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Article de méthode

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

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DOI :

10.3791/56660

⸱

19 novembre 2017

 , 
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

Dans cet article

Résumé

Le microenvironnement tumoral acide joue un rôle crucial dans la progression tumorale. Afin d’évaluer les effets des acides pH extracellulaire sur le cancer des cellules in vitro, nous avons établi des systèmes de culture acides simples.

Résumé

Conditions du microenvironnement tumoral, telles que l’hypoxie ou à la famine en éléments nutritifs, jouent un rôle crucial dans la progression du cancer et des tumeurs malignes. Cependant, le rôle des acides pH extracellulaire à l’agressivité de la tumeur et son mécanisme sous-jacent n'a pas été étudié par rapport à des conditions de famine hypoxique ou en éléments nutritifs. En outre, une méthode de culture bien définie pour imiter le microenvironnement de la tumeur extracellulaire acide n’a été entièrement signalée.

Nous présentons ici une méthode de culture simple in vitro afin de maintenir à l’aide de l’acide pH extracellulaire réduit de bicarbonate et une augmentation de lactate ou HCl concentration dans le milieu de culture. Le pH du milieu a été maintenu pendant au moins 24 h et progressivement diminué de 72 h après culture des cellules de cancer du pancréas PANC-1 et CNPA-1. Trois conditions de milieu acide distincts dans cette étude hautement surexprimés des gènes sensibles aux pH tels que MSMO1, INSIG1et IDI1 comparativement à l’hypoxie ou à la famine en nutriments. La stimulation de l’expression de ces gènes peut servir comme indicateur de pH acide. Ces techniques simples sont bénéfiques pour élucider les mécanismes sous-jacents de la malignité de la tumeur sous microenvironnement tumoral acides. Notre système de culture extracellulaire acide pH permet donc, découverte des réponses cellulaires acides pH non seulement dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans les cellules primaires, telles que les cellules tubulaires rénales, en ce qui concerne les autres acides troubles notamment, acidocétose diabétique, l’acidose lactique, l’acidose tubulaire rénale et une acidose respiratoire.

Introduction

Le microenvironnement tumoral joue un rôle crucial dans la progression tumorale et cancer cell metabolism1,2,3. Cellules cancéreuses sont souvent exposés à des conditions telles que l’hypoxie, appauvrissement nutritif et acide pH extracellulaire (pHe). Cependant, le rôle de pHe dans la progression tumorale n’a pas été précisé aussi largement comme la famine d’hypoxie ou d’éléments nutritifs. La pHe dans le tissu de la tumeur peut devenir acide, atteignant environ pH 6,84,5. Le pH acide résulte de l’excrétion de glycolyse aérobie et anaérobie des protons (H+) et lactate par la prolifération du cancer cellules5,6.

Des études récentes ont révélé que histone pHe induite par l’acide désacétylation, oxydation des acides gras et exocytose des lysosomes acides pour l’adaptation à l’environnement acide sévère7,8,9,10. Cependant, les mécanismes par lequel l’acidification extracellulaire affecte comportement du cancer et l’identité de la clé dans le microenvironnement tumoral de pH acide, les organismes de réglementation n’ont pas été entièrement établis. En outre, plusieurs rapports décrivent divers milieux de pH acide en utilisant des concentrations peu claires de bicarbonate, de tampon HEPES, Tris et tuyaux ou de lactate et de HCl, mais il y a peu de rapports pour démontrer la stabilité de l’ajusté moyenne ni complète Comparaison de plusieurs milieux de culture acides distincts7,8,9,10

