Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Afin de coordonner la croissance avec son environnement, les plantes ont évolué des voies de signalisation élégants pour détecter, transmettre et répondre aux signaux de signalisation. Comme les coureurs dans une course de relais, les protéines sont les joueurs nécessaires dans la transduction du signal plante. Il a été largement reconnu que l’interaction protéine-protéine (PPI) joue un rôle majeur pour la communication cellulaire. Dégradation, l’acétylation et la phosphorylation des protéines sont tout dépendantes de l’interaction physique entre une protéine cible et ses enzymes de modification. Par exemple, les protéines de la famille Jasmonate ZIM-domaine protéique (JAZ) interagissent avec le facteur de transcription MYC2 et suppriment son activité transcriptionnelle^1,2. Compte tenu de l’importance du PPI, protéine à grande échelle, interactomes chez les plantes ont été exploré récemment^3,4,5. Ces résultats interactome révèlent le réseau réglementaire complexe qui coordonne les diverses fonctions cellulaires.

Il y a certaines approches établies pour le suivi des PPI. La levure deux hybride (Y2H) est la méthode la plus utilisée pour la détection de l’IPP. Y2H est facile à réaliser et adapté pour un test rapide examiner les interactions entre protéines. Y2H est également largement utilisé pour le dépistage des partenaires d’interaction inconnue pour la protéine d’intérêt spécifique. Cependant, parce que Y2H est entièrement réalisé dans la levure, il ne peut pas refléter le scénario réel en usine cellules et apporte la hautes taux de faux positifs. Une autre stratégie semblable est le test de menu déroulant. En général, deux protéines sont exprimées et purifiées à partir de cellules d’Escherichia coli mélangés et immobilisées pour détecter des interactions entre protéines. Bien que cette méthode n’est pas fastidieux, il ne peut obtenir en vivo résultats interaction non plus. Fins en vivo interaction, co-immunoprécipitation (co-IP) est l’analyse plus populaire, ce qui nécessite des anticorps de haute qualité pour l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt et ne peut pas exclure la possibilité des IPP indirecte. En outre, en raison des complexes procédures expérimentales dans co-propriété intellectuelle, les résultats varient généralement avec expertise individuelle.

Essais de reconstitution de journaliste basé avancent considérablement la détection in vivo PPI. Ces méthodes incluent la fluorescence resonance energy transfert (FRET)⁶, fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC)⁷et la complémentation de luciférase firefly imaging (LCI) test⁸. Bien que ces trois approches sont mieux que co-IP afin de refléter le direct en vivo PPI, frette et BiFC besoin spécifiques microscopes pour détecter les signaux de fluorescence et ne peut pas facilement quantifier l’intensité de l’interaction. En revanche, LCI profite de la luciférase firefly, qui s’allume après réaction avec son luciférine de substrat. Plus important encore, intensité de l’IPP peut être déterminée de la valeur de l’activité de la luciférase. Ainsi, LCI indique non seulement si les deux protéines interagissent ou pas, mais fournit également des informations sur la dynamique de l’interaction par traitement. Bien qu’il existe certaines méthodes établies pour surveiller l’interaction dynamique (fondée sur le surface plasmon resonance ou thermo-stabilité)^9,10, ces approches nécessitent des instruments délicats ou marquage spécifique. En revanche, LCI est plus facile à réaliser et à détecter.

Le principe pour LCI, c’est que les moitiés amino-terminale et c-terminal de la luciférase (appelé N-Luc ou C-Luc, respectivement) ont été fusionnés avec la protéine A et B ces fusion deux protéines ont été simultanément exprimés dans les cellules végétales. Si A protéine interagit avec la protéine B, alors les deux moitiés de la luciférase vont être reconstituées pour être une enzyme luciférase active. Activité de la luciférase peut être détectée avec une caméra CCD ou un luminomètre. Il n’est pas nécessaire d’obtenir des transformants stables pour LCI ; expression transitoire est suffisant pour obtenir un résultat de l’interaction de haute qualité.

ANNEAU de type E3 ubiquitine ligase photomorphogenic constitutive 1 (COP1) interagit avec une myriade de facteurs de transcription et favorise leur dégradation par le protéasome 26 s¹¹. Certains de ces facteurs de transcription COP1 ciblées sont les régulateurs positifs pour photomorphogenèse. Dans l’obscurité, COP1 interagit avec suppresseur du phytochrome A-105 1 (SPA1), qui améliore la COP1 E3 l’activité⁸. Après la perception de la lumière, photorécepteurs vont abroger l’interaction COP1-SPA1 pour inhiber l’activité COP1 et ensuite stabiliser COP1 substrats^12,13,14. Cet exemple illustre l’importance biologique de l’étudiant PPI et déterminer la dynamique PPI.

