré le nombre de transcription des gènes dans les cellules d’Escherichia coli à l’aide de la méthode de smFISH2. En bref, cette procédure se compose des étapes suivantes : fixation cellulaire, perméabilisation des membranes permettant la pénétration de la sonde, sonde d’hybridation et déguster d’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence standard. Cette procédure est basée sur celles déjà publiées avec quelques modifications6

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Science Israël 514415 (à J.S.) et une subvention de la BSF-NSF (MCB) 2016707 (à J.S.). Support de Siegfried et Irma Ullman chaire professorale (à J.S.) est également reconnu.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sulfate de dextran selsodique Sigma-AldrichD8906
Éthanol pur, 99,5 %, réactif ACS, absoluMallinckrodt Baker - Avantor8025.25
Diéthylpyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758
Sans RNase 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
Sans RNase 10X PBSLife Technologies/AmbionAM9625
Tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) BioUltra, pour la biologie moléculaireSigma-Aldrich93283
eau sans nucléaseThermo Fisher Scientific10977035
Solution de formaldéhyde pour la biologie moléculaire, 36,5-38 % dans l’eauSigma-AldrichF8775
Formamide désionisé, sans nucléasesThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
ARNt d’E. coli (acide ribonucléique, transfert de type xx à partir de l’escherichia)Sigma-AldrichR1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)Thermo Fisher Scientific/AmbionAM2616
Complexe vanadyl-ribonucléoside, VRC, 200 mMNew England BiolabS1402S
Poly-L-LysineSigmaP4707
Cysteamine et oxygèneSigma-Aldrich30070
Glucose oxydase d’Aspergillus niger, Type VII, 50KUSigma-AldrichG2133
CatalaseSigma-AldrichC40
D-glucoseSigma-AldrichG8270
D-fucoseSigma-AldrichF8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution Life TechnologiesV2286
Agarose, réactif à bas point de fusionSigma-AldrichA9414
Isolateur adhésif en silicone 24-2mm Dia. X 1.8 mm profondeur JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 666208
Fond en verre recouvert de poly-D-lysine Plats de culture à fond en verreMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
Gants d’examen en nitrile non poudrés Super lifeSupermaxTC-N-9889
Ruban d’incubation de stérilisationde marque Sigma-AldrichBR61750
Tubes à microcentrifuger (1,8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
Falcon Tubes en polypropylène à fond rond (14 ml)BD Biosciences352059
Centrifugeuse à fond conique en polypropylène tubes (50 ml)Corning430828
Pipettes sérologiques (Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
Pipettes sérologiques (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
Pipettes sérologiques (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
Spectrophotomètres cuvettesSarstedt67.742
Pointes de pipette sans RNase 0,2 - 20 &mu ; lFroggaBioFT20
Pointes de pipette sans RNase 10 - 200 &mu ; lAxigene/corningTF-200
Pointes de pipette sans RNASE 100 - 1000 &mu ; lFroggaBioFT1000
Pointes de pipette sans nase 100 - 1000 &mu ; lSorenson14200
Seringue jetable 10 mL aiguille G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
Minisart 0,2 um Seringue FiltreSartorius16534 K
Instruments Nikon microscope type A huile d’immersion A, 8ccNikonMXA20233
Lames de microscope 76 x26, 3"x1"x1mmThermo Fisher Scientific421-004ET#
0 lamelle 24x60Thermo Fisher Scientific/MenzelBNBB024060A0
Agitateur orbitalM.R.CTOU-50
Hot blockM.R.C
VortexFried Electric CompanyG-560-E
MicrocentrifugeuseEppendorf5427R
CentrifugeuseEppendorf5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Contrôleur de pipetteDrummond Scientific Company4-000-501-I
Spectrophotomètre OD600 pour les taux de croissance bactérienne DiluPhotometerMidsciOD600-10
iXon X3 Caméra EMCCDAndorDU-897E-CS0-#BV
Microscope Eclipse TiNikonMEA53100
CFI plan apochromat DM 100X objectif à huile lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
Jeu de filtres (TRITC/CY3) : EX - ET545/30X ; EM - ET620/60M ; BS - T570LPNikon49005
Jeu de filtres (CY5) : EX - ET640/30X ; EM - ET690/50M ; BS - T660PNikon49009
Nis-elements AR logiciel de recherche automatiqueNikonMQS31000
STORM microscopeVutaraSR-200
NA 1.2 objectif d’immersion dans l’eau Olympus
SRX logiciel d’acquisition et d’analyse d’imagesVutara
Evolve 512 EMCCDPhotométrie
Stellaris® ; Sondes FISH, dosage personnalisé avec CAL Fluor® ; Red 590 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Séquence pour l’ARNm galK :
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Stellaris® ; Sondes FISH, dosage personnalisé avec Quaser Fluor® ; Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Séquence pour l’ARNm sodB :
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Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
  2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....

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Mots-clés

FISH sur mol cule uniquemarquage de l ARNm d E colivisualisation des transcritssondes oligonucl otidiques fluorescentesfixation de cellules bact riennesprotocole de perm abilisationtampon d hybridationmontage sur gel d agarosemicroscopie fluorescenceimagerie STORM

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