Article de méthode

Pré conditionnement les voies respiratoires des souris à la bléomycine augmente l’efficacité de la prise de greffe orthotopique Lung Cancer Cell

DOI :

10.3791/56650

⸱

28 juin 2018

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1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les auteurs décrivent une méthode pour améliorer significativement la greffe orthotopique de cellules de cancer du poumon dans les poumons murines en préconditionner les voies respiratoires avec des blessures. Cette approche peut également être appliquée pour étudier les interactions stroma dans le microenvironnement de poumon, la diffusion métastatique, la comorbidité de cancer du poumon, et pour produire plus efficacement les patients issus des xénogreffes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cancer du poumon est une maladie réfractaire de traitement mortelle qui est biologiquement hétérogène. Pour comprendre et traiter efficacement le spectre clinique complète de malignités thoraciques, des modèles animaux supplémentaires qui peuvent récapituler les étapes et les sous-types de cancer de poumon humain diverses sont nécessaires. Une allogreffe ou xénogreffe modèles sont polyvalents et permettent la quantification des capacité tumorigènes in vivo, en utilisant des cellules malignes d’origine murine ou humaine. Cependant, les méthodes décrites précédemment de greffe de cellule pour le cancer du poumon ont été effectuées dans des sites non physiologiques, tels que le flanc de la souris, en raison de l’inefficacité de l’orthotopic transplantation de cellules dans les poumons. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour améliorer la prise de greffe orthotopique lung cancer cell en préconditionner les voies respiratoires des souris avec la bléomycine agent inducteur de la fibrose. Comme une expérience de validation, nous avons appliqué cette approche pour greffer des cellules tumorales du sous-type adénocarcinome pulmonaire, provenant de souris ou de sources humaines, dans diverses souches de souris. Nous démontrons que blessant les voies respiratoires à la bléomycine avant l’injection de cellules de tumeur augmente la prise de greffe de cellules tumorales de 0 à 17 % de 71 à 100 %. Significativement, cette méthode améliorée incidence des tumeurs pulmonaires et une excroissance ultérieure à l’aide de différents modèles et les souches de souris. En outre, les cellules cancéreuses du poumon implantée diffusent des poumons dans des organes éloignés. Ainsi, nous fournissons un protocole qui peut être utilisé pour établir et maintenir de nouveaux modèles orthotopique du cancer du poumon avec la limitation des quantités de cellules ou recueillis et à évaluer de façon quantitative la capacité tumorigène des cellules cancéreuses du poumon dans les paramètres physiologiquement pertinents .

Introduction

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Cancer du poumon est la principale cause de cancer liée décès dans le monde1. Patients atteints de cancer du poumon a finit par succombent de métastases à des organes éloignés, notamment pour le système nerveux central, foie, glandes surrénales et OS2,3,4. Tumeurs thoraciques ont été traditionnellement classées comme le cancer du poumon à petites cellules (CPPC) ou non-small cell lung cancer (NSCLC)5. NSCLC est le plus fréquemment diagnostiqué une tumeur maligne et peuvent être subdivisés en différents sous-types histologiques, y compris l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) et poumon épidermoïde (ULEMC)6. L’analyse génomique des cancers du poumon primaires humaines réséqués a révélé que les tumeurs au sein d’un histotype donné peuvent également exprimer diverses perturbations moléculaires, outre contribuant à leur progression clinique divergente et déconcertants pronostic patient. L’hétérogénéité remarquable des cancers du poumon représente un défi important à la conception rationnelle, les essais précliniques et mise en œuvre de stratégies thérapeutiques efficaces. Par conséquent, il y a lieu d’élargir le répertoire des modèles de cancer du poumon expérimental tractable pour étudier les diverses origines cellulaires et moléculaires sous-types stades de cette maladie.

