Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour étudier une forme de neurostimulation chimique de wholemount rat rétines in vitro avec le neurotransmetteur glutamate. Neurostimulation chimique est une alternative prometteuse à la neurostimulation électrique conventionnelle des neurones de la rétine pour traiter la cécité irréversible causée par des maladies dégénératives de photorécepteurs.
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Article de méthode
Méthodologie pour la chimie biomimétique Neuromodulation des rétines de Rat avec le neurotransmetteur Glutamate In Vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
Maladies dégénératives photorécepteur causent la cécité irréparable par la perte progressive des cellules photoréceptrices de la rétine. Prothèses rétiniennes sont un traitement émergent pour les maladies dégénératives de photorécepteurs qui visent à restaurer la vision en stimulant artificiellement les neurones rétiniens survivants dans l’espoir de susciter une perception visuelle compréhensible chez les patients. Prothèses rétiniennes actuels ont fait preuve de succès dans le rétablissement de la vision limitée aux patients utilisant un tableau d’électrodes pour électriquement stimule la rétine mais font face à des obstacles physiques considérables pour restaurer l’acuité élevée, une vision naturelle aux patients. Neurostimulation chimique à l’aide de neurotransmetteurs natives est une stimulation alternative électrique biomimétique et pourrait contourner les limitations fondamentales associées à des prothèses rétiniennes à l’aide de neurostimulation électrique. Plus précisément, neurostimulation chimique a le potentiel de restaurer une vision plus naturelle avec acuités comparables ou supérieure aux patients par l’injection de très faibles quantités de neurotransmetteurs, les mêmes agents naturels de communication utilisés par la rétine produit chimique synapses, à une résolution beaucoup plus fine que les prothèses électriques actuels. Cependant, comme un paradigme de stimulation relativement inexploré, il n’y a aucun protocole pour parvenir à la stimulation chimique de la rétine en vitro. Le but de ce travail est de fournir un cadre détaillé pour l’accomplissement de la stimulation chimique de la rétine pour les chercheurs qui souhaitent étudier le potentiel de neuromodulation chimique de la rétine ou similaire des tissus neuraux in vitro. Dans ce travail, nous décrivons le montage expérimental et la méthodologie pour ganglionnaires rétiniennes cellulaire (RGC) spike réponses similaire à visual réactions légères en sauvage et wholemount photorécepteur-dégénéré rétine de rat en injectant contrôlée des volumes de le neurotransmetteur glutamate dans l’espace sous-rétinienne utilisant des micropipettes de verre et un dispositif microfluidique multiport personnalisé. Cette méthodologie et le protocole sont assez générales pour être adapté à la neuromodulation à l’aide d’autres neurotransmetteurs ou même d’autres tissus nerveux.
Introduction
Photorécepteurs des affections dégénératives, comme la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire liée à l’âge, sont en tête des causes héréditaires de perte de vision et sont actuellement incurables1,2. Bien que ces maladies proviennent d’une variété de mutations génétiques spécifiques, maladies dégénératives photorécepteurs sont caractérisés en tant que groupe par la perte progressive des cellules photoréceptrices de la rétine, qui finit par provoquer la cécité. La perte des déclencheurs de photorécepteurs généralisées transformant tout au long de la rétine, mais survivre les neurones de la rétine, y compris les cellules bipolaires et CGR, restent intactes et relativement fonctionnel même à un stade avancé de photorécepteur dégénérescence3 ,4,5,6,7.
Les mécanismes et les pathologies de ces maladies ont été bien caractérisé3,4,5,6,7 , mais un traitement efficace demeure insaisissable. Durant les trois dernières décennies, les chercheurs dans le monde entier ont étudié une variété de traitements thérapeutiques pour restaurer la vision de personnes atteintes de maladies dégénératives photoréceptrices dont gene therapy8, cellules souches traitement9, rétinienne transplantation10et stimulation artificielle11,12 des neurones rétiniens survivants. Parmi ceux-ci, le plus cliniquement disponibles sont des prothèses rétiniennes, qui sont des dispositifs de neurostimulation artificiels qui ont traditionnellement utilisé un tableau des électrodes pour stimuler électriquement les CGR ou cellules bipolaires en modèles spécifiques dans le but de création artificielles perceptions visuelles dans les patients11. Prothèses électriques de génération actuelle, comme l’Argus II13 et les Alpha-IMS14 périphériques, ont obtenu l’approbation clinique et des études préliminaires ont indiqué qu’ils peuvent améliorer la qualité de vie des patients en rétablissant une mesure de la vision à l’aide de deux épirétinienne (avant de la rétine) et subretinal (l’arrière de la rétine) implantés dispositifs15,16. Groupes de recherche du monde entier travaillent sur l’avancement des prothèses rétiniennes au-delà du succès de ces dispositifs de première génération17,18,19,20 , mais ont été confrontés à difficultés de conception d’une prothèse électrique capable de restaurer la vision acuité élevée au-dessous du niveau de cécité légale aux patients. Des études récentes ont montré que parvenir à une résolution spatiale supérieure à celle activée par la génération actuelle électrique basé sur prothèses est difficile en raison de la limite d’injection de charge, qui nécessite l’utilisation de grandes électrodes pour stimuler en toute sécurité neurones de la rétine au détriment de la résolution spatiale, c'est-à-dire l’acuité visuelle de11,21. En outre, la stimulation électrique est en outre limitée parce qu’elle stimule généralement toutes les cellules voisines et par conséquent suscite des perceptions peu naturelle et source de confusion chez les patients, en grande partie parce que c’est un paradigme de stimulation par nature contre nature21. Néanmoins, les premiers succès de la stimulation électrique ont démontré que cette neurostimulation artificielle peut être un traitement efficace pour les maladies dégénératives de photorécepteurs. Cela nous amène à émettre l’hypothèse qu’un traitement encore plus efficace pourrait être réalisable en stimulant la rétine avec des neurotransmetteurs produits chimiques, les agents naturels de communication aux synapses chimiques. La méthode présentée dans cet article vise à explorer la faisabilité thérapeutique de la stimulation chimique, qui cherche à imiter le système naturel de communication synaptique entre les neurones de la rétine, comme une stimulation alternative électrique biomimétique pour une prothèse de rétine.
