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Article de méthode

Synthèse de ciblage de Monocyte Peptide Amphiphile Micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose

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DOI :

10.3791/56625

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17 novembre 2017

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Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode impliquant la synthèse et la caractérisation de monocyte-ciblage des micelles peptide amphiphile et le correspondant d’essais pour tester la biocompatibilité et la capacité de la micelle de liaison aux monocytes.

Résumé

L’athérosclérose est un facteur majeur de maladies cardio-vasculaires, la principale cause de décès dans le monde, que réclame 17,3 millions de vies chaque année. L’athérosclérose est également la principale cause de mort subite et infarctus du myocarde, fomentées par des plaques instables qui se rompent et bloquer le vaisseau sanguin sans avertissement. Courant de modalités d’imagerie ne peut pas différencier entre les plaques stables et instables qui se rompent. Micelles de peptides amphiphiles (PAMs) peuvent surmonter cet inconvénient car ils peuvent être modifiés avec une variété de ciblage des moitiés qui se lient spécifiquement à des tissus malades. Monocytes montrent à des marqueurs précoces de l’athérosclérose, tandis que la forte accumulation de monocytes est associée à plaques sujettes à la rupture. Par conséquent, des nanoparticules qui peuvent cibler des monocytes peuvent servir à discriminer les différentes étapes de l’athérosclérose. À cette fin, nous décrivons ici un protocole pour la préparation de monocyte-ciblage PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sont self-assembled par l’intermédiaire de synthèse dans des conditions douces aux nanoparticules forme de 15 nm de diamètre, avec près de charge surface neutre. In vitro, PAMs se sont avérées biocompatibles et avait une affinité élevée pour les monocytes. Les méthodes décrites dans les présentes sont prometteuses pour un large éventail d’applications dans l’athérosclérose ainsi que d’autres maladies inflammatoires.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires restent les principales causes de décès dans le monde avec environ 17,3 millions de décès dans le monde1. Les maladies cardiovasculaires sont fournis par l’athérosclérose, une affection dans laquelle les plaques s’accumuler dans les artères, le sang ainsi inhiber et le débit d’oxygène aux cellules du corps2,3. La progression de l’athérosclérose implique l’épaississement et le durcissement des artères par une réaction inflammatoire, métabolisme lipidique irréguliers et la formation de plaques, conduisant à la plaque risque de rupture ou d’infarctus du myoca....

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Protocole

Remarque : Lire la fiche signalétique pour réactifs et suivre toutes les mesures de sécurité chimique tel que requis par l’institution locale.

1. préparation du MCP-1 PAMs

  1. Préparation du peptide de MCP-1
    1. Peser 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang dans un réacteur (RV). Rincez le côté de la RV avec 5 mL de dimethylforamide (DMF) sous une hotte chimique.
    2. Charger le RV sur un synthétiseur de peptide de benchtop automatisé. Flacons d’acides aminés charge préemballé, N « - CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C », de la C à l’extrémité N-terminale. Comprend un flacon vide à la fin de l’étape finale de déprote....

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Résultats

Préparation du PAM de MCP-1
Le motif de liaison CCR2 (résidus 13-35) de la protéine MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou un peptide brouillé [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] a été modifié par l’ajout d’un résidu de cystéine sur l’extrémité N-terminale. Le peptide de MCP-1 a été synthétisé par une méthode de phase solide Fmoc-négociée à l’aide d’un synthétiseur de peptide automatisé. Le peptide brut a été purifié par HPLC en phase inversée sur une colonne de C8 à 50 ° C à l’aide .......