Diverses approches à l’aide de modèles animaux ont été utilisés pour étudier lung cancer in vivo, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients selon l’ou les questions d’intérêt biologiques. Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) peuvent cibler des altérations génétiques spécifiques à un type de cellules progénitrices donnée, résultant dans les tumeurs que les progrès dans un hôte immunocompétent7. Bien qu’extrêmement puissant et cliniquement pertinents, la morbidité de tumeur de latence, variabilité, et/ou du poumon associée à Gregory peut être prohibitif pour certaines des mesures quantitatives et la détection des métastases de stade tardif dans des organes éloignés,8. Une approche complémentaire est l’utilisation de modèles d’allogreffe, par lequel cellules de cancer pulmonaire, obtenue directement auprès d’une tumeur de souris ou de dérivés d’abord comme les lignées cellulaires établies dans la culture, sont réintroduites en hôtes syngéniques. Par analogie, xénogreffes de cancer du poumon sont établies à partir des lignées cellulaires humaines ou des échantillons de patient tumeur dérivée. Xénogreffes de ligne de cellules humaines ou patients xénogreffes dérivés (PDXs) sont généralement conservées dans des souris immunodéprimées et interdit donc de surveillance immunitaire complète9. Malgré cet inconvénient, ils fournissent une avenue pour propager la limitation des quantités d’humains échantillons biologiques et l’étude fondamentale en vivo propriétés des cellules cancéreuses humaines, qui codent pour des aberrations génomiques plus complexes que les tumeurs GEMM.

Une propriété utile des allogreffes et xénogreffes, c’est qu’ils sont prêtent à des traditionnels essais de dilution cellules limitant, utilisés pour quantifier la fréquence de tumeur initiant des cellules (TICs) au sein d’une population de cellules malignes10. Dans ces expériences, un nombre défini de cellules est injecté par voie sous-cutanée dans le flanc des animaux et la fréquence des TICs peut être estimée selon le taux d’abonnement de tumeur. Tumeurs sous-cutanées cependant peuvent être plus hypoxique11 et ne peuvent pas modéliser principales contraintes physiologiques du microenvironnement tumoral de poumon. Livraison par voie intratrachéale de souches épithéliales ou cellules progénitrices dans les poumons des souris est une méthode pour étudier la régénération pulmonaire et bronchique stem cell biology12. Toutefois, le taux de prise de greffe de cette technique peut être relativement faible, à moins que les poumons sont d’abord soumis à des formes physiologiques de blessure, comme une infection virale13,14. Soutien de cellules stromales inflammatoires et/ou la rupture de la membrane basale de poumon peut améliorer la rétention des cellules transplantées dans les niches des cellules souches dans les voies respiratoires distales15. Fibrose induisant des agents peut également pré-conditionner les poumons afin d’améliorer la prise de greffe de cellules pluripotentes induites16 des cellules souches mésenchymateuses17. Si des formes similaires de lésion des voies aériennes peuvent influer sur le taux de prise de greffe, capacité initiatrice de la tumeur et la croissance des cellules cancéreuses du poumon doit encore être systématiquement évalués.

Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour accroître l’efficacité de l’orthotopic lung cancer cellule prise de greffe, de préconditionner les poumons des souris atteintes de blessures. LUAD apparaît dans les voies aériennes distales avec un sous-ensemble important de ces cancers développant un stroma fibreux18 souvent corrélé avec le pronostic19. Bléomycine, un naturel synthases hybrides peptide-polykétide, a été largement utilisée pour induire une fibrose pulmonaire dans la souris20. L’instillation des voies aériennes de bléomycine favorise tout d’abord épithéliale attrition dans les alvéoles et le recrutement des cellules inflammatoires, y compris les macrophages, les neutrophiles et les monocytes21. Elle est suivie de tissu transformant en voies respiratoires distales, membrane basale réorganisation22,23 et matrice extracellulaire (ECM) dépôts24. Les effets d’une injection de bléomycine unique sont transitoires, fibro-résoudre après 30 jours dans la plupart des études25. À l’aide de modèles des allogreffes et xénogreffes, nous avons testé si préconditionner les voies respiratoires des souris à la bléomycine pourrait augmenter significativement le taux de cellules LUAD dans les poumons.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’Université Yale.

1. mise en place / préparation des réactifs.