Traduction de la notion de stimulation chimique thérapeutique d’une prothèse de rétine chimique dépend chimiquement activation des neurones rétiniens cible avec de petites quantités de neurotransmetteurs indigènes, comme le glutamate, libéré par un microfluidique dispositif comprenant un large éventail de microports en réponse à des stimuli visuels. De cette façon, une prothèse de rétine chimique serait essentiellement une couche de photorécepteur artificielle biomimétique qui se traduit par des photons naturellement pour atteindre la rétine aux signaux chimiques. Étant donné que ces signaux chimiques utilise les mêmes neurotransmetteurs utilisés dans la signalisation rétinienne normale et stimuler les neurones de la rétine survivants d’un dégénéré de la rétine à travers les mêmes voies synaptiques utilisée par les voies de la vision normale, le visuel qui en résulte perception grâce à une prothèse de rétine chimique pourrait être plus naturelle et compréhensible par rapport à un évoquée à travers une prothèse électrique. En outre, depuis le microports à travers lequel les neurotransmetteurs sont libérés peuvent être fait extrêmement petites et rangées à haute densité, à la différence des électrodes, un potentiel chimique prothétique peut être capable d’atteindre plus de stimulation focal et plus spatiale résolution à une prothèse électrique. Ainsi, une prothèse de rétine chimique basé sur ces avantages potentiels, offre une alternative très prometteuse à prothèses électriques.
La stimulation chimique de la rétine, cependant, a été relativement peu explorée jusqu'à une date récente. Alors que la stimulation électrique de la rétine a été bien caractérisée au cours de décennies de travail par le biais de in vitro22,23, in vivo23,24et des études cliniques13 ,14, études sur la stimulation chimique ont été limités exclusivement à quelques in vitro travaux25,26,27,28. Iezzi et Finlayson26 et Inayat et al. 27 a démontré épirétinienne stimulation chimique de la rétine in vitro en utilisant une seule électrode et un tableau multiélectrodes (MEA), respectivement, d’enregistrer les réponses de glutamate évoquée par des neurones de la rétine. Plus récemment, Rountree et al. 28 a démontré la stimulation différentielle des voies marche rétiniennes à l’aide de glutamate du côté sous-rétinienne et un AME pour enregistrer les réponses neuronales de plusieurs sites sur la rétine.Bien que ces travaux ont établi préalablement la faisabilité de la stimulation chimique, plus amples études sont essentielles pour enquêter sur plusieurs aspects de cette approche au-delà de celles adressées jusqu'à25,26,27 , 28et d’affiner les paramètres de stimulation thérapeutique dans des modèles animaux in vitro et in vivo avant de traduire ce concept à une prothèse de rétine chimique tel que discuté ci-dessus. Cependant, actuellement, il n’y a aucune méthodologie établie pour l’accomplissement de la stimulation chimique de la rétine dans la littérature et les méthodes utilisées dans les travaux antérieurs n’ont pas été décrits en détail comme ce serait essentiel pour études réplicatifs. La raison d’être de cet article des méthodes est donc de fournir un cadre bien défini pour la conduite in vitro la stimulation chimique de la rétine pour les chercheurs intéressés dans la reproduction de nos précédentes études27, soit 28 , ou encore faire progresser ce concept naissant de la neurostimulation chimique.
