Application de mesure de l’électrophysiologie pour étudier l’activité des transporteurs de l’Electro-neutre

Résumé

Ce manuscrit décrit les applications des électrodes sélectives proton et patch serrage des méthodes pour mesurer l’activité des systèmes de transport de protons. Ces méthodes surmonter certaines limitations des techniques communément utilisées pour étudier l’activité de transport de protons, tels que la sensibilité modérée, résolution temporelle et contrôle insuffisant milieu intracellulaire.

Résumé

Le transport des ions à travers les membranes cellulaires assure le contrôle précis de la teneur en ion au sein et en dehors de la cellule qui est indispensable pour la survie des cellules. Ces mécanismes de transport sont induits par les activités des protéines transporteur spécialisé. Plus précisément, pH dynamique est finement contrôlée par des systèmes d’extrusion membrane plasmique proton (H⁺), tels que le Na⁺/h⁺ famille de protéines échangeur (NHE). Malgré des efforts considérables afin d’étudier les mécanismes qui sous-tendent le règlement NHE, notre compréhension actuelle des propriétés biophysiques et moléculaires de la famille NHE est insuffisante en raison de la disponibilité limitée des méthodes pour mesurer efficacement l’activité NHE . Dans ce manuscrit, nous avons utilisé H⁺-électrodes sélectives au cours de la cellule entière patch serrage enregistrement afin de mesurer les flux induits par NHE H⁺ . Nous avons proposé cette approche pour surmonter certaines limitations de généralement utilisé des méthodes pour mesurer l’activité NHE, telles que l’absorption radioactif et molécules membranaires fluorescents. Mesure de l’activité NHE en utilisant la méthode décrite permet à haute sensibilité et la résolution temporelle et un contrôle plus efficace des concentrations intracellulaires de H⁺ . H⁺-électrodes sélectives sont basé sur le fait que l’activité de transporteur crée un gradient d’ions à proximité de la membrane cellulaire. Un H⁺-électrode sélective se déplaçant jusqu'à et à l’extérieur de la membrane cellulaire de manière répétitive, oscillatoire enregistre une différence de tension qui dépend des flux H⁺ . Alors que H⁺-électrodes sélectives permettent de détecter les flux de H⁺ sortir de la cellule, la méthode de serrage patch dans la configuration de la cellule entière est utilisée pour contrôler la composition ionique intracellulaire. En outre, application de la technique du géant patch clamp permet de modifier la composition intracellulaire non seulement des ions, mais aussi des lipides. L’activité de transporteur de l’isoforme NHE 3 (NHE3) a été mesurée à l’aide de cette approche technique pour étudier la base moléculaire du NHE3 règlement par phosphoinositides.

Introduction

Transport des ions et de solutés à travers la membrane de plasma est essentielle à la survie des cellules et, par conséquent, des organismes¹. Transport sélectif d’ions et de solutés est obtenue par un ensemble de canaux spécialisé et protéines transporteur. Des mutations dans ces protéines se traduisent souvent par une variété d’affections cliniques, rendu canal et transporteur de protéines des cibles potentielles pour le traitement pharmacologique¹. Malheureusement, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la fonction canal et le transporteur et la régulation est souvent limitée par les approches disponibles afin d’étudier leur activité^2,3,4.

Plus précisément, transporteurs peuvent être grossièrement subdivisés en deux grands groupes selon qu’ils modifient le potentiel transmembranaire de la cellule au cours du transport de solutés : les transporteurs d’ion électrogénique altérant [par exemple, -phosphate de sodium cotransporteur 2 a (NaPi2a), échangeur de sodium-calcium (NCX), etc..] ou les transporteurs d’ion électriquement neutres non altération [p. ex., échangeur de sodium-proton (NHE), cotransporteur sodium-chlorure, NaPi2c, etc..]. Les activités de ces deux catégories de transporteurs ont été étudiées intensivement à l’aide de l’absorption des isotopes radioactifs et fluorescentes membrane perméable colorants². Les deux approches estiment l’activité des transporteurs en mesurant les changements dans la concentration globale des ions cytoplasmiques spécifiques, et les deux méthodes ont des limites, telles que la sensibilité modérée et une résolution temporelle et un contrôle inadéquat de l’intracellulaire milieu. En effet, l’activité de nombreux transporteurs est dépendante de la concentration cytoplasmique des ions transportées (par exemple, NHE3, NCX), et les changements dans les concentrations de ces ions sont susceptibles de jouer un rôle important dans la régulation de l’activité de transporteur^{2 , 3 , 5}. des mesures précises de ces mécanismes réglementaires se limite à l’aide de méthodes classiques.

