Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable

Summary

Ce protocole décrit une méthode basée sur l’imagerie pour activer les lymphocytes T à l’aide de photoactivatable peptide-MHC, permettant un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation des cellules T.

Abstract

Lymphocytes T engagent rapide, polarisée de signalisation, survenant dans les minutes suivant l’activation de TCR. Cela induit la formation de la synapse immunologique, une jonction cellule-cellule stéréotypés qui régule l’activation des cellules T et les cibles directionnellement réponses effectrices. Pour étudier efficacement ces processus, il faut une approche d’imagerie adaptée afin de pouvoir saisir les réponses rapides, polarisées. Ce protocole décrit un tel système, qui repose sur une photoactivatable peptide-major complexe d’histocompatibilité (SPHL) qui est non-stimulateur jusqu'à ce qu’elle est exposée aux rayons ultraviolets. Decaging ciblée de ce réactif au cours d’expériences de vidéomicroscopie permet un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation de TCR et surveillance haute résolution des réponses cellulaires ultérieures par réflexion totale interne (FRBR) d’imagerie. Cette approche est également compatible avec les stratégies de perturbations génétiques et pharmacologiques. Cela permet l’assemblage des voies moléculaires bien définis qui relient le TCR de signalisation à la formation des structures du cytosquelette polarisées qui sous-tendent la synapse immunologique.

Introduction

Les lymphocytes T (cellules T) jouent un rôle central dans l’immunité cellulaire en reconnaissant les peptides antigéniques affichées dans le contexte de la surface de la cellule MHC. Reconnaissance de l’antigène, qui est véhiculée par le TCR, entraîne la différenciation des cellules naïves T et fait la promotion de la fourniture de réponses cytolytiques et communicatifs par les populations de l’effecteur. Engagement de TCR induit également des changements dramatiques dans l’architecture cellulaire. En quelques minutes, les cellules T gloms sur le côté de la cellules présentatrices d’antigène (APC), formant une interface polarisée appelée la synapse immunologique (IS)^1,2. L’IS potentialise les réponses effectrices des lymphocytes T en permettant la sortie directionnelle des cytokines ou, dans le cas de lymphocytes T cytotoxiques (CTL), des protéines lytiques qui détruisent l’APC.

Engagement de TCR par SPHL induit la phosphorylation rapide de plusieurs molécules d’adaptateur en aval, y compris l’éditeur de liens pour l’Activation des cellules T (LAT), qui favorise en fin de compte robuste remodelage du cytosquelette synaptique². Filaments d’actine cortical (actine-F) pousse les lymphocytes T s’étendant sur la surface de l’APC et puis il résout en une structure annulaire caractérisée par l’accumulation de F-actine à la périphérie de l’IS et l’appauvrissement de la couche du centre. Formation d’actine F anneau est étroitement couplée à une réorientation du centre organisateur de microtubules (MTOC, également appelée centrosome dans les lymphocytes T) à un poste juste en dessous du centre de l’interface. Les deux événements se produisent dans les minutes suivant la reconnaissance de l’antigène initial et établissent le contexte architectural dans lequel les événements d’activation ultérieure et effectrices réponses se produisent.

Pour étudier la formation IS, différents laboratoires ont mis au point des approches dont l’APC est remplacé par une surface de verre qui contient immobilisée TCR ligands ou prend en charge une bicouche lipidique que lui-même contienne les ligands^3,4. Les lymphocytes T forment IS-comme contacts sur ces surfaces qui peuvent être photographiées par microscope à fluorescence réflexion totale interne (FRBR) ou microscopie confocale, permettant des études à haute résolution d’activation des cellules T et formation IS.