Nous démontrons une méthode pour la réalisation in vitro la stimulation chimique des neurones de la rétine dans la wholemount de rétine de rat sauvage et un modèle de rat dégénérées de photorécepteurs qui imite étroitement la progression du photorécepteur dégénérative maladies chez les humains. La raison d’être de développer cette méthode de stimulation dans des modèles in vitro consiste à évaluer les gammes thérapeutiques divers paramètres de stimulation et d’étudier les caractéristiques de la réponse neuronale qui seraient impossibles ou difficiles à observer dans dans vivo modèles, surtout pendant les premières études axées sur l’évaluation de la faisabilité de cette approche. Nous montrons dans cette procédure, site unique et simultanées sur plusieurs sites des stimulations chimiques des rétines en livrant des petites quantités de glutamate 1 mM près de neurones rétiniens cible via micropipettes verre disponible dans le commerce de port unique et personnalisée dispositif de micro-usines de microfluidique multi-ports, respectivement. Alors que les stimulations fois site unique et multi-sites accomplir l’objectif fondamental d’étudier la faisabilité thérapeutique de neuromodulation chimique, chacun répond à un objectif distinct avec un avantage unique. La stimulation d’un site unique, qui peut être accomplie avec micropipettes verre tiré préalablement disponibles dans le commerce, peut être utilisée pour injecter des produits chimiques directement dans le sous-sol de la rétine sur un seul site et sert à vérifier si RGC observable spike taux les réponses qui ressemblent à des réponses légers visuellement évoquées peuvent être déclenchés focalement sous le site de l’injection. En revanche, la stimulation multisite, qui exige un dispositif microfluidique multiport spécialement fabriquées, peut être utilisée pour injecter des produits chimiques dans l’espace à de nombreux endroits sur la surface de la rétine et sert à étudier comment bien évoquée par le glutamate RCG profils de réponse correspondent aux modèles injection glutamate dans les études de stimulation modèle.
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies par Guide du Conseil National de recherches pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Protocoles de manipulation et de l’euthanasie animales ont été examinées et approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de l’Illinois à Chicago.
1. modèles animaux
- Rats Long-Evans sauvage
- Se procurer un 24-32 jours vieux sauvage Long Evans Hooded chez les rats des deux sexes a soulevé avec un rythme de jour/nuit standard 12 h.
- Obscurité adapter le rat en le plaçant dans une pièce complètement sombre pendant 1 h avant de commencer l’expérience.
- S334ter-3 rats
- Franchir la transgénique albino homozygote S334ter-3 rat ligne (ou l’autre sexe), exprimant deux copies du gène mutant rhodopsine, avec un rat de Long-Evans sauvage pigmenté pour produire des rats S334ter-3 hétérozygotes pigmentées qui présentent une dégénérescence des photorécepteurs semblable dans la progression humaine rétinite pigmentaire29,30.
- Élever la progéniture hétérozygotes avec rythme jour/nuit standard 12 h et utiliser des rats des deux sexes pour les expériences des âges suivants correspondant les phases suivantes de la dégénérescence des photorécepteurs : dégénérescence de stade précoce : 14-20 jours ; Dégénérescence de la scène du milieu : 21-27 jours ; La dégénérescence étape fin : 28-35 jours ; Complètement aveugle : > 50 jours.
- Obscurité adapter le rat en le plaçant dans une pièce complètement sombre pendant 1 h avant de commencer l’expérience.
2. préparation des Ames Solution moyenne et système de Perfusion
Figure 1 : schéma du montage expérimental. Schéma de l’installation expérimentale pour la stimulation chimique à l’aide d’une micropipette de verre (A) et un dispositif microfluidique multiport personnalisé (B). La rétine est placée sur un pMEA et continuellement perfusée avec douce et oxygénée Ames solution moyenne par le haut et le bas à travers les perforations pMEA. Signaux réponse neurale ramassés par les électrodes de la pMEA sont introduits par le biais de l’amplificateur de la MEA dans un ordinateur d’acquisition de données. Stimulation visuelle et chimique sont effectuées en utilisant une LED verte et un injecteur de pression 8 canaux, respectivement, et les deux stimuli sont déclenchées par un ordinateur dédié stimulus, qui est également utilisé pour positionner la pipette via une précision 3 axes micromanipulateur. Un microscope inversé est utilisé pour observer la rétine pendant une expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : montage expérimental. (A) photographie du montage expérimental complet montrant les positions relatives de tous les composants. Le système d’amplificateur MEA est posé sur un microscope inversé, qui est utilisé pour l’inspection visuelle de la rétine et l’image numériquement l’interface périphérique-rétine au moyen de la caméra attachée à grande vitesse pendant l’expérience. Perfusion supérieure et inférieure sont contrôlés indépendamment à l’aide d’un système de perfusion contrôlée par solénoïde. Injection, contrôle de position et mesures d’impédance sont accomplis à l’aide d’un injecteur de pression et micromanipulateur amplificateur de patch clamp (orange box ; indiqué plus en détail en B), respectivement. La micropipette ou le dispositif est inséré dans un patch clamp préamplificateur pour mesures d’impédance et monté sur un portique (indiqué par catégorie verte ; plus amplement détaillé dans C) pour faciliter le positionnement à l’aide d’un micromanipulateur. (B) un gros plan sur les instruments de mesure et de contrôle utilisés dans l’expérience : l’injecteur pression 8 voies, système de contrôle de micromanipulateur, patch pince amplificateur pour la mesure de l’impédance et le navire d’aspiration pour l’élimination de la perfusion. (C) un gros plan du portique de système d’injection montrant un dispositif multiport interfacé avec le titulaire de la pipette, patch clamp préamplificateur et micromanipulateur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : installation de Perfusion. Photographie (A) de la partie supérieure de l’amplificateur MEA montrant l’emplacement de la perfusion d’albums et d’aspiration ainsi que la LED verte utilisée pour la stimulation visuelle de lumière. (B) un gros plan de la chambre de perfusion pMEA illustrant les emplacements précis de la perfusion d’albums et d’aspiration, le pMEA et l’électrode de référence utilisé pour la mesure de l’impédance. (C) une microphotographie de la plaque de fond perfusion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Remarque : Voir la Figure 1, Figure 2et Figure 3
- Mesurer 900 mL d’eau déminéralisée à température ambiante (~ 21 ° C) et mettre dans le récipient de 1 L.