Pour surmonter ces limites, patch clamp méthodes sont utilisées pour étudier l’activité de transporteur^2,6. Plus précisément, l’auto-référentielle électrodes sélectives (ISEs)^7,8 , combiné avec le patch, système de serrage a récemment permis la mesure électroneutre transporteur activité^{3,4 , 5}. ISEs sont basé sur le fait que l’activité de transporteur crée un gradient d’ions à proximité de la membrane cellulaire. Une ISE se déplaçant vers le haut et loin de la membrane cellulaire dans une répétition, mode oscillatoire enregistre une différence de tension (µV). Différences de tension peuvent être convertis en valeurs du flux ionique à l’aide d’une méthode d’étalonnage qui s’applique la première loi de Fick de la diffusion^2,9. Tandis que SIES sont utilisés pour détecter le flux d’ions mobiles de cellules, la méthode de serrage patch dans les deux cellules entières ou des configurations de dedans-dehors est utilisé pour contrôler la composition ionique intracellulaire et potentiels de membrane. En outre, l’application de la technique du géant patch clamp permet la modification de la composition intracellulaire de non seulement des ions, mais aussi des lipides et protéines,^3,5.

En résumé, la polyvalence de la méthode de serrage patch contre que d’autres méthodes pour étudier, activité de transporteur a fait patch de serrage appropriés pour surmonter les problèmes habituels de ces autres méthodes. La combinaison d’auto-référence ISEs et techniques de patch clamp offre la possibilité unique de mesurer l’activité des transporteurs électroneutre dans un environnement expérimental étroitement contrôlé et à découvrir le roman moléculaire et biophysique Propriétés de la membrane cellulaire des transports^3,4,5. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l’activité de la NHE. La famille de protéine chez les mammifères NHE catalyse l’échange net électroneutre de sodium extracellulaire (Na⁺) pour proton intracellulaire (⁺H)^10,11 utilisant un gradient de Na⁺ vers l’intérieur. Chez les mammifères, la famille de protéine NHE comprend 11 protéines apparentées (NHE1-9 et NHA1-2) et un spermatozoïde spécifiques NHE^10,12,13.

NHEs (famille SLC9a) sont retrouvent partout dans les organismes vivants la plupart de simples procaryotes aux eucaryotes supérieurs et sont impliqués dans une variété de cellule vitale fonctions^10,11, y compris contrôler la défense cellulaire de salinité en procaryotes, maintenir acide-base l’homéostasie et cell volume et régulation de l’absorption de sel et d’eau dans divers épithéliums spécialisés^10,12,14,15. Ont a déterminé les principaux rôles biologiques de NHEs et l’importance de leurs fonctions par le biais de plusieurs études ; Cependant, peu d’études ont étudié les propriétés biophysiques et moléculaires des mammifères NHEs en raison des limites méthodologiques⁴. Récemment, l’application de l’auto-référence ISEs au cours de la cellule entière patch serrage a révélé de nouveaux mécanismes moléculaires d’isoformes NHE réglementés par des changements de la concentration intracellulaire des ions, de phospholipides et de protéines^{3, 4}.

Plus précisément, le protocole prévu dans ce manuscrit présente les méthodes et les approches pour l’étude de l’activité et la régulation de l’isoforme NHE 3 (NHE3), un acteur majeur dans l’absorption de Na⁺, Cl^–, HCO₃^– et fluide dans les bordure en brosse de l’épithélium rénal et intestinal,^14,16. Nouvel aperçu des différences dans la sensibilité de l’activité NHE3 à phosphoinositides intracellulaires (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] et phosphatidylinositide 3,4,5-triphosphate [PI(3,4,5]P3]) est signalé. Protéines de transport de cellules, telles que les canaux et les transporteurs, sont réglementés par les phosphoinositides¹⁷, et NHE3 lie directement les PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5)¹⁸. Se fondant sur la littérature actuelle, soit phosphoinositide pourrait être pertinente pour la régulation physiologique ou physiopathologique de NHE3^5,18,19. Nos résultats supportent les rôles distincts pour PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5) dans la régulation de l’activité NHE3. Cette distinction n’a été possible en raison de l’application de techniques ISE en combinaison avec l’enregistrement de cellules entières patch clamp. Cette technique permet également le contrôle de la teneur cellulaire en phosphoinositides par la perfusion intracellulaire des phosphoinositides différents pendant la mesure de l’activité NHE3.