Bien que ces approches ont permis pour l’excellente visualisation de l’IS entièrement assemblé, une grande partie de la signalisation de la ligature TCR:pMHC suivante se produit quelques secondes, ce qui complique les efforts pour déterminer la séquence des événements après l’activation de la TCR avec précision . Pour contourner ce problème, une approche de photoactivation a élaboré, dans lequel photoactivatable SPHL est utilisé pour obtenir un contrôle spatio-temporelle du TCR activation^5,6,7. Dans ce système, les cellules T sont attachés aux surfaces de verre contenant la SPHL photoactivatable qui est non-stimulateur pour le TCR jusqu'à irradié par la lumière ultraviolette (UV). L’irradiation UV d’une région de microns de taille de la surface sous la cellule T supprime la photocage création d’une zone de stimulation qui peut être reconnue par les lymphocytes T. Les événements ultérieurs de signalisation et le remodelage du cytosquelette sont contrôlés puis à l’aide de reporters fluorescents génétiquement encodés. Deux versions de photoactivatable de peptides antigéniques, lépidoptère du cytochrome c_88-103 (MCC) et l’ovalbumine_257-264 (OVA), qui sont présentés dans le contexte de la classe II de MHC I-E^k et de la classe I de MHC H2-K^b, respectivement, ont été développés (Figure 1). Cela permet l’analyse des deux CD4⁺ T des cellules spécifiques pour MCC-je-E^k (exprimant la 5C. C7, 2 b 4, ou AND TCRs) et CD8⁺ T des cellules spécifiques d’ovules-H2-K^b (exprimant le TCR OT1).

Ces dix dernières années, l’approche de photoactivation et imagerie de TCR a été utilisé pour établir la cinétique précise TCR premières étapes de la signalisation et aussi d’identifier les voies moléculaires qui régissent le remodelage du cytosquelette polarisée^{5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. par exemple, le test a joué un rôle important dans la détermination de cette centrosome réorientation vers l’APC est médiée par un gradient localisé de lipides deuxième messager diacylglycérol centré à l’IS. Il est prévu que cette méthodologie continueront d’être précieux pour des applications exigeant une analyse d’imagerie à haute résolution de la fonction des cellules T.