- Perfuse l’eau avec 100 % de CO2 à l’aide d’un mécanisme de propagation.
- Ajouter 8,8 g du milieu des Ames en poudre à l’eau dans le récipient de 1 L.
- Rincer le récipient moyen des Ames avec quelques mL d’eau déminéralisée pour éliminer toute trace du milieu des Ames en poudre et ajouter au conteneur de 1 L.
- Ajouter 25,3 mL de solution de bicarbonate de sodium (7,5 % w/v31) au conteneur de 1 L.
- Ajouter de l’eau supplémentaire pour porter la solution à un volume final de 1 L.
- Continuer perfusant l’eau avec du CO2 pendant environ 5 min.
- Arrêter la perfusion de CO2 et commencer la perfusion de solution avec un mélange de gaz de qualité médicale de 95 % O2 et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min ou jusqu'à ce que le pH se stabilise à 7,4.
NOTE : Aux fins du présent protocole, le médium Ames est conservé à la température ambiante (~ 21 ° C) pendant toute l’expérience pour empêcher CO2 ou O2 de dégazage, qui peuvent obstruer les lignes de perfusion avec bulles d’air. - Nettoyez les tubes de perfusion dessus et en le remplissant d’éthanol à 70 % et puis laver les deux lignes 3 fois avec de l’eau déminéralisée. Remplissez la ligne de fond avec de l’eau désionisée et la ligne supérieure avec de l’air.
3. préparation de la rétine Wholemount
Figure 4 : préparation de Dissection et wholemount de la rétine. (A) photographie d’un œilleton intact provenant d’un animal de photorécepteur-dégénéré. Photomicrographie (B) de la rétine avec des coupes longitudinales à aplatir. (C) après aplatissement de la rétine, il est placé sur une grille à maille avec le côté de photorécepteur communiquant avec la maille et aplaties dans l’air (à l’extérieur du milieu de perfusion) pour s’assurer qu’ya pas de plis ou bords recourbés. (D) le maillage et la rétine sont rapidement transférés à la pMEA avec le côté de cellules ganglionnaires communiquant avec les électrodes et immédiatement perfusés avec milieu oxygéné de Ames. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : tableau multiélectrodes perforé. (A) photographie du tableau multiélectrodes perforé utilisé dans le protocole. La rétine est placée sur le tableau de l’électrode (indiqué par le rectangle rouge, ce qui est indiqué en détail dans B) dans la chambre de pMEA pour permettre la perfusion continue avec oxygénée médium Ames. (B) une microphotographie des électrodes s’illustrant la disposition des perforations entre les électrodes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Remarque : Voir la Figure 4 et Figure 5
- En utilisant un ordinateur de poche lampe de poche LED rouge pour fournir un éclairage rouge dim, euthanasier l’animal par asphyxie du dioxyde de carbone, suivie de la dislocation cervicale ou une autre méthode choisie, selon des protocoles IACUC.
- Enucleate les deux yeux avec une pincette #5 un bijoutier et placez les yeux énucléés dans une boîte de Pétri diamètre 60 mm avec environ 3-4 mL de solution moyenne de Ames de douce et oxygénée.
- Observant le œil à travers un stéréomicroscope de dissection avec illuminateurs supérieur et inférieur couverts avec un filtre rouge, faire une petite incision dans la cornée face à l’aide d’un scalpel ou une paire de ciseaux pointus.
- Coupé de cette petite incision au bord de la cornée, puis étendre la coupe dans une section circonférentielle autour de bord complet de cornée. Retirez la cornée maintenant jumelée avec la lentille, les humeurs aqueuses et vitreous translucides.