Afin d’élucider les régulateurs clés et des changements métaboliques dans les cellules cancéreuses dans le contexte de l’acidification extracellulaire, nous avons établi un modèle de culture simple in vitro afin de maintenir un acide pHe et a examiné le rôle de pHe dans le cancer des cellules11. En utilisant cette méthode, nous avons maintenu un milieu de culture acide avec un pHe de 6,8 à 37 ° C moins de 5 % CO2, en utilisant des concentrations réduites de bicarbonate dans le milieu de culture. pH 7,4 a été utilisé comme d’habitude et moyen de contrôle. Le pH du milieu a été maintenu pendant au moins 24 h et progressivement diminué après 72 h au cours de la culture de cellules de cancer du pancréas PANC-1 et CNPA-1. Parce que la glycolyse améliorée accélère l’excrétion de non seulement des protons, mais aussi des lactate7,8,9, nous avons aussi établi une méthode de culture imitant acidose induite par le lactate par ajout de lactate, plutôt que de réduire la concentration de bicarbonate. En outre, induite par l’HCl acide pHe dans le milieu nous permet d’exclure la possibilité que des réponses cellulaires à pH acide milieu de culture ne sont pas en raison d’une diminution de la concentration de bicarbonate. En outre, à l’aide de différents médias avec un pH de 6,4 à 7,4 avec concentration de bicarbonate différents, nous pouvons évaluer l’étendue des effets de pHe sur les réponses cellulaires.

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Protocole

1. préparation du milieu de Culture acide

  1. Préparation du contrôle (pH 7,4) et le milieu de culture de faible pH (pH 6,8)
    1. Dissoudre 4,75 g de poudre DMEM sans L-glutamine dans 500 mL d’eau.
    2. Préparer 0,33 M NaHCO3 solution dans un flacon étanche à la pression.
      ATTENTION : Il est important d’utiliser une bouteille étanche pression émet de NaHCO3 CO2 gaz lorsqu’il est chauffé et thermiquement décomposée.
    3. Stériliser le milieu et la solution. Permettre à ces tampons refroidir à 25 ° C.
    4. Ajouter 5 mL de 200 mM de L-glutamine, 5 mL de pénicilline-streptomycine et 50 mL de sérum de veau fœtal dans 500 mL de DMEM sans bicarbonate.
    5. Pour fluide de pilotage (pH 7,4), ajouter 2,4 mL de 0,33 M NaHCO3 solution par 100 mL de DMEM sans bicarbonate. Pour les moyennes de faible pH (pH 6,8), ajouter 0,6 mL de 0,33 M NaHCO3 solution par 100 mL de DMEM sans bicarbonate.
    6. Vérifier le pH du milieu après 24 h d’incubation à 37 ° C de moins de 5 % de CO2.
      Remarque : La quantité de NaHCO3 solution doit être ajustée selon le pH du milieu, qui peut différer selon la teneur en CO2 de l’incubateur et la pression de l’air. Dans l’idéal, pour la première fois, il est préférable de mesurer le pH du milieu avec différentes concentrations de bicarbonate pour déterminer le montant approprié de NaHCO3 solution ajouter à DMEM.
      1. Récupérer le milieu de culture immédiatement après avoir enlevé la boîte de Pétri de l’incubateur à CO2 et mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre. Maintenez la température moyenne à 37 ° C avec un bain d’eau si nécessaire. Mesurer le pH du milieu trois fois indépendamment.
        NOTE : NaHCO3 solution doit être conservée à 4 ° C et chaque media doit être fraîchement préparées. Produits disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la Table des matières.
  2. Préparer le milieu de culture acide induite par le lactate ou induite par l’HCl
    1. Ajouter 74 µL de solution de lactate ou 125 µL de 1 M HCl à 100 mL de milieu de contrôle (préparé à l’étape 1.1.5).
    2. Vérifier le pH du milieu après 24 h d’incubation à 37 ° C de moins de 5 % de CO2.
      Remarque : La quantité de lactate ou HCl solution doit également être ajustée en fonction du pH du milieu, qui peut différer selon la teneur en CO2 dans l’incubateur et la pression de l’air. Idéalement, il est préférable de mesurer le pH du milieu avec serial lactate ou des concentrations de HCl pour déterminer le montant approprié pour l’ajuster au pH désiré du milieu.