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Discussion

MCP-1 PAMs sont une plate-forme d’imagerie moléculaire prometteuse, consistant en un peptide ciblage hydrophile et queue hydrophobe qui anime la nature auto-assemblées de la NANOPARTICULE. Ce ciblage monocyte micelle peut être préparé par synthèse simple et étapes de la purification du peptide de MCP-1 et DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs ont de nombreuses caractéristiques bénéfiques en vivo imagerie moléculaire telles que leur auto-assemblage sous des conditions douces, biodégradabilité intrinsèque et la diversité st.......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier de l’University of Southern California, le National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli et Edythe large Innovation Award et la Fondation de Whittier L.K. Non-Cancer Bourse de recherche translationnelle accordée à EJC. Les auteurs remercient le Centre pour la microscopie électronique et microanalyse, Centre d’Excellence en NanoBiophysics, Centre d’Excellence pour la caractérisation moléculaire et translationnelle Imaging Center à l’University of Southern California, de l’assistance configurations instrumentales.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-éthanedithiolVWRE0032pour la synthèse peptidique
Pipettes sérologiques jetables de 10 mLVWR89130-898pour la culture cellulaire
Tubes à centrifuger de 15 mL, polypropylèneVWR89401-566pour diverses applications
Acide 2,5-dihydroxybenzoïque, 99 %Fisher ScientificAC165200050pour MALDI
25 mL jetable Pipettes sérologiquesVWR89130-900pour la culture cellulaire
2-Mercaptoéthanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010pour la culture cellulaire
Pipettes sérologiques jetables de 5 mLVWR89130-896pour la culture cellulaire
Tubes à centrifuger de 50 mLVWR89039-658pour diverses applications
Gourde de culture de 75 cm2Fisher Scientific13-680-65pour la culture cellulaire
Récipient de réaction de 75 mLProtein Technologies3000005pour la synthèse de peptides
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsVWR40101-346pour le dosage MTS
Acétonitrile, grade HPLCFisher ScientificA998SK-4pour la purification HPLC
Verre borosilicaté, 1 dramVWR66011-041pour la synthèse PAM
Pipette en verre borosilliqué, pointes longuesVWR14673-043pour diverses applications
Lamelle, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bpour la microscopie confocale
Cy5 amineAbcamab146463pour la conjugaison peptidique
Éther diéthylique, grade ACSFisher ScientificE138-1pour la précipitation peptidique
Jetable seringues, 20 mLFisher Scientific14-817-54pour la purification HPLC
Hémocytomètre double neubauer régléVWR63510-13pour le comptage cellulaire
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Ppour la conjugaison peptidique
DSPE-PEG(2000) maléimideAvanti880126Ppour la conjugaison peptidique
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  ;NanocsPG2-DSNS-10Kpour la conjugaison à Cy5
Dulbecco’s modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLpour la culture cellulaire
Sérum fœtal bovin, qualifié, inactivé par la chaleurThermoFisher Scientific10438026pour la culture cellulaire
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Apour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ipour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBC pour lasynthèse peptidique
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Fpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBpour la synthèse peptidique
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vpour la synthèse peptidique
Résine Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 meshNovabiochem856013pour la synthèse de peptides
Acide formique, grade optima LC/MSFisher ScientificA117-50pour la purification HPLC
GlycérolVWRM152-1Lpour la microscopie confocale
Compteur de pointage manuelFisher ScientificS90189pour le comptage de cellules
Barres d’agitation magnétiques, VWR58949-006pour la conjugaison peptidique
Méthanol, certifié ACSFisher ScientificA412-4pour la synthèse PAM
Kit de test colorimétrique de prolifération cellulaire MTSVWR10191-104pour le dosage MTS
N,N-Diméthylformamide, grade de séquençageFisher ScientificBP1160-4pour la synthèse peptidique
N-MéthylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMpour la synthèse peptidique
ParaformaldéhydeFisher ScientificAC416780250pour la fixation des cellules
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010049pour diverses applications
Pénicilline/streptomycine, 10 000 U/mLThermoFisher Scientific15140122pour la culture cellulaire
Récipient de synthèse peptidique, 25 mL& nbsp ;Fisher ScientificCG186011pour la synthèse peptidique
Acide phosphotungstiqueFisher ScientificA248-25pour TEM
Spectrede pipéridineP1146-2.5LTGLpour la synthèse de peptides
Lame de microscope en verre ordinaire 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3pour microscopie confocale
Réservoirs de réactifs, stériles  ;VWR95128093pour la culture cellulaire
Pince à épiler à fermeture automatiqueTedPella515pour TEM
Film de support TEMTedPella01814Fpour TEM
Acide trifluoroacétique  ;Fisher ScientificBP618-500pour le clivage peptidique et la purification HPLC
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlpour le clivage peptidique
Solution de bleu de trypan, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061pour le comptage cellulaire
Pince à épiler, à usage général denteléVWR231-SA-SEpour la microscopie confocale
WEHI-274.1ATCCATCC  ; CRL-1679
synthétiseur de peptides de paillasse automatisé de monocytesProtein TechnologiesPS3 Synthétiseur de peptides de paillasse
&alpha ;- cyano-4- acide cinnamique, 99 %Sigma Aldrich476870-2Gpour MALDI
en forme d’œuf murins

Références

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....

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Réimpressions et autorisations

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