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Article de méthode

Synthèse de ciblage de Monocyte Peptide Amphiphile Micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose

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DOI :

10.3791/56625

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17 novembre 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode impliquant la synthèse et la caractérisation de monocyte-ciblage des micelles peptide amphiphile et le correspondant d’essais pour tester la biocompatibilité et la capacité de la micelle de liaison aux monocytes.

Résumé

L’athérosclérose est un facteur majeur de maladies cardio-vasculaires, la principale cause de décès dans le monde, que réclame 17,3 millions de vies chaque année. L’athérosclérose est également la principale cause de mort subite et infarctus du myocarde, fomentées par des plaques instables qui se rompent et bloquer le vaisseau sanguin sans avertissement. Courant de modalités d’imagerie ne peut pas différencier entre les plaques stables et instables qui se rompent. Micelles de peptides amphiphiles (PAMs) peuvent surmonter cet inconvénient car ils peuvent être modifiés avec une variété de ciblage des moitiés qui se lient spécifiquement à des tissus malades. Monocytes montrent à des marqueurs précoces de l’athérosclérose, tandis que la forte accumulation de monocytes est associée à plaques sujettes à la rupture. Par conséquent, des nanoparticules qui peuvent cibler des monocytes peuvent servir à discriminer les différentes étapes de l’athérosclérose. À cette fin, nous décrivons ici un protocole pour la préparation de monocyte-ciblage PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sont self-assembled par l’intermédiaire de synthèse dans des conditions douces aux nanoparticules forme de 15 nm de diamètre, avec près de charge surface neutre. In vitro, PAMs se sont avérées biocompatibles et avait une affinité élevée pour les monocytes. Les méthodes décrites dans les présentes sont prometteuses pour un large éventail d’applications dans l’athérosclérose ainsi que d’autres maladies inflammatoires.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires restent les principales causes de décès dans le monde avec environ 17,3 millions de décès dans le monde1. Les maladies cardiovasculaires sont fournis par l’athérosclérose, une affection dans laquelle les plaques s’accumuler dans les artères, le sang ainsi inhiber et le débit d’oxygène aux cellules du corps2,3. La progression de l’athérosclérose implique l’épaississement et le durcissement des artères par une réaction inflammatoire, métabolisme lipidique irréguliers et la formation de plaques, conduisant à la plaque risque de rupture ou d’infarctus du myocarde,4,5. Les cellules endothéliales expriment des molécules de cytokines et d’adhérence, incluent des MCP-1 qui se lie au récepteur des chimiokines C-C (CCR2) à la surface des monocytes6,7,8. Cholestérol oxydé convertit monocytes macrophages durant les premiers stades de formation de la plaque, qui amplifie la réponse inflammatoire dans la région et conduit à la lésion des tissus et la formation de plaques instables ou vulnérables9, 10.

Traditionnellement, l’athérosclérose est évaluée en évaluant la sténose luminale par imagerie anatomique à l’aide d’ultrasons ou angiographie11,12. Cependant, ces méthodes ne peuvent déterminer un rétrécissement sévère de la paroi artérielle et pas le stade précoce de l’athérosclérose, car la croissance initiale plaque entraîne un remodelage artériel maintenir la taille de l’artère et le sang écoulement tarifaire12,13, 14. Par conséquent, les angiogrammes sous-représenter la prévalence de l’athérosclérose. En outre, les techniques d’imagerie non invasives comme une émission de photon unique calculé tomographie, tomographie par émission de positons et l’imagerie par résonance magnétique ont récemment été utilisées pour caractériser la morphologie de la plaque car ils peuvent fournir des détails initiaux et caractérisation des plaques. Toutefois, ces modalités sont souvent limitées par le manque de sensibilité, résolution spatiale, ou exigent l’utilisation de rayonnements ionisants, rendant la progression plaque d’imagerie à des stades différents, beaucoup plus difficile de15,16, 17. Un système d’imagerie permettant d’identifier plus précisément les plaques à différents stades de l’athérosclérose reste à développer.