- Tout en tenant doucement le œilleton avec une paire de pinces, soigneusement de faire deux petites incisions sur les côtés opposés de le œilleton. Ensuite, utilisez deux paires de pinces pour séparer le œilleton dans chacune des incisions en douceur et séparer la rétine de la sclère. Soulevez lentement la rétine entière de la sclérotique et le œilleton. Couper le nerf optique, si il est encore attaché.
- Faire des coupes longitudinales dans la rétine pour obtenir la moitié ou des quarts de section à l’aide de ciseaux et ensuite délicatement étalées une section rétinienne sur une maille en nylon (100 µm diamètre de filetage avec 350 µm d’ouverture) avec le ganglion cellules (côté concave de la rétine) loin de la maille.
- Placer le treillis et la rétine sur un tableau multiélectrodes perforé (pMEA) avec les cellules de ganglion en contact avec la surface pMEA. Ensuite, placez délicatement une grille pondérée tranche sur le dessus de la maille pour maintenir la rétine en place.
4. MEA et installation d’Acquisition de données
Figure 6 : exposition des pMEA. (A) enregistrement représentant un sous-ensemble des électrodes pMEA présentant un bruit persistant élevé. Ce bruit est généralement dû au manque de contact approprié entre les plots de contact pMEA et les broches de l’amplificateur de la MEA en raison de l’usure normale de la couche mince de polyimide perforé sur le pMEA, surtout sur les plots de contact. L’autre source possible de bruit est généralement une fuite sur les plots de contact pMEA amplificateur de solution. Un bruit persistant en raison de la mauvaise broche contacter et/ou fuite de solution sur le contact tampons peuvent habituellement être corrigés en décalant la position de la pMEA au sein de l’amplificateur pour obtenir le meilleur contact et de nettoyage et de séchage les pads, respectivement. Si le bruit ne peut être éliminée par le nettoyage ou le déplacement de la position des pMEA, le pMEA auront besoin d’être remplacées entièrement. (B) enregistrement représentatif du niveau de bruit d’un sous-ensemble des pMEA électrodes d’un pMEA propre avec bon contact entre la pMEA et amplificateur. En règle générale, le niveau de bruit moyen se trouve ±16 µV. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Remarque : Voir la Figure 6
- Sous illumination rouge dim, placez pMEA dans amplificateur MEA et fermer les loquets de l’amplificateur.
- Si les repères ne sont pas déjà présents sur l’anneau de chambre pMEA, etch deux « X »-marques en forme espacement d’environ 5 mm dans un endroit facilement visible d’en haut avec le microscope monté sur perche.
- Positionner la prise de perfusion supérieure à l’intérieur de la chambre pMEA et mettez la vanne de perfusion supérieure pour atteindre un taux de perfusion d’environ 3 mL / minute. La position de la bouche d’aspiration supérieure au niveau du perfusat désirée (environ 5 mm de profondeur) et s’assurer qu’il fonctionne.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition de données sur l’ordinateur d’acquisition de données et cliquez sur le bouton « play » pour commencer à recevoir des données. S’assurer que tous les canaux pMEA sont silencieux et d’enregistrement des signaux neuronaux.
- En regardant une image numérique en direct du champ de vision microscope inversé sur un moniteur, observer la surface inférieure de la pMEA pour preuve que la solution circule dans la plaque de fond perfusion.
5. le Glutamate Stimulation préparation
Figure 7 : verre de micropipette et dispositif microfluidique multiport. (A) un porte-pipette avant d’insérer une micropipette ou périphérique. L’électrode d’argent/chlorure d’argent (50 µm de diamètre) est électriquement couplé à la carte sur la fin en interface avec le patch clamp préamplificateur. (B) une photographie de la micropipette verre interfacé avec le titulaire de la pipette, montrant l’emplacement de l’orifice de pression utilisé pour lancer des injections pneumatiques. (C) un dispositif microfluidique multiport personnalisé (1 cm 1 cm cm 0,134) attaché à un élément 3D-imprimé sur mesure et interfacé avec le titulaire de la pipette à travers un tube en acier inoxydable. L’appareil, qui a été fabriqué en deux couches, a huit microports (diamètre 14 µm) dans la couche inférieure (340 µm d’épaisseur) et huit réservoirs sur puce (diamètre 1,6 mm) pour le stockage de glutamate dans la couche supérieure (1 mm d’épaisseur). Chacun des huit microports dans la couche inférieure de l’appareil est connecté indépendamment d’un réservoir sur puce dans la couche supérieure via un microchannel dans le plan et chaque réservoir sur puce, à son tour, est connecté à un port de pression de l’injecteur de pression 8 canaux via une tube flexible pour actionner indépendante de la microports pour les injections multisites à motifs. (D) un gros plan du dispositif multiport tenu par la pince à épiler avant de fixer le luminaire d’interface tube montrant la disposition des huit réservoirs de sur puce adressables indépendamment et entrées de tuyaux. (E) une microphotographie de la surface inférieure de l’appareil, montrant la microports de huit 14 µm de diamètre disposés dans une configuration de 3 x 3 avec un espacement 200 µm pour s’aligner avec les électrodes de la pMEA. Les huit à l’extérieur de microports sont utilisés pour les injections multisites, tandis que le port central servait strictement pour l’alignement au cours de la fabrication de l’appareil. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Remarque : Voir la Figure 7.