1. préparation des plantes (8 semaines)

1. Mettre 50 graines de Nicotiana benthamiana dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 1 mL de 5 % NaClO et solution à 0,1 % X-100 Triton (V/V) et laisser pendant 5 min stériliser les graines.
2. Rincer les graines à l’eau stérile 5 fois et suspendre les graines dans 200 µL d’eau stérile.
3. Soigneusement lieu de graines individuelles sur la surface de la gélose MS (1 L: 1 x sels de Murashige et Skoog, 10 g de saccharose, pH 5,8 (KOH), 1 % d’agar) avec pointes fines et plaques moyen magasin à 4 ° C pendant 3 jours pour synchroniser la germination.
   Remarque : Pour éviter la contamination microbienne, effectuez cette étape sur un banc propre. Il n’est pas nécessaire d’agiter le tube pendant la stérilisation.
4. Placer les plaques moyens dans des conditions de croissance normales (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 blanc intensité lumineuse) pendant 10 jours et puis transférez les plantules dans le sol.
   Remarque : Veillez à insérer des racines des plantules dans le sol et ne pas endommager les racines. Recouvrir le plateau d’un couvercle en plastique transparent du jour au lendemain pour conserver l’humidité.
5. Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance maîtrisée sur une 16 h/8 h lumière/obscurité cycle et 70 % d’humidité. 7 semaines N. benthamiana plants sont prêts pour l’infiltration d’Agrobacteriumtumefaciens (Figure 1A).
   NOTE : Arroser les plantes et lutter contre les ravageurs au besoin pour maintenir des plantes en bonne santé.

2. Expression transitoire dans les feuilles de N. Benthamiana (7-10 jours)

1. Livrer 150 ng de plasmides (plasmide contrôle pEGAD-HA-LUC, vecteur vide et plasmide construite pour LCI assay, dans ce cas, nous avons utilisé pCAMBIA1300-Nluc et pCAMBIA1300-Cluc pour construction de plasmide) dans la cellule compétente a. tumefaciens souche GV3101 avec un méthode standard d’électroporation.
2. La culture a. tumefaciens Luria-Bertani (LB) agar moyen (1 L: 10 g NaCl, extrait de levure 5 g, 10 g tryptone, 1,5 % d’agar) contenant 50 µg/mL de kanamycine et 50 µg/mL de rifampicine à 28 ° C pendant 4 jours.
   Remarque : Le choix des antibiotiques dépend du vecteur et la souche d’a. tumefaciens utilisée.
3. Ensemencer une simple colonie a. tumefaciens de chaque plaque dans 3 mL de milieu liquide LB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 50 µg/mL de la rifampicine et l’agiter à 220 tr/mn à 28 ° C pendant 24 h propager la culture cellulaire.
4. Transférer 75 µL de culture bactérienne dans 15 mL frais LB milieu liquide contenant 50 µg/mL de kanamycine et 50 µg/mL de rifampicine, il dilue par un facteur 200. Culture de la bactérie à 220 tr/mn à 30 ° C pendant environ 8 h, jusqu'à ce que OD₆₀₀ entre 0,5 et 1,0.
5. Transfert de la culture liquide a. tumefaciens dans des tubes à centrifuger 15 mL et centrifuger à 4 000 x g et 4 ° C pendant 15 min. jeter le surnageant et suspendre le culot dans 15 mL de solution de transformation pour laver le culot.
6. Tourner le tube à 4 000 x g et 4 ° C pendant 15 min et éliminer le surnageant. Répétez l’étape de lavage une fois de plus.
7. Resuspendre le culot dans 5 mL de solution de transformation et conserver pendant 2 h à température ambiante. Ajuster la densité des cellules pellet a. tumefaciens avec solution de transformation jusqu'à ce que la concentration finale de OD₆₀₀ est de 0,5, ou deux échantillons de mélange à volume égal pour des interactions de protéine appariés test.
8. S’infiltrer cellules suspendues sur la 4^ème au 7^ème feuilles avec une seringue sans aiguille de 1 mL (Figure 1B-C). Après infiltration, couvrez les plantes immédiatement avec un couvercle en plastique noir et placez le plateau dans l’obscurité pendant 12 h. Après cela, faire pousser des plantes comme d’habitude pour 2 à 4 jours avant la détection des activités LUC.
   Remarque : Choisir des feuilles saines de taille similaire. L’infiltration des quatre zones différentes dans une seule feuille est très bien.

3. détection d’activité de la luciférase (un jour)

Remarque : Il y a deux façons de contrôler l’activité de la luciférase. L’un est basé sur l’imagerie, et l’autre est de mesurer quantitativement l’activité de la luciférase.