NANOPARTICULES ont montré pour être une plate-forme émergente pour in vivo plaque ciblage et diagnostics18,19,20,21. En particulier, PAMs sont avantageuse en raison de leur diversité chimique et de la capacité d’accueillir une variété de moitiés, compositions, tailles, formes et fonctionnalisation de surface22. Peptides amphiphiles (Fe) se composent d’un peptide « tête hydrophile, » attaché à une queue hydrophobe, qui sont généralement des lipides ; Cette structure amphiphile confère des capacités de l’auto-assemblage et permet un affichage multivalent des peptides sur la surface des particules22,23,24. Le peptide polaires peuvent influer sur la forme des particules par le biais de pliage et de liaisons hydrogènes entre les peptides25. Les peptides qui se replient grâce à l’interaction de feuillet β auraient dû être divulgués afin de former des micelles allongés, tandis que α-hélicoïdale confirmation peut former deux micelles sphériques et allongée22,23,24, 25,26,27. Linkers de polyéthylène glycol (PEG) qui protègent la charge superficielle du peptide peuvent être placés entre le peptidiques hydrophiles et la queue hydrophobe de PAMs, améliorer l’accessibilité de la NANOPARTICULE dans la circulation systémique28, 29 , 30 , 31. PAMs sont aussi avantageuses car elles sont biocompatibles et auraient dû être divulgués d’avoir un large éventail d’applications32,,33. Solubilité dans l’eau des micelles offre un avantage sur les autres systèmes à base de nanoparticules comme certaines nanoparticules polymériques qui ne sont pas solubles dans l’eau et ont dû être suspendu en solubilisants pour injections34. En outre, la possibilité de créer des PAMs qui démonter en réponse à un stimulus spécifique fait PAMs un candidat attrayant pour drogue intracellulaire contrôlée livraison35.

En se liant au récepteur CCR2 et qui s’accumulent dans la crosse aortique, PAMs ont été développées précédemment monocyte visant à surveiller les différents stades de lésions athéroscléreuses dans l' aorte9. Chez les souris- / - de l’ApoE, accumulation de monocytes augmente proportionnellement à la plaque progression36. En outre, il a été constaté que les patients avec des plaques sujettes à rupture, stades contiennent des quantités plus élevées de monocytes37. Par conséquent, la modification des PAMs d’incorporer des MCP-1 est utile car il permet une plus grande précision de ciblage et de différencier les lésions athéroscléreuses et fin-début. Ces études de validation a également vérifié que PAMs sont suffisamment sûres pour être utilisé en préclinique et sont effacées insuffisants38. Monocytes et l’inflammation étant caractéristique à d’autres maladies, MCP-1 PAMs ont le potentiel d’être utilisé pour des applications thérapeutiques et diagnostiques dans d’autres maladies au-delà de l’athérosclérose8,39,40 , 41.

Ici, nous rapportons la fabrication de hautement évolutif et auto-assemblés PAMs de MCP-1 qui fait preuve de la particule taille optimale, charge superficielle et ciblage sélectif aux monocytes pour des applications d’imagerie dans l’athérosclérose.

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Protocole

Remarque : Lire la fiche signalétique pour réactifs et suivre toutes les mesures de sécurité chimique tel que requis par l’institution locale.