  1. Bléomycine
    ATTENTION : Basé sur le système général harmonisé (SGH) de Classification et d’étiquetage des produits chimiques, la bléomycine est classée comme un danger pour la santé GHS08.
    1. Préparer la bléomycine sous une hotte chimique. Resuspendre 15 U dans 5 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
    2. Aliquote 100-200 µL de la solution en verre flacons et congeler à-20 ° C pour une utilisation future. Bien étiqueter les tubes avec la date de la remise en suspension. Utiliser dans les 6 mois à compter de cette date.
      Remarque : Chaque souche de souris a une sensibilité différente à la bléomycine26. Tests de différentes doses de bléomycine pour chaque souche de souris sont recommandés. Les souches de souris et les doses correspondantes de la bléomycine utilisés dans des expériences représentatives sont énumérés au tableau 1.
  2. Souris
    1. Acheter souris nécessaires pour l’expérimentation et autoriser les souris 7 jours pour s’acclimater avant l’injection. Effectuer des perfusions sous une hotte de sécurité biologique. Transférer les animaux hébergés dans une chambre conforme non-BSL2 à une salle BSL2 selon le processus institutionnels normal avant la perfusion de la bléomycine. Injecter des souris à 6-8 semaines d’âge.
      ATTENTION : Injecter des souris à la suite des lignes directrices pour les agents dangereux, le niveau de biosécurité 2 (BSL2) et approbation IACUC.
      Remarque : La souris achetés pour les expériences représentatives sont répertoriés dans la Table des matières. Seules les souris mâles ont été utilisés.
  3. Lignées cellulaires de Cancer du poumon
    1. Lignées de cellules de culture souhaitée dans leurs médias respectifs. Avant les injections, effectuer le profilage d’ADN répété en tandem courtes ou de tests génétiques afin d’assurer l’identification de la ligne cellulaire appropriée. Pour faciliter l’in vivo et ex vivo imagerie, infecter les lignées cellulaires avec un lentivirus exprimant la thymidine kinase, la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase fusion journaliste27et trier les cellules positives journaliste par fluorescence activé la cellule triant (FACS) avant la greffe. Tester les lignes pour le mycoplasma tous les 6 mois.
      1. La culture de lignée de cellules cancéreuses humaines L2030 tel que recommandé par le fabricant à l’aide de support de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % de sérum fœtal (SVF), la pénicilline-streptomycine et amphotéricine b.
      2. Culture 368T1 lignée murine (dérivée de souris KrasG12D; p53- / - ) à l’aide de support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 10 % FBS, pénicilline-streptomycine et amphotéricine b.
      3. La culture de lignée de cellules cancéreuses humaines PC9 avec 10 % RPMI FBS, pénicilline-streptomycine et amphotéricine b.