Protocol

1. préparation des Surfaces vitrées stimulateur

1. Manteau huit puits chambré compartimentée avec biotinylé poly-L-lysine (Bio-PLL) dilué à 1/500 dans l’eau distillée, déminéralisée (ddH₂O). Incuber 30 min à température ambiante (RT).
2. Laver avec H₂O.
3. Sec pendant 2 h à température ambiante.
4. Bloc Bio-PLL enduit les surfaces avec un tampon de blocage (HEPES salin [10 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM], avec 2 % de BSA) pendant 30 min à température ambiante.
   1. Dissoudre 5 mg de bromhydrate de poly-L-lysine dans 1 mL de 10 mM NaPO₄, pH 8,5.
   2. Ajouter 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotine (provenant d’un stock de 100 mg/mL dans le DMSO) et vérifier le pH de la réaction. Si le pH est inférieur à 8,5, ajouter 2 μL de 4 N NaOH pour s’élever entre pH 8,5 et 9,5.
   3. Vortex pendant 30 min.
   4. Étancher la réaction avec 50 μL de glycine 100 mM dissous dans 20 mM Tris pH 8.0.
   5. Tourner à pleine puissance pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
      NOTE : Qualité Bio-PLL est généralement comparée aux précédentes préparations par revêtement double dilutions successives du matériel sur une plaque de 96 puits ELISA et de quantifier la teneur en biotine après que incubation à la phosphatase alcaline couplé streptavidine.
5. Retirer le tampon de blocage. Ne laissez pas les puits à sec. Ajouter streptavidine (100 µg/mL dans un tampon de blocage). Incuber pendant 1 heure à 4 ° C.
6. Laver à HBS. Remplir et inverser puits diapositive Chambre 4 - 5 fois, retirer les puits HBS. Ne laissez pas les puits à sec.
7. Ajouter les biotinylé SPHL ligands et les molécules d’adhérence à la surface.
   NOTE : MCC et ovules peuvent être photocaged en ajoutant les ortho-nitrobenzyle basé des groupes protecteurs (p. ex. nitrophenylethyl (NPE) ou nitroveratryloxycarbonyl (CONV)) pour le groupement ε-aminé de lysines clés (K12 dans MCC, K7 en ovules). Photocaged MCC et ovules peuvent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux. Après reconstitution dans un tampon aqueux, elles sont repliés dans exprimée par les bactéries j’ai-E^k et H2-K^b en utilisant des approches établies^11,12.
8. Validation du peptide de CMC ou ovules photoactivatable
   1. Decage protégé par CONV peptides par UV irradiation avec une poche lampe UV (voir Table des matières) pendant 20 min à température ambiante.
   2. Impulsion 1,0 x 10⁵ TTB avec 1 µM du peptide nonstimulatory (témoin négatif, par exemple Hb), irradiés photoactivatable peptide, peptide photoactivatable irradiés et le peptide de l’agoniste (contrôle positif, par exemple, MCC) pendant 1 h à une nuit à 37 ° C.
   3. Pour stimuler les lymphocytes T exprimant le 5C. C7/2 b 4/et TCR, utiliser des cellules CH12 ou B C27. Pour stimuler les lymphocytes T OT1, utilisez RMA-s ou cellules de thymome EL4.
   4. Mélanger les TTB pulsés avec un nombre égal de lymphocytes T de 96 puits autour des plaques de fond à un volume final de 200 µL. Incuber à 37 ° C pendant 12 à 24 heures.
   5. Récupérer le surnageant de chaque puits et analyser IL-2 par ELISA avec détection colorimétrique de la Streptavidine-raifort peroxydase.
      NOTE : Confirmation de l’état de mise en cage des tous les peptides par spectrométrie de masse electrospray avant de replier en complexes MHC, est fortement recommandé.
9. Effectuer le pliage et la purification du CMH afin de minimiser l’exposition à la lumière. Par exemple, envelopper le pliage des réactions dans le papier d’aluminium et réaliser la chromatographie par filtration sur gel avec la lampe UV.
   NOTE : Il a été constaté que photoactivatable MCC-je-E^k et OVA - H2-K^b induire l’activation de cellule indépendante de T UV à haute densité, probablement à cause d’une cage fonctionnelle incomplète. Par conséquent, la SPHL photoactivatable est diluée dans un excès de x 10-30 de nonstimulatory SPHL(par exemple j’ai-E^k contenant le peptide de_{64 à 76} de l’hémoglobine (Hb)) au cours de l’étape de l’immobilisation. Cela améliore le rapport signal sur bruit de l’expérience d’imagerie ultérieure.
10. À photoactivate CD4⁺ T cellules, collectivement utilisent un mélange de biotinylé Hb-je-E^k (3 µg/mL), biotinylé photoactivatable MCC-je-E^k (0,1 µg/mL) et anticorps biotinylé contre la classe I de MHC H2-K^k (0,5 µg / mL). les anticorps anti-H2-K^k encourage les 5 C. Cellules C7/2 b 4/AND T, qui expriment H2-K^k, à se répandre sur la surface du verre sans subir d’activation.
11. Pour CD8⁺ T des cellules, utilisez un mélange de biotinylé H2-D^b portant le peptide KAVYDFATL (1 µg/mL), photoactivatable biotinylé OVA-H2-K^b (0,1 µg/mL) et le domaine extracellulaire de la molécule d’adhésion ICAM-1 (2 µg/mL produit par insectes cell culture¹³). L’ICAM-1 encourage la formation serrée de contact en engageant l’intégrine LFA1 sur la surface des cellules T.
12. S’applique à tous les mélanges de protéines dans un tampon bloquant, suivie d’une incubation de 1 h à RT ou au moins 2 h à 4 ° C.
    Remarque : La densité moléculaire sur les surfaces de ce type à être ~ 8000 par µm² a été préalablement déterminée⁶. Étant donné que photoactivatable SPHL représente ~1/30^th de la protéine biotinylé sur la surface, sa densité sera ~ 267 molécules par µm², avant decaging.
13. Lavez comme à l’étape 1.6 et laisser au HBS jusqu'à utilisation.
14. Ajouter 200 000 CD4⁺ ou CD8⁺ T cellules exprimant le TCR approprié dans chaque puits et permettre aux cellules d’adhérer à 37 ° C pendant 15 min. Une fois que les cellules ont attaché à et répartis sur la surface, ils sont prêts pour la photoactivation et l’imagerie.
    Remarque : Retroviral transduction de cellules effectrices T avec imagerie sondes fluorescente est décrit en détail ailleurs^6,7. Signalisation calcique peut également être étudiée en utilisant des cellules de T untransduced chargés avec le colorant photosensible calcium Fluo-4,⁶. Le colorant ratiométrique Fura-2 n’est pas recommandée car elle nécessite d’excitation dans l’ultraviolet, ce qui induit aussi une decaging de la SPHL photoactivatable.