1. préparation du MCP-1 PAMs

  1. Préparation du peptide de MCP-1
    1. Peser 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang dans un réacteur (RV). Rincez le côté de la RV avec 5 mL de dimethylforamide (DMF) sous une hotte chimique.
    2. Charger le RV sur un synthétiseur de peptide de benchtop automatisé. Flacons d’acides aminés charge préemballé, N « - CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C », de la C à l’extrémité N-terminale. Comprend un flacon vide à la fin de l’étape finale de déprotection.
      Remarque : Un peptide brouillé avec séquence, N « - CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C », peut aussi être synthétisé en utilisant le même protocole.
    3. Synthèse terminée, transférer les peptides sur résine de la RV dans le flacon à scintillation avec 2-3 mL de méthanol jusqu'à ce que toutes les résines sont transférées. Après que la résine a coulé vers le bas, retirez le surnageant de méthanol et évaporer le restant à sec. Aspirateur sec pendant 2 h supplémentaires, ou toute la nuit à température ambiante.
    4. Faire 12 mL de solution clivage composé acide (TFA) :ethanedithiol:water:triisopropylsilane à 94:2.5:2.5:1 % en volume dans une hotte chimique. Agiter la solution de clivage pour s’assurer que c’est mélangé uniformément.
      ATTENTION : Triisopropylsilane et éthanedithiol étant sensible à air, argon purge des flacons stocks de triisopropylsilane et éthanedithiol pendant 1 min avant de les remettre.
    5. Placer le récipient de synthèse (SV) sur un agitateur de bras de serrage au bas de la moitié de la SV. Transférer le peptide-résine à la SV avec 2 mL de solution de clivage jusqu'à ce que tous les adsorbants sont transférés.
    6. Laver les côtés de la SV avec 3 mL de solution de clivage. Fermez le bouchon de la SV et l’agiter à 300 oscillations/min pendant 4 h.
    7. Peser avec un tube de centrifugation de vide de 50 mL. Enregistrement de la messe.
    8. Après 4 h, vider la solution de peptide clivés de la SV dans le tube de centrifuger de 50 mL. Rincer la SV plusieurs fois avec la solution restante de clivage.
    9. Évaporer le peptide clivées solution avec de l’azote jusqu'à ce qu’il y a moins de 4 mL restant dans le tube à centrifuger.
    10. Ajouter 36 mL d’éther glacé à la solution de peptide clivée.
    11. Vortex la solution jusqu'à ce qu’il est complètement blanc ou jaune. Centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    12. Ajouter 40 mL éther glacée dans le tube. Vortex et laisser agir à nouveau. Répétez le processus de centrifugation. Décanter le liquide surnageant.
    13. Sécher le culot PA brut avec azote gaz purge jusqu'à ce que l’éther est visiblement évaporé.
    14. Ajouter 20 mL bidistillée, vortex, l’eau et laisser agir jusqu'à ce que le peptide est complètement dissous dans la solution.
    15. Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.
    16. Une fois que le peptide est séché, peser la masse du tube à centrifuger contenant le peptide brut. Dissoudre le peptide brut à 5 mg/mL d’eau.
    17. Dissoudre 25 mg de peptide de MCP-1 brut dans 5 mL d’eau bidistillée à une concentration totale de 5 mg/mL. Purifier le peptide de MCP-1 brut par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide de 0,1 % TFA dans de l’eau (solvant A) et 0,1 % TFA dans l’acétonitrile (solvant B) comme des phases mobiles sur une colonne en phase inversée C8. Injecter les 5 mL du peptide dans la CLHP.
      Remarque : La phase mobile initiale était composé de 100 % de solvant A un débit de 9,0 mL/min. diminuer le solvant A lentement à 30 % en 27 min et le tenir à cette composition pendant 3 min. retour du gradient à 100 % de solvant un plus 3 min et maintenez à cette composition pendant 1 min donner une exécution totale de 34 min. maintenir la température de la colonne à 55 ° C. Utiliser le mode de source d’ions positifs pour l’analyse. L’acide formique peut être utilisé à la place de TFA, si TFA est trop acide pour la colonne HPLC. Il est recommandé que la vitesse de rampe de composition du solvant organique ne doit pas dépasser 2%/min pour une meilleure séparation.
    18. Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice pour le produit attendu de m/z à 2 890.
      NOTE : Dissoudre l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique à 1 mg/mL dans l’acétonitrile/eau (50 : 50 % en volume) comme la solution de la matrice. Repérez les 0,75 µL de solution de matrice sur la plaque MALDI, suivie de 0,75 µL de chaque fraction. Effectuer l’analyse à l’aide d’un mode positif ion réfléchissant à une gamme de masses de 500-5 000 Da.
    19. Combiner des fractions de produit, souffler dans l’acétonitrile, geler et lyophiliser peptides purifiés à sec.
  2. Préparation de MCP-1 PA
    1. Préparer un excès molaire 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maléimide au peptide dans des flacons séparés à scintillation. Dissoudre les deux composés dans l’eau bidistillée à ~ 15 mg/mL. Laisser agir pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les deux solutions sont tout à fait claires.
      Remarque : Le DSPE-PEG (2000)-Cy5 est synthétisé en utilisant le même protocole avec DSPE-PEG (2000)-amine et Cy5 fonctionnalisés ester N-hydroxysuccinimide (NHS), à l’exception de l’étape 1.2.3, où le pH de la solution est ajusté à 8,5.
    2. Ajouter DSPE-PEG (2000)-maléimide solution à la solution de peptide. Vortex et laisser agir.
    3. Ajouter 1 M NaOH goutte à goutte (1 µL) à la fois jusqu'à ce que le pH de la solution est de 7.
    4. Solution de purge d’azote pendant 5 min. remuer la solution du jour au lendemain.
    5. Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.
    6. Une fois que le produit brut est séché, dissoudre le solide à 5 mg/mL d’eau.
    7. Purifier par HPLC, tel que décrit ci-dessus.
      NOTE : Peptide non conjuguée et DSPE-PEG(2000) devraient éluer entre 15-30 % concentration organique (% en volume), tandis que DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugué doit éluer entre 40-50 % concentration organique.
    8. Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI pour les correspondants m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 devrait avoir un pic large m/z à 5 760.
      NOTE : acide 2, 5-dihydroxybenzoïque est mieux utilisé comme matrice pour DSPE-PEG (2000)-MCP-1 avec la MALDI.
  3. Assemblée de MCP-1 PAMs
    1. Dissoudre 1,75 mg PAs de MCP-1 avec 3 mL de méthanol dans un flacon 1-dram. Laisser agir jusqu'à dissolution complète de la MCP-1 PA.
      NOTE : Cy5 amphiphiles peut être incorporé à un rapport molaire de 10 : 90 PA de MCP-1 pour les applications d’imagerie.
    2. Evaporer le méthanol en présence d’azote dans un mouvement circulaire tout en rinçant le méthanol restant sur le côté de la cuvette jusqu'à ce qu’un film uniform est formé au fond du flacon. Séchage sous vide le film du jour au lendemain.
    3. Hydrater le film avec 3 mL de tampon phosphate ou de l’eau saline (PBS), afin de préparer une solution de 100 µM de MCP-1 PAMs. Vortex doucement et laisser agir la solution jusqu’au clair. Incuber à 80 ° C pendant 30 min.
      Remarque : La température élevée a été montrée pour accélérer le processus d’auto-assemblage et permet au composant de peptide former la structure secondaire plus stable, tout en réduisant la micellaire critique concentration (CMC)42,43.
    4. Cool la dispersion obtenue à la température ambiante.