2. traitement à la bléomycine

  1. Plan d’injecter par voie intratrachéale de souris à la bléomycine 14 jours avant la greffe de cellules tumorales.
  2. Décongeler le stock de bléomycine sur glace 2 h avant l’injection.
  3. Une fois décongelé, diluer la bléomycine, de la concentration de travail désirée (0,02 U/50 µL ou 0,005 U/50 µL) et gardez-le sur glace.
    Remarque : Concentration de la bléomycine dépend de la souche de souris utilisée pour les expériences (tableau 1). Titrage de la bléomycine chez les souris devrait être effectuée pour déterminer la dose optimale.
  4. Préparer l’anesthésie en diluant la kétamine et xylazine à une concentration finale de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement, à l’aide d’une aiguille de seringue et 27 G de 1 mL, anesthésier chaque souris en injectant par voie intrapéritonéale kétamine/xylazine solution à 100/10 mg/kg respectivement.
  5. Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil. Confirmer anesthetization appropriée lorsque la souris ne répond pas à l’orteil pincée. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  6. Placer 1 souris à la fois sur une plate-forme d’intubation par pendaison ses dents de devant avec le dos contre la plate-forme.
  7. Éclairer la partie supérieure du thorax à l’aide d’un illuminateur fibre optique pour aider à la visualisation de la trachée. Ouvrir la bouche de la souris et tirez doucement la langue avec une pince plate stérile.
  8. Utiliser un cathéter intraveineux sans l’aiguille pour éviter de bloquer la respiration. Position du cathéter sur la lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée.
  9. Insérer le cathéter dans la trachée jusqu'à ce que le dessus du cathéter atteigne les dents de devant. Confirmer le positionnement correct de la sonde dans la trachée en visualisant la lumière blanche qui brille à travers l’ouverture du cathéter dans la bouche.
  10. À l’aide d’une pipette, administrer 50 µL de bléomycine ou véhicule (PBS) directement dans le cathéter pour s’assurer que la totalité du volume est inhalé. Effectuez cette étape dans des conditions stériles.
  11. Si le cathéter est inséré correctement, la souris inhalera immédiatement le contenu du cathéter. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que la totalité du volume se déplace le long du cathéter. Puis retirer le cathéter de la trachée et disposer dans une solution 10 % eau de Javel.
    Remarque : La durée moyenne par souris d’étapes 2.7-2.11 est environ 5 min.
  12. Si la souris n’est pas inhalant le liquide, soigneusement surveiller la respiration et ajuster la position du cathéter. Si la souris s’arrête de respirer, retirer le cathéter immédiatement et laisser la souris pour reprendre à respirer normalement avant de ré-insérer le cathéter.
  13. Placez votre souris injectée sur un coussin de chauffage agréé IACUC sur le dos sur une surface plane pour la récupération. Toute la procédure prendra 10 min par la souris. Ne retournez pas un animal qui a subi une injection à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri.
  14. Placer une carte « Chimiques dangereux in Use » sur la cage pendant 24 h.

3. suivi de souris après Intubation

  1. Surveiller les souris pour détresse respiratoire immédiatement après intubation et puis toutes les 15 min jusqu'à ce que la souris se réveillent de l’anesthésie. N’abandonnez pas souris jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  2. Injecter le kétoprofène (5 mg/kg) par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur.
  3. Examiner la souris 24h après l’intubation et 3 fois par semaine pour déceler tout signe de morbidité.
  4. Tenir un registre de la date de la procédure, l’identification des animaux, type d’intervention, type d’observations surveillance anesthésiques et post-opératoire avec fois.
  5. Surveiller les souris pour perdre du poids, détresse respiratoire, anomalies comportementales et un état corporel < 2 (segmentation de la colonne vertébrale des os pelviens évident/dorsales sont palpables) toutes les deux semaines après l’injection de bléomycine.
  6. Euthanasier la souris dans une détresse respiratoire ou des souris qui ont connu la perte de 15 % de la masse corporelle de CO2 ou de la kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale. Confirmer l’euthanasie en effectuant la palpation pour l’activité respiratoire.

4. prise de greffe des lignées de cellules Adénocarcinome pulmonaire.

Remarque : Effectuez la greffe de cellules 14 jours après l’injection de bléomycine (étape 2.1).