- Préparer la solution de glutamate en mélangeant stock glutamate solutionwith oxygénée Ames solution moyenne pour obtenir un échantillon de 0,5 mL à un travail de concentration de glutamate de 1 mM.
- Insérez avec précaution une micropipette préalablement tiré 10 µm de diamètre ou la tige d’acier inoxydable relié au dispositif microfluidique multiport dans un support de pipetage par défaut contenant une électrode métallique de 50 µm de diamètre argent/chlorure d’argent.
Remarque : Si la détection de l’impédance n’est pas disponible, le fil-électrode argent/chlorure d’argent peut être omis. - Le titulaire de la pipette avec le préamplificateur de patch clamp d’interface et branchez la connexion luer pression au port du titulaire de la pipette sur le canal 1 du système d’injection pression, si utilisant une micropipette de verre ou brancher les raccords de luer de port de pression de chacun des les ports de 8 injection avec canaux 1-8 du système pression d’injection, si vous utilisez l’appareil multiport.
- Manuellement mettre en marche le système d’injection de la pression et tourner sur le canal 1 (ou les canaux 1-8, selon le cas). S’assurer que le système est évacué dans l’atmosphère et la valeur de la pression d’injection de 0,1 lb/po2.
- Allumez micromanipulateur et étalonner en appuyant sur le bouton « Calibrer » sur le contrôleur de manipulateur. Positionner le micromanipulateur afin que la pointe d’une micropipette (ou le fond de l’appareil, selon le cas) est d’environ 30 mm au-dessus de l’amplificateur de la MEA.
- Remplissez une petite boîte de Pétri avec solution de glutamate (glutamate de 1 mM au milieu de Ames standard) et placez-le sous le micromanipulateur. Abaisser la micropipette pointe (ou l’appareil) dans la solution et le remplissage en appuyant sur le bouton « Fill » sur le système d’injection de pression (pression d’aspiration -13 H2O) jusqu'à ce qu’il y a environ 20 mm de solution visible dans une micropipette de verre ou le tube appareil multiport.
- Si vous utilisez l’appareil multiport, retourner canal 1 de l’injecteur de pression au large et recommencer le protocole pour les canaux 2-8. Soulevez la pointe de la micropipette ou le périphérique hors de la solution, supprimer la boîte de Pétri et placez le micromanipulateur au-dessus de la chambre pMEA.
- En utilisant un stéréomicroscope boom-stand-monté, alignez l’extrémité d’une micropipette ou les coins de l’appareil avec les repères gravés sur l’anneau de chambre pMEA. Mémoriser les positions manipulateur dans le logiciel de contrôle avec les boutons « Magasin référence A » et « Magasin référence B » (ou simplement noter les coordonnées de manipulateur manuellement) pour mapper le système de coordonnées du manipulateur avec les électrodes pMEA.
- En utilisant le logiciel de contrôle de manipulateur, sélectionnez une électrode de pMEA cible avec la robuste activité spontanée et cliquez sur le bouton « Move au canal » pour aligner le verre micropipettewith l’électrode de cible.
6. l’interface avec la rétine
- Si la mesure d’impédance est disponible, mettez amplificateur de patch clamp et lancer le logiciel de visualisation de l’impédance en cliquant sur le bouton « Start » pour visualiser l’impédance de l’électrode d’argent/chlorure d’argent dans le porte-pipette. Tout en observant les signaux en temps réel d’impédance, abaissez lentement la micropipette ou l’appareil jusqu'à ce qu’il touche la surface rétinienne, comme en témoigne une augmentation rapide de l’impédance du signal (voir Figure 8). Enregistrez ou prendre note de la position de la surface rétinienne.
- Si la mesure d’impédance n’est pas disponible, détecter un contact avec la surface rétinienne par observation visuelle, bien que ce sera moins précis. Abaissez la pipette ou l’appareil jusqu'à ce qu’il touche visiblement la surface supérieure de la solution moyenne Ames dans la chambre de la MEA.
- Puis, tout en observant la partie supérieure de la rétine avec un microscope inversé, abaissez lentement la pipette ou l’appareil jusqu'à ce que la surface supérieure de la rétine est visiblement altérée, ce qui indique que le contact a été établi avec la surface rétinienne. Enregistrez ou prendre note de la position de la surface rétinienne.
- Pour la stimulation de la subsurface, abaisser la pipette une autre 40 µm (pour S334ter-3 rétines) ou 70 µm (pour les rétines de type sauvage).