2. Acquisition d’images

1. Utiliser un microscope inversé de la FRBR équipé d’un objectif X UV 150 compatibles pour l’acquisition d’images. UV irradient les régions définies par l’utilisateur en utilisant un système de membrane numérique attaché à une lampe à mercure 100 W (HBO). Lumière de cette lampe sur l’échantillon à l’aide d’un miroir de longue passe 400 nm directe UV.
2. Utiliser un logiciel analyse image photoactivation localisée et acquisition de Time-lapse. Dans la plupart des expériences, surveiller les sondes dans les canaux verts et rouges à l’aide de 488 nm et lasers à excitation 561 nm, respectivement. La lumière laser est dirigée sur l’échantillon à l’aide d’un miroir dichroïque dual-passe-bande qui transmet également dans la gamme UV (pour permettre à decaging). S’il vous plaît voir la Table des matières et la Figure 6 pour plus d’informations sur la configuration de microscope.
3. Après avoir monté la diapositive chambre contenant les cellules T, ajuster les paramètres pour obtenir l’illumination FRBR ou épifluorescence, si nécessaire. En mode direct, sélectionnez un champ de cellules qui expriment les sondes fluorescentes d’intérêt. Établir des régions à l’échelle du micron pour photoactivation sous des cellules individuelles à l’aide du logiciel de contrôle.
4. Commencer l’acquisition de Time-lapse. En règle générale, 80 points sont acquis, avec un intervalle de 5 s entre chaque point dans le temps. Ce qui laisse plus de suffisamment de temps pour séquentiel 488 nm et 563 expositions nm, dans le cas d’expériences bicolore.
5. Après 10 h, photoactivate les régions sélectionnées en ouvrant le diaphragme numérique d’obturation de 1 à 1,5 s.
6. Après que le laps de temps est terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules et répéter le processus.

3. analyse des données

NOTE : Localisée photoactivation de ligands immobilisés crée une zone de stimulateur bien définie et fixe qui peut être utilisée pour l’analyse quantitative de la signalisation des réponses et des événements de remodelage du cytosquelette. Analyse des protocoles consistent généralement en quantifier l’intensité de la fluorescence au sein de la région irradiée ou à l’aide de la région irradiée, pour les mesures de distance comme un paramètre positionnel (e.g. pour évaluer la polarisation du centrosome à la région irradiée). Les deux protocoles d’analyse sont décrites ci-dessous. Divers programmes d’analyse interactive image peuvent servir à rendre l’intensité et les mesures de distance, qui peuvent ensuite être sortie pour un traitement supplémentaire et l’analyse.