  1. Permettre aux cellules de croître dans des flacons de2 75 cm non perturbé pendant 3 jours avant le jour de l’injection avec les correspondants des médias comme indiqué dans l’étape 1.3.
    NOTE : Ils devraient être 80 % anastomosé au jour de l’injection (ce qui correspond à 2-3 x 106 dans chaque fiole selon la lignée cellulaire).
  2. Laver les cellules qui croissent sur les flacons de2 75 cm avec 5 mL de PBS à température ambiante.
  3. Aspirer les PBS et ajouter 1,5 mL de trypsine aux cellules et incuber les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules détachement (généralement 2 à 5 min).
    Remarque : Nous recommandons de vérifier toutes les 2 min pour le détachement des cellules de la matière plastique par la simple visualisation du fond de la fiole ou sous un microscope optique. Ne dépassez pas 5 min d’incubation avec de la trypsine.
  4. Neutraliser la trypsine en ajoutant 4 mL de support contenant 10 % SVF (mêmes médias comme étape 4.1). Prélever les cellules dans un tube de 15 mL et il centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
  5. Aspirer les médias et Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min à température ambiante pour granuler des cellules. Répétez ce 1 fois.
  6. Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 1,5 mL de PBS par flacon.
  7. Mélanger 50 µL du mélange de cellule avec 50 µL de bleu trypan et compter les cellules à l’aide d’une cellule Counter/hémocytomètre chambre28.
  8. Préparer la suspension cellulaire en diluant les cellules dans du PBS 1 x 105 cellules (ou tout autre montant indiqué) d’injecter dans 50 µL par souris. Garder les cellules sur la glace avant l’injection.
    Remarque : Se préparer au moins deux fois plus de cellules pour injection éviter de manquer de suspension cellulaire.
  9. Préparer l’anesthésie en diluant la kétamine et xylazine à une concentration finale de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement, à l’aide d’une aiguille de seringue et 27 G de 1 mL, anesthésier chaque souris en injectant par voie intrapéritonéale kétamine/xylazine solution à 100/10 mg/kg respectivement.
  10. Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil. Confirmer anesthetization appropriée lorsque la souris ne répond pas à l’orteil pincée. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  11. Placer 1 souris à la fois sur une plate-forme d’intubation par pendaison ses dents de devant avec le dos contre la plate-forme.
  12. Éclairer la partie supérieure du thorax à l’aide d’un illuminateur fibre optique pour aider à la visualisation de la trachée.
  13. Remettre en suspension les cellules doucement à l’aide d’une pipette de p200 pour s’assurer qu’ils ne forment pas de touffes. Ouvrir la bouche de la souris et tirez doucement la langue avec une pince plate stérile.
  14. Utiliser un cathéter intraveineux avec l’aiguille retirée pour éviter de bloquer la respiration. Position du cathéter sur la lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée.
  15. Insérer le cathéter dans la trachée jusqu'à ce que le dessus du cathéter atteigne les dents de devant. Confirmer le positionnement correct de la sonde dans la trachée en visualisant la lumière blanche qui brille à travers l’ouverture du cathéter dans la bouche.
  16. À l’aide d’une pipette, administrer 50 µL de cellules directement dans le cathéter pour s’assurer que la totalité du volume est inhalé. Effectuez cette étape dans des conditions stériles.
    Remarque : Si le cathéter est inséré correctement, la souris inhalera immédiatement le contenu du cathéter.
  17. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que la totalité du volume se déplace le long du cathéter, puis retirer le cathéter de la trachée et disposer dans une solution 10 % eau de Javel.
  18. Si la souris n’est pas inhalant le liquide, soigneusement surveiller la respiration et ajuster la position du cathéter. Si la souris s’arrête de respirer, retirer le cathéter immédiatement et laisser la souris pour reprendre à respirer normalement avant de ré-insérer le cathéter.
    Remarque : La durée moyenne par souris d’étapes 4.11-4.18 est environ 5 min.
  19. Placez votre souris injectée sur un coussin de chauffage agréé IACUC sur le dos sur une surface plane pour la récupération.
    Remarque : Toute la procédure prendra 10 min par la souris. Ne retournez pas un animal qui a subi une injection à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri.
  20. Raser la zone de totalité des côtes sur le ventre et sur le dos de B6129SF1/J et d’autres souches de souris aux cheveux noirs en utilisant un rasoir électrique avant l’imagerie.
  21. 2-3 min après l’injection de cellules, injecter 100 µL de luciférine rétro-orbitalement (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille de l’insuline. Remplaçant l’oeil utilisé pour l’injection chaque séance d’imagerie.
  22. Après au moins 2 min, placer jusqu'à 5 souris dans un imageur de bioluminescence animale en position de décubitus dorsal et acquérir une image ventrale à l’aide de paramètres de luminescence29.
  23. Sous le panneau de contrôle, régler les paramètres de résolution et sensibilité pour mesurer la luminescence d’une lignée cellulaire donné. Pour la plupart des applications, commencez avec 3 min (ou « Auto » si saturé), binning = moyen (4), F/Stop = 1, champ de vue = D, sujet hauteur = 1.50.
    Remarque : Si l’injection est réussie, signal de la luminescence est détecté dans la zone de la partie supérieure du thorax, dans un seul poumon ou les deux poumons.
  24. Retourner la souris sur la position de décubitus sternal et acquérir une image dorsale comme indiqué ci-dessus.
    NOTE : Si l’injection de cellules n’est pas effectuée correctement, cellules peuvent regrouper à l’entrée de la trachée ou dans le cou.
  25. Injecter le kétoprofène 5 mg/kg par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur.
  26. Replacer les souris dans leur cage et placer une carte « BSL-2 Agent in Use » sur la cage.
  27. Surveiller les souris pour détresse respiratoire immédiatement après intubation et puis toutes les 15 min jusqu'à ce que la souris se réveillent de l’anesthésie. N’abandonnez pas souris jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  28. Examiner la souris 24h après l’intubation et trois fois par semaine pour déceler tout signe de morbidité.
  29. Conserver l’enregistrement dans le journal de bord de la date de la procédure, l’identification des animaux, type de procédure, le type d’observations surveillance anesthésiques et post-opératoire et fois.
  30. Surveiller les souris pour perdre du poids, détresse respiratoire, anomalies comportementales et un état corporel < 2 (segmentation de la colonne vertébrale des os pelviens évident/dorsales sont palpables) toutes les deux semaines suivant l’inoculation de la bléomycine.
    NOTE : Les souris atteintes de tumeurs pulmonaires peuvent présenter irritation des voies respiratoires, amaigrissement, cachexie, et/ou la mort.
  31. Euthanasier la souris dans une détresse respiratoire ou des souris qui ont connu la perte de 15 % de la masse corporelle par le CO2 ou de la kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale si recueillir des tissus. Confirmer l’euthanasie en effectuant la palpation pour l’activité respiratoire.