2. caractérisation des MCP-1 PAMs

  1. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) et potentiel zêta
    1. Place de 100 µM de MCP-1 PAM ou brouillée PAM dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
      Remarque : Des cuvettes de potentiel DLS et zeta peuvent être différents selon les instructions de l’instrument.
    2. Equilibrer l’instrument à la température ambiante. Mesurer la taille et la charge superficielle de la PAM.
  2. Microscopie électronique à transmission (TEM)
    1. Ajouter 7 µL de 50 µM MCP-1 PAM ou brouillée PAM vers une grille de TEM suspendu dans une pince fermeture automatique pour 5 min. mèche à la goutte avec une lingette de tâche délicate.
    2. Ajouter 7 µL d’eau pour laver la grille. Mèche à la goutte.
    3. Ajouter 7 µL de 1 wt % l’acide phosphotungstique pour 2 min. mèche à la goutte. Répétez l’étape 2.2.2.
    4. Sécher la grille TEM avant l’analyse TEM.
  3. Spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
    1. Allumez l’azote pendant 5-10 min avant l’utilisation de l’instrument.
    2. Déposer 300 µL de vide (eau ou PBS) dans la cuvette.
    3. Mesurer les spectres à 190-265 nm, 0. 2 mm-longueur du chemin avec un temps d’intégration 1 s et une bande passante de 1 nm à température ambiante. Collecter 3 répétitions.
    4. Mesure 100 µM peptide de MCP-1, MCP-1 PAM, brouillés peptidique et brouillés PAM sous la même condition décrite à l’étape 2.3.3. Soustraire de l’essai à blanc.
    5. Ajuster les données à l’aide d’une interpolation linéaire des spectres de base polylysine.
    6. Éteignez l’appareil. Attendre 10 min avant d’éteindre l’azote.