1. Intensité de la fluorescence
   1. Déterminer l’intensité de fluorescence (FI) d’une région de fond à l’extérieur de la cellule (FI_b). Cela sera utilisé pour la correction de fond.
      1. Dessiner une zone carrée taille micron à l’extérieur de la cellule et faire un masque. Pour déterminer l’intensité de la fluorescence, cliquez sur Analyze | Masquer les statistiques. Sélectionnez Moyenne intensité de Fluorescence et d’exporter les valeurs.
         Remarque : Les détails de procédure (p. ex. 3.1.1.1) reportez-vous au logiciel Slidebook (voir la Table des matières). Mise en œuvre du présent protocole à l’aide d’autres logiciels (par ex.., Fidji) sera légèrement différente.
   2. Déterminer la FI dans cette région de photoactivation pour chaque point dans le temps.
      1. Sélectionnez le masque pour mettre en évidence la région qui a été photoactivées. Pour déterminer l’intensité de la fluorescence, cliquez sur Analyze | Masquer les statistiques. Sélectionnez Moyenne intensité de Fluorescence et d’exporter les valeurs.
   3. Soustraire l’arrière-plan FI partir des valeurs mesurées des FI au sein de la région. Puis, de normaliser les mesures FI corrigées en divisant par la moyenne, FI des 9 premiers cadres avant de photoactivation de référence corrigée. ΔF/F = ((FI-FI_b)/mean(FI_1-9)-FI_b)).
      NOTE : Le graphique ΔF/F comme une fonction du temps.
2. Distance
   1. Obtenir le x et y coordonnées du centre de la région de photoactivation.
      1. Pour déterminer x et y coordonnées du centre de la région de photoactivation, sélectionnez masque pour mettre en évidence la région qui a été photoactivées. Une fois que la région de photoactivation est mis en surbrillance, sélectionnez Analyze | Masquer les statistiques | Centre de la zone et exporter les valeurs.
   2. Déterminer x et y les coordonnées pour la sonde fluorescente d’intérêt pour chaque point dans le temps. Ceci est généralement réalisé par suivi de particules manuel ou automatisé.
      1. Pour déterminer x et y coordonnées de la sonde fluorescente d’intérêt, sélectionnez Manuel Particle Tracking et cliquez sur la sonde fluorescente d’intérêt au fil du temps. Une fois que tous les points dans le temps ont été l’objet d’un suivi, sélectionnez Analyze | Masquer les statistiques | Centre de la zone et exporter les valeurs.
   3. Calculer la distance entre la protéine fluorescente d’intérêt et le centre de la région de photoactivation pour chaque point de temps à l’aide de l’équation : Distance = √ ((x₂- x₁)²+ (y₂an -₁)²), où x₂ et y₂ représentent les coordonnées de la protéine fluorescente d’intérêt et x₁ et y₁ sont les coordonnées du centre de la région de photoactivation.
   4. Le graphique de la distance en fonction du temps.

Results

L’approche de photoactivation et imagerie permet d’observation et quantification facile des réponses signalisation rapides, polarisées. Pour illustrer ses capacités, reproduites ici est une expérience examinant la corrélation spatio-temporelle entre l’accumulation induite par le TCR DAG et réorientation du centrosome. 5 C. Explosions de cellule C7 T ont été retrovirally transduites avec deux reporters fluorescents : un biocapteur DAG contenant les domaines de C1 en tandem de la protéine k...

Discussion

Ces dernières années, la lumière a émergé comme un excellent outil pour activation spatio-temporelle contrôlée des processus cellulaires. Diverses méthodes ont été développées, chacune avec les inconvénients et les avantages associés. Le système décrit ici, qui repose sur la decaging des ligands immobilisés, extracellulaires, est parfaitement adapté pour l’analyse des réponses de signalisation rapides, subcellulaires, polarisées. Cette approche a été appliquée afin d’examiner la formation IS dans les cellules de T comme ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Coverglass chambré	Thermofischer Scientific	155361
Bromhydrate de poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636	Devra fabriquer du Poly-L-Lysine biotinylé
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Devra fabriquer du Poly-L-Lysine
Streptavidin	biotinylé Thermofischer Scientific	434301
BirA-500 : Kit de réaction standard biotine-protéine ligase BirA	Avidity	BirA500	Sera utilisé pour biotinyler les protéines
biotinylées Hb I-EK  ;			Pour le repliement des protéines, voir référence 6. Pour la biotinylation, utilisez le kit BirA
Biotinylé NPE-MCC I-EK  ;	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) peut être acheté auprès d’Anaspec
Biotinylated &alpha ; Anticorps H2-Kk	BD Biosciences	553591
NPE-OVA biotinylé H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) peut être acheté auprès d’Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db  ;	Les	protéines synthétisées personnalisées Anaspec (KAVYDFATL) peuvent être achetées auprès d’Anaspec
			Pour le repliement des protéines, voir la référence dans le protocole. Pour la biotinylation, utilisez le kit BirA
Lampe UV portative	La	UVP UVGL-25	est maintenue à 1 cm de l’échantillon.  ; 30 s de lumière 365 suffisent pour un décageage détectable, 20 min pour un décageage quantitatif.
Système TIRF Olympus IX-81 OMAC.	Olympus		Vous trouverez des informations supplémentaires sur le système d’imagerie dans Figure 6
Mosaic digital diaphragm	Andor
Slidebook	software Intelligent Imaging Innovations