5. surveillance de la croissance tumorale par Bioluminescence Imaging

  1. Répétez l’imagerie des souris au greffe après jour 3 et toutes les semaines par la suite.
  2. Anesthésier les souris par l’injection de kétamine/xylazine (comme décrit aux étapes 2,4-2,5) ou par inhalation isoflurane (2 %). Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil pour confirmer la bonne anesthetization. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  3. Raser la zone de totalité des côtes sur le ventre et sur le dos de B6129SF1/J et d’autres souches de souris aux cheveux noirs en utilisant un rasoir électrique avant l’imagerie.
  4. Une fois que les souris sont sous anesthésie, injecter 100 µL de luciférine rétro-orbitalement (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille de l’insuline. Attendez 2 min. remplaçant l’oeil utilisé pour l’injection chaque séance d’imagerie.
  5. Placez la souris dans l’imageur et acquisition d’images dorsales et ventrales comme indiqué aux paragraphes 4.22-4.24.
  6. Placez les souris dans la cage après imagerie, sur le dos sur une surface plane pour la récupération.
    Remarque : Toute la procédure prendra 5 min par groupe de 5 souris. N’abandonnez pas souris jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  7. Analyser les images en utilisant le logiciel d’analyse imageur/bioluminescence.
    1. Sélectionnez les images appropriées et de les charger en tant que groupe dans le logiciel d’analyse de bioluminescence.
    2. Cliquez sur outil ROI | Place pour ajouter une zone carrée d’intérêt (ROI). Placez le retour sur investissement sur la zone de la partie supérieure du thorax, couvrant l’image de l’ensemble du poumon. Répétez cette opération pour chaque image de la souris.
    3. Faites un clic droit et sélectionnez copier tous ROI function pour appliquer le même ROI à toutes les images dans le groupe et leur position dans le haut du thorax des souris, vues ventrales et dorsales.
    4. Dans le coin supérieur gauche de la fenêtre d’image, sélectionnez la fonction de Photons . Cliquez sur la fonction de panneau de contrôle de mesure pour mesurer la ROIs. Copiez et collez la table de sortie contenant le flux total (photons/s) dans un logiciel de choix pour analyser les données plus loin.
    5. Normaliser la valeur quotidienne de retour sur investissement de chaque souris à sa valeur de retour sur investissement mesuré au jour 0.

6. tissu isolement et traitement.