Protocole

Remarque : Deux amplificateurs sont requis pour l’enregistrement de l’activité des transporteurs électriquement par un ISE auto-référentielle en conjonction avec le patch de serrage, un amplificateur de pince de patch pour maintenir la cellule en une configuration cellule entière et une haute impédance amplificateur ( électromètre) pour enregistrer l’activité de transporteur par l’intermédiaire de l’ISE (voir Table des matières). L’amplificateur de patch clamp est directement relié à la borne de carte d’acquisition. L’électromètre est connecté à l’amplificateur différentiel utilisée pour filtrer et amplifier le signal. L’amplificateur différentiel est reliée à la borne de carte d’acquisition. Capmeter, logiciel de pince de patch qui surveille la capacité de la cellule, a été utilisée dans les précédentes études²⁰ (voir Table des matières). Les solutions de chambre et de la perfusion d’enregistrement sont maintenues à 37 ° C.

1. préparation des Pipettes pour ISEs

1. Tirez sur les pipettes de verre borosilicaté capillaires d’un diamètre extérieur de 1,2 mm (voir Table des matières) à l’aide de la pipette puller² .
2. Polir la pipette à l’aide de la microforge. Le diamètre de l’embout de la pipette doit être 2 à 3 µm.
3. Placez les pipettes dans un porte-pot pour pipettes avec l’embout de la pipette vers le haut (voir Table des matières).
   ATTENTION : Effectuez des opérations 1.4-1.6 sous une hotte chimique bien aéré.
4. Mélanger le mélange de siliconage qui se compose de 1 goutte (~ 150 µL) de bis (diméthylamino) diméthyl silane et 10 gouttes de tétrachlorure de carbone (voir Table des matières).
5. Versez le mélange de siliconage dans le bocal et bien fermer le couvercle.
6. Incuber le bocal avec le mélange de siliconage pendant 24-48 h sous une hotte chimique à température ambiante jusqu'à ce que le mélange est complètement évaporé.
7. Remblayer la pipette avec la résine sélectives appropriée pour créer une colonne d’environ 2 à 4 mm.
   NOTE : Ionophore hydrogène j’ai cocktail B peut être utiliséspour enregistrement NHE activité (voir Table des matières).
8. Appuyez sur l’extrémité de la pipette pour répartir la résine sélectives à la pointe et placez la pipette verticalement dans le support de pot avec l’embout de la pipette vers le bas.
9. Checkunder le microscope à dissection que le cocktail de résine a atteint l’extrémité de la pointe. Si nécessaire, appliquer une pression positive pour pousser la résine jusqu’au bout.
10. Remblayer la moitié-pipette avec la solution appropriée (~ 100 μL). Ici, utilisez KCl 100 mM et 10 mM HEPES à un pH de 7.0 si vous utilisez ionophore j’ai cocktail B.
11. Connectez l’ISE à l’électromètre et placer l’embout de l’ISE dans la solution de bain utilisée pour l’enregistrement. Zéro l’électromètre.
12. Tester le H⁺-réponse sélective de ISE en changeant le pH de la solution du bain. Le moyen H⁺-réponse sélective de ISE est ~ 58 mV par unité de pH.
13. Évaluer périodiquement la réponse de l’ISE à l’étalonnage.

2. préparation du Patch Clamp Pipettes pour l’enregistrement

Remarque : La méthode décrite par Donald Hilgemann dans son article sur l’enregistrement du Single-Channel²¹ est recommandée.

1. Tirez sur les pipettes pour patch géant de capillaires en verre borosilicate (mmOD 2,0 / 1,5 mm ID) sur la pipette puller^2,22,23.
2. Utilisez une microforge montés sur la scène d’un microscope inversé pour faire une pipette large pointe (10-22 μm)²³. Faire fondre un boudin (~ 0,5 mL) de verre mou sur le fil de platine épais de la microforge.
   Remarque : Un fil de platine relativement épais est nécessaire (~0.5 mm) pour fabriquer des pipettes de patch géant.
3. Positionner la pipette à proximité de la perle de verre doux et appliquer de la chaleur totale jusqu'à ce que la pointe commence à s’estomper. Le fil de platine se déplace légèrement vers le centerduring de chauffage.
4. Eteignez le feu et pousser l’embout de la pipette dans la perle de verre. Le fil de refroidissement va se rétracter et casser l’embout de la pipette.
5. Réappliquer la chaleur pour lisser la pointe de pipette et créer un embout de la pipette du diamètre désiré. Le diamètre de la pointe dépend de la taille de la cellule pour être patché (8-10 μm dans cette étude).