3. l’analyse in Vitro de MCP-1 PAMs

  1. In vitro de biocompatibilité
    1. Culture et développez WEHI 274,1 murines monocytes dans Eagle modifié milieu de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol à 37 ° C moins de 5 % de CO2 passage 5.
      NOTE : WEHI 274,1 sont des cellules en suspension. Lorsque la mise en culture, les médias devraient être réapprovisionnés tous les 2-3 jours.
    2. Monocytes pipette dans les médias dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    3. Aspirer les anciens médias et resuspendre dans 10 mL de milieu frais dans le tube à centrifuger. Mélanger lentement jusqu'à ce que les cellules sont réparties uniformément dans les médias. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan et un hémocytomètre.
    4. Diluer les cellules telles qu’il y a 4 000 monocytes par 90 µL des médias / puits. Ajouter 90 µL de cellules dans le puits d’une plaque de 96 puits. Incuber pendant 24 h.
      Remarque : Évitez d’utiliser les puits sur le bord extérieur de la plaque pour éviter des différences entre évaporation et des variations thermiques de la plaque. Remplir les puits extérieurs avec 100 µL PBS.
    5. Dissoudre 0,15 µmol de peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide brouillé ou brouillés-PAM dans 150 µL de PBS dans des tubes de microcentrifuge distinct, stérilisé. Effectuer des dilutions pour faire 65 µL de 1, 10 et 100 µM de chaque échantillon.
    6. Ajouter 10 µL PBS de chacune des concentrations dans les puits contenant WEHI 274,1 (volume total : 100 µL par bien, 6 lignes, total de 96 puits). Incuber pendant 72 h.
    7. Ajouter 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) dans chaque puits. Incuber pendant 1 heure.
    8. Analyser l’absorbance à l’aide d’un lecteur à 490 nm ou selon les instructions du fabricant.
  2. Liaison de micelle in vitro
    1. Monocytes graine 500 000 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL de support contenant 100 µM étiquetés Cy5 MCP-1 PAM (10 : 90 rapport molaire du DSPE-PEG (2000)-Cy5 et PA de MCP-1). Incuber pendant 1 heure.
    2. Recueillir WEHI 274,1 par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer les médias.
    3. Resuspendre et laver les cellules dans 2 mL de PBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le PBS. Répétez le processus de lavage avec 2 mL de PBS. Aspirer le PBS.
    4. Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % pour fixer les cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Pipette les cellules fixes sur une lamelle de verre stériles dans les puits d’une plaque de 6 puits. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.
    6. Retirez le paraformaldéhyde. Lavez et rincez une fois avec 2 mL de PBS. Remettre en suspension avec 1 mL PB
      Remarque : Lorsque le rinçage, ne pas perturber les cellules sur la lamelle couvre-objet.
    7. Mettez 10 µL de 90 % de glycérol dans du PBS sur une diapositive. Utiliser une aiguille et une pince pour ramasser de la lamelle. Sécher le bord de la lamelle. Placez délicatement la lamelle sur une lame face vers le bas.
    8. Doucement, sceller le bord de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placer au réfrigérateur jusqu’au moment de l’imagerie.
    9. Utiliser un confocal laser scanning microscope (CLSM) installé avec des lasers pour Cy5 à λexcitation = 650 nm.

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Résultats

Préparation du PAM de MCP-1
Le motif de liaison CCR2 (résidus 13-35) de la protéine MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou un peptide brouillé [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] a été modifié par l’ajout d’un résidu de cystéine sur l’extrémité N-terminale. Le peptide de MCP-1 a été synthétisé par une méthode de phase solide Fmoc-négociée à l’aide d’un synthétiseur de peptide automatisé. Le peptide brut a été purifié par HPLC en phase inversée sur une colonne de C8 à 50 ° C à l’aide ...