  1. Anesthésier les souris par l’injection de kétamine/xylazine (comme décrit aux points 2.4-2.5 ou par inhalation isoflurane (2 %). Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil. Confirmer anesthetization appropriée lorsque la souris ne répond pas à l’orteil pincée. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  2. Injecter 100 µL de luciférine rétro-orbitalement (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille de l’insuline. Attendez 2 min.
  3. Souris image après étapes 4.22-4.24 du présent protocole.
  4. Injecter dans l’autre oeil de l’étape 6.2 un autre 100 µL de luciférine rétro-orbitalement à l’aide d’une aiguille à insuline avant l’euthanasie.
  5. Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (voir étape 2,4 pour plus de détails) suivie de dislocation cervicale si les souris sont sous anesthésie profonde conformément aux directives fournies par IACUC. Confirmer l’euthanasie en effectuant la palpation pour l’activité respiratoire.
  6. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faire une incision de la peau sous le sternum. Ouvrez la couche musculaire le long de la membrane à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux et exposer la cavité thoracique par une coupe à travers la cage thoracique sur un des côtés latérale évitant les artères thoraciques internes.
  7. Perfuse la souris en faisant une petite incision dans l’oreillette droite du cœur et injecter 5 mL de PBS dans le ventricule gauche. La couleur du tissu pulmonaire vont du rouge au blanc-rose pâle si la perfusion sanguine est faite correctement.
  8. Exciser les poumons de la cavité thoracique soigneusement en saisissant l’oesophage ou coeur avec une pince. Tirer le tissu délicatement et utiliser des ciseaux chirurgicaux pour couper avec soin le tissu social, en évitant la ponction du tissu pulmonaire. La trachée préserver autant que possible de l’inflation des voies aériennes du poumon à une étape ultérieure.
  9. Laver le poumon en immergeant et agitant le tissu 3 fois dans une plaque 6 puits remplis de 3 mL de PBS pour enlever le sang excédentaire.
  10. Placer les poumons sur le couvercle d’une plaque 6 puits et placez le couvercle contenant le tissu de l’imageur bioluminescente et acquérir une image luminescents30.
    NOTE : Nous recommandons les paramètres suivants dans le panneau « Acquisition » « champ de vision = A » et « hauteur de l’objet = 0,75 cm » et puis l’exposition « automatique » pour éviter d’être saturés d’images.
  11. D’accise et des autres organes, l’image comme fait à l’étape 6,9-6.10, où les métastases ont été identifiés par la luminescence, tels que le cerveau, foie, surrénales, osseuse, ganglions lymphatiques, reins ou la rate31.
  12. Perfuse le poumon avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % en insérant l’aiguille dans la trachée de la souris. Les poumons seront gonfle si bien irrigués.
    ATTENTION : 4 % paraformaldéhyde est un toxique, une santé GHS07 des risques GHS08.
  13. Transférer les poumons dans un 15 mL conique avec 5 mL de paraformaldéhyde à 4 %.
  14. Difficulté les poumons ou autres tissus en incubant le tissu avec du paraformaldéhyde 4 % pendant la nuit à 4 ° C dans un dispositif d’agitation à 30-50 tr/min.
  15. Incorporer des poumons (ou autres tissus) dans la paraffine ou de la température de coupe optimale composée selon l' application32.
    NOTE : La paraffine est la méthode préférée pour préserver la structure du poumon et de Trichrome de Masson et coloration hématoxyline-éosine.

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Résultats

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Pour augmenter l’efficacité de la greffe de cellules de cancer LUAD dans les poumons des souris, nous avons développé un protocole qui tout d’abord les conditions préalablement les voies respiratoires à l’aide de bléomycine suivie d’injection de cellules de tumeur orthotopique (Figure 1). Nous avons confirmé que même lorsqu’il est administré à des souris athymiques immunodéprimés, bléomycine transitoire fibrose induite par jour 14 comme en témoigne la perte d...