2. la récolte et le traitement des cellules

  1. Commencer à cultiver des cellules à 37 ° C, moins de 5 % de CO2 au moins 1 semaine avant d’effectuer des expériences.
    Remarque : Les lignées cellulaires utilisées dans cette étude sont répertoriées dans la Table des matières.
  2. Cellules de passage lorsqu’ils atteignent la confluence de 70 à 90 %. Ne laissez pas les cellules à devenir confluentes. Changer le milieu tous les 2-3 jours pendant la culture quotidienne.
  3. Laver les cellules en ajoutant 5 mL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter enzyme détachant tels que 1 mL de la trypsine.
  4. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont arrondies et commencent à se détacher.
  5. Ajouter 5 mL de milieu de culture pour les cellules individuelles et désactiver l’enzyme. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 3 min à 300 x g. aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec milieu de culture.
  6. Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et le bleu Trypan.
  7. 5 graines 5.0 x 10 cellules/puits d’un plat de 10 cm dans 10 mL de milieu. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C moins de 5 % de CO2.
  8. Aspirez le milieu de culture, laver les cellules avec 5 mL de PBS et ajouter 10 mL de milieu de culture acide préparé dans la Section 1. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C moins de 5 % de CO2.

3. les ARN

  1. Milieu de culture d’aspirer et laver les cellules avec 5 mL de PBS. Perturber les cellules par ajout de réactif d’extraction d’ARN (voir Tableaux des matériaux).
  2. Gratter le plat brièvement, puis retirez le réactif d’extraction d’ARN avec une pipette et déposer le RNA extraction réactif/lysat cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Laisser à température ambiante pendant 5 min.
  3. Ajouter 250 chloroforme µL et agiter le tube vigoureusement pendant environ 15 s. congé à température ambiante pendant 5 min et centrifuger à ≥ 8, 000 x g pendant 5 min.
  4. Retirer délicatement la phase aqueuse à l’aide d’une pipette. Laissez derrière certains de la phase aqueuse. Placer dans un autre tube de 1,5 mL.
  5. Ajouter 550 µL isopropanol dans la phase aqueuse et mélanger doucement. Laisser à température ambiante pendant 5 min. centrifugeuse à vitesse maximale (≥ 20, 000 x g) pendant 20 min à 4 ° C.
  6. Décanter l’isopropanol et ajouter 1 mL d’éthanol 75 % au DEPC l’eau traitée. Mélanger doucement. Centrifuger à 8 000 x g pendant 5 min.
  7. Pipetter, au large de l’éthanol et les laisser que sécher à l’air les pellets.
  8. Ajouter qu'environ 15 à 25 µL (selon le taux de rendement) de DEPC l’eau traitée au culot RNA. Mélanger soigneusement.
  9. Mesurer la concentration de l’ARN isolé en mesurant le diamètre extérieur à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

4. synthèse de cDNA

  1. Combiner les composants suivants dans un tube de réaction PCR : jusqu'à 5 µg d’ARN total, 1 µL Oligo dT (50 µM) ou mélange aléatoire de Primer (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP et exempte de nucléase eau pour un volume total de 14 µL.
  2. Mélanger et centrifuger brièvement les composants à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse petite (~ 5 s). Dénaturer l’échantillon/amorce d’ARN pendant 5 min à 65 ° C. Tourner brièvement (~ 5 s) à l’aide d’une petite table centrifuger et mettre l’échantillon rapidement sur la glace pendant au moins 1 minute.
  3. Ajoutez les composants suivants : 4 µL 5 x tampon Reverse Transcription, 1 µL de la Transcriptase inverse (200 U/µL), 1 µL inhibiteur de RNase (40 U/µL).
    NOTE : Exemples de kits disponibles dans le commerce sont montrées dans la Table des matières
  4. Bouchon du tube, mélanger et centrifuger brièvement le contenu à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse petite (~ 5 s). Incuber le mélange de réaction combinée à 50-55 ° C pendant 10 min.
  5. Inactiver la réaction en incubant à 80 ° C pendant 10 min.

5. mesure de l’Expression des gènes sensibles aux acides à l’aide de la PCR en temps réel