3. préparation des cellules

1. Échauffement de la saline de tampon phosphate (PBS) sans Ca^{2 +} et Mg^{2 +}, solution de trypsine-EDTA et le milieu de culture à 37 ° C.
2. Laver les cellules deux fois avec du PBS. Utiliser 1 mL de tampon pour la plaque de culture cellulaire 35 mm de diamètre.
3. Ajouter 0,5 mL de trypsine aux cellules pour plaque de culture cellulaire 35 mm de diamètre.
   Remarque : Lorsque les cellules commencent à la rafle, secouer la plaque pour fixer hors des cellules.
4. Arrêter l’action de la trypsine en ajoutant 5 mL (quantité pour plaque de culture cellulaire 35 mm de diamètre) du milieu de culture complet additionné de sérum de veau fœtal 10 %.
   NOTE : Le temps de réaction à la trypsine est type cellulaire dépendante.
5. Placer les cellules sur un agitateur avec bascule pour éviter la formation de touffes.
6. Utiliser des cellules pour jusqu'à 2 h après la trypsinisation.
   Remarque : Le temps peut varier selon la lignée cellulaire.

4. Elaboration d’un système de Perfusion Intra-Pipette

1. Couper à la bonne taille du tube de quartz (150 µm OD / 75 µm ID) pour préparer la ligne de perfusion intra-pipette.
2. Insérez un côté du tube quartz dans un cône de pipette 200 µL. Coller le tube de quartz sur la pointe et coupez l’extrémité de la pointe avec une lame de rasoir tranchante.
3. Se connecter à la ligne de perfusion (tubulure de quartz collé à la pointe) à un petit morceau de tube de silicone qui pourrait servir de réservoir pour la solution de perfusion intra-pipette.
4. Raccordez le tuyau de silicone d’une seringue pour créer une pression positive.
5. Insérez l’extrémité libre du tube quartz à travers le tube de polyéthylène du titulaire de la pipette de la perfusion de port (voir Table des matières).
6. Évaluer la ligne de perfusion avec la solution de la pipette.

5. préparation des Solutions

1. Préparer une solution de la pipette fortement tamponnée pour enregistrement NHE (115 mM potassium aspartate (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl₂, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tuyaux de 12,5 mM, vadrouilles de 12,5 mM et 12,5 mM MES, pH 6,0 ajusté avec de l’acide aspartique).
   NOTE : Préparer la solution de la pipette stock et le filtre. Ajouter Mg-ATP avant l’enregistrement.
2. Préparer une solution de bain renouvelé chaque fois (140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂et 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).

6. enregistrement de l’activité de transporteur

1. Maintenir la chambre d’enregistrement et toutes les solutions à 37 ° C, parce que l’activité de transporteur est dépendante de la température.
2. Placer les cellules dans la chambre d’enregistrement. Attendez qu’ils laisser tomber au fond de la chambre, mais ne les laissez pas attacher à la chambre.
3. Choisissez une cellule appropriée. Mesurer le diamètre de la cellule avec le micromètre oculaire. Choisir les cellules avec un diamètre similaire.
   Remarque : En règle générale, une grande cellule aura surface plus cellulaire et éventuellement plusieurs transporteurs, exprimés sur sa membrane plasmique, donc aussi avoir plus d’activité de transporteur. Cependant, ce n’est pas nécessairement correct, comme activité de transporteur dépend du transporteur spécifique et le type de cellule à l’étude.
4. Monter la pipette de microélectrodes sélectives pour le micromanipulateur, remblayer la pipette serrage patch avec la solution intracellulaire, assurez-vous que la solution atteint l’extrémité de la pipette².
   Remarque : Il peut nécessiter plusieurs robinets douces pour éliminer les bulles d’air dans l’embout de la pipette.
5. Montez la pipette serrage patch au stade principal de l’électrophysiologie, mis en place^2,22,23.
   Remarque : Il est important de garder la scène tête à un angle de 45 degrés à l’axe horizontal, car cela garantit un angle d’entrée pour la pipette qui convient à la formation d’un joint très résistant.
6. Appliquez une petite pression positive (~ 5 cm H₂O) à la pipette pour réduire le risque de blocage de la pointe et le placer dans la solution du bain.
7. Arrêtez la pipette serrage une fois que l’extrémité se trouve à proximité de la cellule.
8. Soulager la pression positive tandis que pipette touche la cellule et appliquez une légère pression négative (~ 5 cm H₂O) pour obtenir un > 1000 joint MΩ (un Giga ohms) sur la membrane de la cellule avec le patch pipette²³.
9. Placez la pipette avec la cellule dans le plan focal de l’ISE, et déplacez la pipette avec la cellule à proximité de l’ISE (~ 5-10 µm)^2,5 , mais éviter permettant à la cellule contact l’ISE (Figure 1 a).
10. S’assurer que le potentiel de maintien est de 0 mV.
11. Briser le sceau avec la série des succions courtes pour obtenir la configuration cellule entière.
12. Déplacer l’ISE (ou une pipette de patch clamp) lentement de gauche-droite ou haut-bas pour enregistrer l’activité du transporteur (Figure 1 b).
13. Enregistrer au moins 5-8 pics (Figure 1, de A à B).
14. Appliquer des perturbations onde carrée lors de l’enregistrement pour surveiller la qualité de l’étanchéité et la capacité de la membrane cellulaire (Figure 1).
15. Estimer le flux de H⁺ () de la différence de concentration de H⁺ libre entre la surface de la cellule et la solution de vrac (ΔH⁺)
    