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Discussion

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Frappant de parallels cliniques ont été recensées entre le cancer du poumon et autres maladies chroniques du poumon36. En particulier, les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) ont une prédilection accrue pour développer un cancer du poumon, et cette association est indépendante du tabagisme histoire37,38. IPF est caractérisée par une destruction progressive de l’architecture de poumon et fonction respiratoire altérée ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Cette étude a été financée par des subventions de l’Institut National du Cancer (R01CA166376 et R01CA191489 à D.X. Nguyen) et le Department of Defense (W81XWH-16-1-0227 à D.X. Nguyen).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BleomycinSigmaB5507-15UNATTENTION Risque pour la santé GHS08
Exel Catheter 24GFisher1484121Retirer l’aiguille. Pour injection intratrachéale
Kétamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344Pour anesthésier les souris
XylazineButler Schein33198Pour anesthésier les souris
Kétoprofène, 5 000 mgCayman Chemical10006661Analgésique
Puralube Pommade ophtalmique vétérinaireBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897Pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie
Poudre de D-LuciférinPerkin Elmer Health Sciences Inc122799Pour l’imagerie luminescente. Reconstituer la poudre avec du PBS pour une concentration de travail de 15 mg/mL. Protéger de la lumière
Support d’intubation des rongeursBraintree ScientificRIS-100Support recommandé pour l’injection intratrachéale
MI-150 ILLUMINATEUR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MPour éclairer et visualiser la trachée
Pince Graefe, 2,75 (7 cm) de longserrat RobozRS-5111Pour injection intratrachéale
Seringue Luer-Lok Stérile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Rasoir rechargeable à double grille humide/sècheConair-Pourraser les souris
Ciseaux Bonn, 3,5" droit 15 mm lames tranchantes/tranchantes RobozRS-5840SC
15 mL Tube coniqueBD / Fisher352097
1,5 mL TUBES À CENTRIFUGERUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Flacon à scintillation 7 mL Verre borosilicaté GPIFisher701350
Pointes de pipette filtrante (200 &mu ; L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Phosphate tamponné SalineLife Technologies14190-144
0,25 % Trypsine-EDTALife Technologies25200-056
DMEM high glucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Sérum fœtal bovin USDALife Technologies10437-028
Pénicilline-StreptomycineLife Technologies15140-122
Amphotéricine BSigmaA2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4 %Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLifeAMQAX1000
Flask T/C 75cm sq col incliné, capuchon bleuFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262Pour l’imagerie par bioluminescence in vivo
Logiciel d’image vivantePerkin Elmer Health Sciences Inc128113Pour l’analyse de bioluminescence in vivo
d’anesthésie gazeuse XGI-8Perkin Elmer Health Sciences Inc118918Pour l’anesthésie à l’isoflurane
BD Seringue à insuline à aiguille courte Ultra-Fine II 1 cc 31 G x 8 mm (5/16 po)BD / FisherBD328418Pour injection de luciférine rétro-orbitaire
Seringue 1mlBD / Fisher14-823-434Pour injections intrapéritonéales
Aiguille 26 G x 1/2 poBD / Fisher305111Pour injections intrapéritonéales
4 % ParaformaldéhydeVWR43368-9MATTENTION Danger pour la santé GHS07, GHS08. Pour la fixation des tissus
Pipette Pipet-Lite, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Mayer’s HematoxylinELECTRON : MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Colorant à l’éosine Y 0,25 % (p/v) dans 57 %Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228Pour masson trichrome colorant pour visualiser le collagène
Superfrost plus lames de verreFisher
Plaque à 6 puitsCorningC3516
Universal Mycoplasma Detection KitATCC30-1012K
OCT Composé d’enrobageELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12Pour l’enrobage de tissus pour coupes congelées
Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 SPour sectionner les tissus pour l’analyse
de la colorationMicroscope à fluorescence tout-en-unKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 pour Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Souris athymiques (Crl :NU(NCr)-Foxn1nu)Charles RiverNIH-553
NSG (NOD. souris Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)Jackson Laboratories5557
souris B6129SF1/J JacksonLaboratories101043
cellules NIH-H2030ATCCCRL-5914
368T1généreusement fournies par Monte Winslow (Standford University)-
cellules PC9Nguyen DX et al. Cell. 2009 ; 138:51&ndash ;
BrM3 cellulesNguyen DX et al. Cell. 2009 ; 138:51&ndash ; 62-
Technologies Système 17014411 1255015 souris 62-H2030

Références

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