- Effectuer quelques injections de courte durée (10 à 30 ms) en utilisant le système d’injection (0,1 lb/po2) la pression afin de déterminer si les cellules près de l’extrémité d’une micropipette ou dispositif microports sont réceptifs à la stimulation de glutamate en observant les signaux neurones avec acquisition de données logiciel.
NOTE : Injections réussies vont susciter une inhibition de rafale ou hampe de taux spike bien visible (voir Figure 9). Si aucune réponse n’est observée, repositionner la micropipette ou dispositif à une électrode de différente.
Figure 8 : mesure de l’impédance. (A) une représentation schématique de la technique de mesure d’impédance. À l’aide de l’amplificateur de patch clamp, l’impédance de la micropipette est surveillée de façon continue comme elle s’abaisse lentement vers la surface rétinienne. Lorsque la micropipette est supérieure à la rétine, la conductivité ionique relativement élevée du médium Ames se traduit par une lecture de faible impédance. Comme la micropipette fait contact avec la surface rétinienne, la conductivité ionique à travers le fil d’argent/chlorure d’argent est réduite, provoquant une augmentation rapide de l’impédance mesurée. (B) un terrain affichant le changement d’impédance enregistré juste avant et après le contact de l’embout de la pipette avec la surface rétinienne. L’impédance mesurée est relativement faible lorsque la pointe d’une micropipette est en solution juste avant le contact (indiqué par la région orange sur la gauche). Une fois que le contact est établi (indiqué par la flèche rouge et la zone verte sur la droite), l’impédance augmente rapidement en raison de la conductivité ionique réduite lors du contact avec le tissu rétinien. Dans la pratique, la surface rétinienne est enregistrée comme la hauteur correspondant au début de la forte augmentation de l’impédance mesurée (l’emplacement de la flèche rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : électrode enregistrements de l’activité neuronale au cours de visual, spontanée et glutamate injection. (A) des enregistrements représentatifs de neuf pMEA électrodes montrant le passe-haut filtré données électrode au cours de la stimulation visuelle de lumière avec une LED verte où chaque rectangle montre les données de neurones d’une électrode unique. Chaque électrode enrégistrement données recueillies dans la première seconde après avoir allumé le voyant vert (minutage indiqué avec des flèches orange dans chaque parcelle) d’une échelle commune de tension indiquée sur les axes de gauche. Pointes ont été identifiés à l’aide d’une tension de seuil de-18 µV (ligne rouge horizontale dans chaque parcelle de l’électrode) et sont représentés par les traces noires sur les données de l’électrode verte. Stimulation visuelle a provoqué une rafale de pointes (excitation) dans toutes les électrodes sauf le haut au centre un, qui possédait une réponse inhibitrice à la lumière. (B) un terrain similaire pour les mêmes électrodes montrant une activité neuronale spontanée sans stimulation visuelle ou injection. Bien que plus petits éclats étaient présents, les patrons de pointes étaient très différentes de celles enregistrées en réponse à des stimuli visuels. (C) enregistrements représentatifs du même sous-ensemble d’électrodes observée immédiatement après une injection de glutamate à l’électrode centrale (délais indiqués par les flèches orange dans chaque parcelle). Le glutamate injecté a suscité une rafale de pointes dans l’électrode centrale très similaire pour les éclats visuellement évoquée par spike. Toutes les autres électrodes ont été affectés par l’injection de glutamate, ce qui démontre la fine résolution spatiale de la technique de stimulation chimique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
7. lancer enregistrement rétinienne et programme de stimulation
- Orienter la LED verte vers la surface de la rétine. Commencer l’enregistrement en utilisant le logiciel d’acquisition de données sur l’ordinateur d’enregistrement dédié en tapant le nom du fichier et en cliquant sur le bouton « enregistrer ».
- Une fois que l’enregistrement a démarré, ouvrez le programme de contrôle de stimulus et charger le fichier de stimulation par défaut en cliquant sur le bouton « Lire le fichier Stimulus ». Ensuite, cliquez sur le bouton « Exécuter le fichier de Stimulus » d’ouvrir le fichier de stimulation par défaut consistant en le protocole d’acquisition de stimuli et de données décrit dans la note ci-dessous.
NOTE : (i) 30 essais de 2 ON s et 2 s de plein champ OFF flash (5 lm/m2 intensité) à l’aide de la LED verte. (ii) 120 s de données sans utiliser la LED verte pour enregistrer l’activité spontanée de la rétine sur une échelle de temps similaire. (iii) 1 ou plusieurs séries d’injections de glutamate consistant en 30 essais d’injections de glutamate à 0,1 psi avec injection de 10 à 30 ms fois (environ 100-300 pL par injection) et 3 s inter-impulsions durées. Dans le cas de sites multiples injections, sélectionner 2 ou plusieurs ports d’injecter simultanément.