    
    Remarque : et sont H⁺ et tampon respectivement les coefficients de diffusion B_T est la concentration du tampon total, K_D est la constante de dissociation de la mémoire tampon, r est la cellule rayon, et détermine le changement de l’équilibre dans la concentration de lié H⁺ pour un petit changement dans H gratuit⁺. H⁺ indique un proton libre en solution. Pour être cohérent avec les études antérieures, H⁺ flux sont converties en unités de flux électrophysiologiques en calculant l’équivalent actuel des flux (/faraday) en pA^3,,⁵].
16. Normaliser le flux de protons à la surface des cellules qui peut être calculée de la dimension des cellules ou à la capacité de la membrane.

Résultats

Un auto-référentielle ISE au cours de l’enregistrement de cellules entières patch clamp a été appliqué pour étudier la régulation de l’activité NHE3 par phosphoinositides. PS120 cellules fibroblastes²⁴, qui n’ont pas l’expression de la membrane plasmique endogène NHEs, ont été utilisés. NHE3 sauvage (NHE3-wt) ou NHE3 mutants qui ne sont pas lier phosphoinositides [tyrosine 501, 503 d’arginine et la lysine 505 ont été remplacés par alanine, Y501A/R503A/K505A (NHE3-Y...

Discussion

Malgré les fonctions essentielles des transporteurs, les méthodes disponibles pour étudier leur activité sont inefficaces et insuffisants. Une seule limitation est que les méthodes disponibles mesurent mouvement ionique médiée par l’activité de transporteur sans tenir compte des fluctuations de la composition en ions intracellulaires au cours de l’expérience⁴. La méthode présentée permet un contrôle précis des compositions des ions intracellulaires et extracellulaires et offre un outil puissant po...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amplificateur de patch	Molecular Devices Électromètre
différentiel à double canal (HiZ-223)	Warner Instruments	64-1650
(DP-301)	Warner Instruments	64-0044
Logiciel de patch clamp Basé sur MatLab	MatLab avec boîte à outils		Le logiciel de capmètre est recommandé
Système de contrôle de température ThermoClamp-1	AutoMate Scientific	03-11-LL	Réchauffeur en ligne
Régulateur de température monocanal (TC-324C)	Warner Instruments	64-2400
Tube en verre borosilicaté standard à barillet unique	World Precision Instruments	1B120F-3  ;   ;	Utilisé pour les électrodes sélectives d’ions
Pot de stockage de micropipettes	World Precision Instruments	E212
Bis(diméthylamino)diméthylsilane	Sigma-Aldrich	14755-100ML
Tétrachlorure de carbone	Sigma-Aldrich	319961-500ML
Ionophore d’hydrogène I - cocktail B	Sigma-Aldrich	95293
Tube borosilicaté à paroi mince	; Sutter Instrument	B200-156-15	Utilisé pour pipette patch clamp  ;
Verre souple (Corning 8161 Patch Glass)	Warner Instruments	64-0815
Tube capillaire en silice (150um OD/75um ID)	Molex (Polymicro Technologies)	106815-0018	Utilisé pour le système de perfusion intra-pipette
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9333
Aspartate de potassium  ;	Sigma-Aldrich	A6558
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Chlorure	de magnésium Sigma-Aldrich	M4880
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
TUYAUX	Sigma-Aldrich	P6757
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
Chlorure	de calcium Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	H1758
Apyrase	Sigma-Aldrich	A6535
Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8	Echelon Biosciences	P-4508
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8	Echelon Biosciences	P-3908