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Discussion

MCP-1 PAMs sont une plate-forme d’imagerie moléculaire prometteuse, consistant en un peptide ciblage hydrophile et queue hydrophobe qui anime la nature auto-assemblées de la NANOPARTICULE. Ce ciblage monocyte micelle peut être préparé par synthèse simple et étapes de la purification du peptide de MCP-1 et DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs ont de nombreuses caractéristiques bénéfiques en vivo imagerie moléculaire telles que leur auto-assemblage sous des conditions douces, biodégradabilité intrinsèque et la diversité st...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier de l’University of Southern California, le National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli et Edythe large Innovation Award et la Fondation de Whittier L.K. Non-Cancer Bourse de recherche translationnelle accordée à EJC. Les auteurs remercient le Centre pour la microscopie électronique et microanalyse, Centre d’Excellence en NanoBiophysics, Centre d’Excellence pour la caractérisation moléculaire et translationnelle Imaging Center à l’University of Southern California, de l’assistance configurations instrumentales.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-éthanedithiolVWRE0032pour la synthèse peptidique
Pipettes sérologiques jetables de 10 mLVWR89130-898pour la culture cellulaire
Tubes à centrifuger de 15 mL, polypropylèneVWR89401-566pour diverses applications
Acide 2,5-dihydroxybenzoïque, 99 %Fisher ScientificAC165200050pour MALDI
25 mL jetable Pipettes sérologiquesVWR89130-900pour la culture cellulaire
2-Mercaptoéthanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010pour la culture cellulaire
Pipettes sérologiques jetables de 5 mLVWR89130-896pour la culture cellulaire
Tubes à centrifuger de 50 mLVWR89039-658pour diverses applications
Gourde de culture de 75 cm2Fisher Scientific13-680-65pour la culture cellulaire
Récipient de réaction de 75 mLProtein Technologies3000005pour la synthèse de peptides
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsVWR40101-346pour le dosage MTS
Acétonitrile, grade HPLCFisher ScientificA998SK-4pour la purification HPLC
Verre borosilicaté, 1 dramVWR66011-041pour la synthèse PAM
Pipette en verre borosilliqué, pointes longuesVWR14673-043pour diverses applications
Lamelle, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bpour la microscopie confocale
Cy5 amineAbcamab146463pour la conjugaison peptidique
Éther diéthylique, grade ACSFisher ScientificE138-1pour la précipitation peptidique
Jetable seringues, 20 mLFisher Scientific14-817-54pour la purification HPLC
Hémocytomètre double neubauer régléVWR63510-13pour le comptage cellulaire
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Ppour la conjugaison peptidique
DSPE-PEG(2000) maléimideAvanti880126Ppour la conjugaison peptidique
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  ;NanocsPG2-DSNS-10Kpour la conjugaison à Cy5
Dulbecco’s modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLpour la culture cellulaire
Sérum fœtal bovin, qualifié, inactivé par la chaleurThermoFisher Scientific10438026pour la culture cellulaire
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Apour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ipour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBC pour lasynthèse peptidique
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Fpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vpour la synthèse peptidique
Résine Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 meshNovabiochem856013pour la synthèse de peptides
Acide formique, grade optima LC/MSFisher ScientificA117-50pour la purification HPLC
GlycérolVWRM152-1Lpour la microscopie confocale
Compteur de pointage manuelFisher ScientificS90189pour le comptage de cellules
Barres d’agitation magnétiques, VWR58949-006pour la conjugaison peptidique
Méthanol, certifié ACSFisher ScientificA412-4pour la synthèse PAM
Kit de test colorimétrique de prolifération cellulaire MTSVWR10191-104pour le dosage MTS
N,N-Diméthylformamide, grade de séquençageFisher ScientificBP1160-4pour la synthèse peptidique
N-MéthylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMpour la synthèse peptidique
ParaformaldéhydeFisher ScientificAC416780250pour la fixation des cellules
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010049pour diverses applications
Pénicilline/streptomycine, 10 000 U/mLThermoFisher Scientific15140122pour la culture cellulaire
Récipient de synthèse peptidique, 25 mL& nbsp ;Fisher ScientificCG186011pour la synthèse peptidique
Acide phosphotungstiqueFisher ScientificA248-25pour TEM
Spectrede pipéridineP1146-2.5LTGLpour la synthèse de peptides
Lame de microscope en verre ordinaire 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3pour microscopie confocale
Réservoirs de réactifs, stériles  ;VWR95128093pour la culture cellulaire
Pince à épiler à fermeture automatiqueTedPella515pour TEM
Film de support TEMTedPella01814Fpour TEM
Acide trifluoroacétique  ;Fisher ScientificBP618-500pour le clivage peptidique et la purification HPLC
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlpour le clivage peptidique
Solution de bleu de trypan, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061pour le comptage cellulaire
Pince à épiler, à usage général denteléVWR231-SA-SEpour la microscopie confocale
WEHI-274.1ATCCATCC  ; CRL-1679
synthétiseur de peptides de paillasse automatisé de monocytesProtein TechnologiesPS3 Synthétiseur de peptides de paillasse
&alpha ;- cyano-4- acide cinnamique, 99 %Sigma Aldrich476870-2Gpour MALDI
en forme d’œuf murins

Références

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