  1. Combiner les composants suivants dans une plaque 384 puits réaction : 1 µL modèle cDNA, µL 0.75 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM avec impatience apprêt, 0,3 µL 50 µM reverse primer, 1 µL Taq polymérase, 2,5 µL 10 x mémoire tampon de la Taq polymérase, 2,5 µL 20 mM dNTP, 16,65 µL eau.
    NOTE : Exemple des kits disponibles dans le commerce sont montrées dans la Table des matières. Une liste d’amorces est indiquée dans le tableau 1. Une plaque 96 puits de réaction peut être également utilisée dans cette étape. Autres sondes (p. ex., sonde Taqman) peuvent également être utilisés.
  2. Mettre en place l’expérience et le programme PCR suivant sur un système de PCR en temps réel : 50 ° C pendant 2 min, 1 cycle ; 95 ° C pendant 10 min, 1 cycle ; 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min, 40 cycles ; 95 ° C pendant 15 s, 1 cycle ; 60 ° C pendant 15 s, 1 cycle ; 95 ° C pendant 15 s, 1 cycle.
  3. Placer la plaque dans l’instrument de qPCR. Démarrez le programme.
    NOTE : Stimulation de l’expression des gènes sensibles pH MSMO1, INSIG1et IDI1 peuvent être mesurée par le taux de protéines.

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Résultats

Pour déterminer la concentration de bicarbonate approprié, nous avons préparé DMEM à distance de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentration finale dans le milieu de culture) et succède à la préparation de milieux de culture avec un pH allant de 6,4 à 7,4 (Figure 1). Nous avons préparé DMEM avec 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) comme un moyen de contrôle et de 2 millimètres NaHCO3 (pH 6,8) comme un moyen avec un pH acide selon un précédent rapport, af...

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Discussion

Ici, nous avons décrit un système simple de pH acide de la culture et de son processus d’évaluation. La combinaison des trois méthodes d’acidification moyenne, c'est-à-dire, concentration de bicarbonate réduit, ajout de lactate et addition de HCl, nous a permis d’étudier le mécanisme de pH-réponse soigneusement et de comparer la réponse cellulaire à l’autre tumeur conditions micro-environnementales telles que l’hypoxie ou nutriment famine.

La clé de cette méthode est de déterminer les...

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Déclarations de divulgation

L’auteur Ayano Kondo est un employé de Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Remerciements

Nous remercions les membres de la Division des sciences du génome et le laboratoire de biologie des systèmes et la médecine, RCAST, l’Université de Tokyo. Nous remercions tout particulièrement m. H. Aburatani, Dr T. Kodama, (LSBM, RCAST, l’Université de Tokyo), Dr K. Tomizuka, Dr A. et Dr T. Yoshida
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) pour des discussions utiles et soutien. Ce travail a été partiellement soutenu par la subvention pour scientifique (A) (26710005, T.O.), Young subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (26116711 et 16 H 01567, T.O.) et subvention pour défier
Recherche exploratoire (16K 14605, T.O.) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon, le FNS Takeda (T.O.), la Fondation Kobayashi de recherche sur le Cancer (T.O.) et le projet de recherche sur le Cancer et Evolution thérapeutique (P-créer) et la pratique en recherche pour la lutte contre le Cancer innovateur de la Japan Agency for Medical Research and Development, AMED (T.O.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs
Milieu Aigle modifié de Dulbecco" Nissui" 2Nissui05919
Sérum fœtal bovinThermo Fisher10438
NaHCO3Wako191-01305
Solution de L-glutamineThermo Fisher25030-081
Solution mixte de pénicilline-streptomycine (stabilisée)Nacalai09367-34
Solution de 0,5 g/l-Tripsin/0,53 mmol/l-EDTA, avec rouge de phénolNacalai32778-05
0,5 %-Trypan Blue Stain SolutionNacalai29853-34
Solution d’acide lactiqueSigma-Aldrich252476
Solution d’acide chlorhydriqueSigma-AldrichH9892
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134
SuperScript IV Système de synthèse de premier brinThermo Fisher18091
Power SYBR Green PCR Master Mix  ;Biosystèmes appliqués4368702
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Cell lines
PANC-1ATCCCRL-1469
AsPC-1ATCCCRL-1682
KMS-6JCRB Cell Bank
TIGJCRB
JCRB0432 MRC9ATCCCCL-212
HUVECATCCCRL-1730
fortEntrepriseNuméro de catalogue>
>Equipment
NanoDrop One avec Wi-FiThermo FisherND-ONE-W
Système de PCR en temps réel QuantStudio 5Thermo FisherCRL-1682
Banque de cellules

Références

  1. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
  2. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  3. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  4. Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
  5. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
  6. Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
  7. McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
  8. Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752(2015).
  9. Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
  10. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).
  11. Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).

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