1. Méthode d’imagerie
   1. Détachez une feuille infiltrée et mettre le feuillet sur MS-agar.
   2. Pulvérisation luciférine travail tampon sur la surface adaxiale des feuilles avec un vaporisateur de 50 mL. Conserver les matériaux dans l’obscurité pendant 5 min étancher l’auto-fluorescence de la chlorophylle.
   3. Utilisez un CCD refroidi par faible luminosité appareil (refroidi à-30 ° C) d’imagerie afin de capturer des images (Figure 2). Le temps d’exposition de lumière-déposer est de 50 ms, et temps de détection de luminescence est de 1 min.
      Remarque : Réglez les paramètres selon le manuel de la machine. Des températures plus basses permettra d’améliorer le rapport signal-bruit pour améliorer la qualité de l’image.
2. Vous pouvez également mesurer luminescence directement avec un luminomètre commercial.
   1. Soigneusement découpé de fragments de feuilles (environ 0,25 cm²) de la zone d’infiltration des feuilles N. benthamiana et plonger le disque de feuilles dans 100 µL d’eau déionisée dans une plaque à 96 puits blanche (Figure 3).
   2. Ajouter 10 µL de tampon de travail luciférine et laisser pendant 5 min. Effectuez des traitements spécifiques afin d’étudier la dynamique d’interaction de protéine.
      Remarque : Détecter la luminescence avec un luminomètre à des moments différents pour obtenir la dynamique de l’activité luciférase, qui représente la cinétique des interactions protéine-protéine sous certains traitements. Cette méthode a des avantages pour tester un grand nombre de paires de protéines en même temps. Pour ceux sans un luminomètre commercial, examiner l’abondance de protéine luciférase par western blot, donc se référer à la LUC activité quantitativement. Si la lumière n’est pas forcément nécessaire, juste garder la plaque dans le luminomètre et mesurer la luminescence à différents moments. Dans le cas contraire, déplacez le plateau dans une chambre de croissance pendant l’intervalle de détection. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, utilisez au moins trois réplicats biologiques. Bien que les activités LUC de zones différentes de l’infiltration peut varier, leur évolution est conformes après normalisation.

Trois étapes principales peuvent être singularisés dans ce protocole de complémentation de luciferase pour l’étude des protéines interactions in vivo, y compris la croissance des plantes, l’infiltration du tabac et le dosage de la luciférase. L’étape la plus cruciale dans le présent protocole est infiltrer liquide a. tumefaciens dans des feuilles de N. benthamiana (Figure 1).

Voici un exemple de l’utilité de cette technique confirmant le jasmonate de réduire les interactions COP1-SPA1. Les moitiés amino-terminale et c-terminal de la luciférase ont été fusionnés à COP1 (COP1-NLuc) ou SPA1 (CLuc-SPA1), respectivement. Les interactions COP1-SPA1 entraîner la complémentation de la luciférase fonctionnelle. L’activité de la luciférase a été photographiée par la caméra CCD (Figure 2), et l’activité enzymatique peut être détectée par un luminomètre (Figure 3). D’exclure la possibilité que luciférase elle-même est affectée par le traitement, le gène de la luciférase pleine longueur (LUC) a également été transitoirement exprimé en N. benthamiana feuilles pour servir comme un contrôle. L’activité de la luciférase avant traitement jasmonate (temps 0) a été définie comme 1, et ensuite chaque valeur de l’activité de luciférase obtenu dans le cadre de traitement de jasmonate a été normalisée avec temps 0 pour obtenir l’activité de la luciférase relative (Figure 4). Les résultats ont montré que les interactions de COP1-SPA1 (reflétées par l’activité de la luciférase) graduellement diminué dans l’obscurité, et que le traitement JA encore réduit leurs interactions.

Figure 1 . Processus d’infiltration N. benthamiana . 
(A) Abaxial et vue ventrale des plantes avant infiltration. (B) image représentative pour montrer le protocole d’infiltration. (C) Abaxial et vue adaxiale des plantes après infiltration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 . Activité de la luciférase sous caméra CCD en imagerie. 
(A) image représentative d’une feuille de N. benthamiana sous un champ de lumière normale. B détection des signaux de luminescence sous caméra CCD pour montrer les activités de la luciférase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. Une image représentative pour montrer comment mesurer la luminescence de coupe des disques foliaires. 
Des disques foliaires infiltrés ont été coupés et mis dans une plaque 96 puits blanche pour mesurer les signaux de la luminescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 . Représentant résulte d’une passagère complémentation de luciferase. 
(A) la durée du traitement (temps) et les résultats originaux de la valeur de luminescence (activité LUC) ont été répertoriés. Il y a trois répétitions indépendantes pour chaque échantillon. Pour la préparation de ce tableau, activité LUC aux points de temps de traitement différent a été normalisée avec temps 0 comme l’activité relative de LUC.
(B) Quantification de l’activité relative de LUC, montrant les interactions COP1-SPA1 dans l’obscurité progressivement diminué, qui peuvent être réduites par un traitement ultérieur JA. La barre d’erreur indique l’écart-type (sd). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.