Figure 10 : histogrammes des histogrammes des réponses au glutamate et visuels, spontanée,. (A) les histogrammes représentant histogrammes (30 ms binwidth) des données du sous-ensemble des électrodes en Figure 9 a, spike moyennée sur 20 essais de stimulation visuelle de lumière. Un barème de taux commun spike a été appliqué à toutes les électrodes et est indiqué sur les axes de gauche. La ligne noire dans chaque parcelle de l’électrode représente le taux de pointe moyenne pour tous les pics enregistrés au cours de la première seconde après avoir allumé la LED verte. Comme peut être vu, stimulation visuelle a provoqué une réponse de taux de spike excitateurs transitoire à toutes les électrodes sauf l’électrode de haut au centre, qui a eu une réponse transitoire inhibitrice à la lumière. (B) les réponses de la fréquence moyenne spike spontané enregistrement les mêmes électrodes sans aucune stimulation visuelle ou chimique. Sans stimulation, les tarifs de spike pour chacune des électrodes sont relativement constants. (C) les réponses de vitesse de pointe moyenne observée aux mêmes électrodes en réponse à une injection de glutamate à un emplacement au-dessus de l’électrode centrale. La réponse seulement transitoire évidente est la réponse excitatrice à l’électrode directement sous le site de l’injection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Résultats
Ce protocole peut être utilisé pour stimuler chimiquement les rétines normales, sauvage ainsi que photorécepteur dégénéré rétines, malgré le remodelage cellulaire importante causée par la perte des photorécepteurs. Avant commencer expérimente chaque photorécepteur dégénéré ou sauvage rétines, le besoin de matériel (Figure 1 et Figure 2) enregistrement et stimulation à être peaufiné et le pMEA (Figure 5
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Discussion
La méthode présentée ici montre un paradigme unique stimulation neurale, dans laquelle les neurones de la rétine sont stimulés chimiquement par injection de produits chimiques native neurotransmetteur dans le sous-sol de la rétine in vitro. Cette technique de stimulation chimique offre plusieurs avantages sur la technique de stimulation électrique conventionnelle, dont la sélectivité et une grande spécificité focale des neurones de la cible. Le protocole au-dessus de détails comment petits volume pneumatique des...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le travail présenté dans le document a été pris en charge par la National Science Foundation, nouvelles frontières dans la recherche et le programme d’Innovation (NSF-EFRI) accorde nombre 0938072. Le contenu de ce document n’engagent que la responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la NSF. Les auteurs souhaitent également remercier Dr Samsoon Inayat pour son travail, concevoir et tester l’installation expérimentale initiale pour la stimulation chimique et M. Ashwin Raghunathan pour son travail de conception, fabrication et évaluer le dispositif microfluidique multiport utilisé dans Cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réseau de microélectrodes, disposition perforée | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| Amplificateur MEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Plaque de sol à perfusion inférieure pour pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| Micromanipulateur motorisé 3 axes | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Système de contrôle de micromanipulateur | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Style Portique support de micromanipulateur avec glissière linéaire | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| Injecteur de pression multicanal programmable à 8 canaux | OEM : MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Fournisseur : Harvard Apparatus UK | PM-8000 ou PM-8 | OEM : http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Fournisseur : https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Amplificateur de patch de serrage intégré | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A a été remplacé par un modèle plus récent Axopatch 200B : https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Kit de déchets sous vide | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Porte-pipette | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pré-tiré 10 &mu ; Micropipettes en verre de diamètre m | Precision Instruments, Sarasota, Floride | TIP10TW1 | Stéréomicroscope https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom | Nikon, Tokyo, Japon | SMZ-745T | |
| https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 Support de perche de microscope avec double bille linéaire bras de roulement | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Microscope stéréo zoom avec C-LEDS Support LED hybride | Nikon, Tokyo, Japon | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Système de microscope inversé | Nikon, Tokyo, Japon | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| Acide L-glutamique (glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Bicarbonate de sodium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| boîte de Pétri de 60 mm (10 mm de hauteur) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | boîte de Pétri transparente de 60 mm ; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Lame de scalpel standard #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Manche de scalpel #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tübingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Grille à tranches de harpe | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl à électrodes de référence Pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| Système de perfusion par gravité contrôlé par soupape à 4 canaux | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS caméra microscope | Andor Technology, Belfast, Royaume-Uni | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| fil d’argent (50 &mu ; m de diamètre) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tube de microalésage Tygon (1,6 mm de diamètre) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-06419-01 | Porte-outil | |
| inclinable https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 avec canule | en acierALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | L’un d’entre eux a été utilisé pour la perfusion supérieure et l’aspiration ; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Fabricant : http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Fournisseur : https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Lampe de poche Wesson Galaxy Red | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Fabricant : https://www.smith-wesson.com/ Fournisseur : http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements : Logiciel de recherche de base | Nikon, Tokyo, Japon | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
Références
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