Article de méthode

Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’évaluer l’hétérogénéité d’Amplification de gène HER2 dans les Cancers du sein

DOI :

10.3791/56686

⸱

5 décembre 2017

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1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une distribution hétérogène de cellules HER2-positif peut être observée dans un sous-ensemble des cancers du sein et génère des dilemmes cliniques. Ici, nous introduisons un protocole fiable et rentable pour définir, quantifier et comparer HER2 une hétérogénéité génétique intra-tumeur dans une grande série de cancers du sein traités de façon hétérogène.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des thérapies ciblées contre le récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2 ont changé radicalement les résultats des patients atteints de cancers du sein HER2-positif. Cependant, une minorité de cas affiche une distribution hétérogène de cellules HER2-positif, qui génère des défis cliniques majeurs. A ce jour, aucun protocole fiable et standardisé pour la caractérisation et la quantification des hétérogène amplification de gène HER2 dans des cohortes n’ont été proposées. Nous présentons ici une méthode de haut débit afin d’évaluer en même temps le statut HER2 dans différentes zones topographiques de plusieurs cancers du sein. En particulier, nous illustrons la procédure de laboratoire pour construire des microarrays de tissu amélioré (TMA) incorporant un mappage ciblé des tumeurs. Tous les paramètres TMA ont été spécialement optimisés pour l’hybridation d’argent in situ (SISH) fixés au formol les tissus mammaires (FFIP) inclus en paraffine. L’analyse immunohistochimique des biomarqueurs pronostiques et prédictifs (c.-à-d., ER, PR, Ki67 et HER2) doit être effectuée à l’aide de procédures automatisées. Un protocole SISH personnalisé a été appliqué pour permettre une analyse moléculaire de haute qualité à travers de nombreux tissus qui ont subi des procédures de fixation, de traitement et de stockage différentes. Dans cette étude, nous fournissons une preuve du principe que les séquences d’ADN spécifiques pourraient être cancers mammaires simultanément localisées dans des zones distinctes de topographiques de multiple et hétérogène transformés à l’aide d’une méthode efficace et rentable.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HER2 est un proto-oncogène qui est surexprimé et amplifié dans 15 à 30 % de tous les invasive breast cancer1,2. La surexpression de HER2 est déduite par la présence de > 10 % des cellules avec membrane forte immunohistochimie (IHC) coloration (3 +), tandis que l’amplification de gène peut être évaluée lorsque le ratio de HER2/centromère est ≥ 2 ou que le nombre de copies du gène est ≥6, sur le comptage au moins 20 cellules par in situ hybridation (ISH)3.

Une hétérogénéité génétique intra-tumeur a été largement décrite dans les cancers du sein, étant un contributeur néfastes à l’évaluation de biomarqueurs et traitements réponse4. Selon le College of American Pathologists (CAP), hétérogénéité HER2 existe si HER2 est amplifié chez > 5 % et < 50 % d’infiltration tumorale sériés5. Malheureusement, l’incidence réelle de l’hétérogénéité spatiale HER2 dans les cancers du sein reste un sujet de controverse entre les pathologistes, avec certains auteurs soutenant que c’est un événement extrêmement rare, et d’autres suggérant que jusqu'à 40 % des cas sont HER2-hétérogènes1,5,6,7,8,9,10. Malgré les mécanismes biologiques qui sous-tendent cette condition sont pas encore totalement clarifiées, les effets cliniques et pronostiques de l’hétérogénéité intra-tumeurs HER2 sont cruciales pour breast cancer patients11.

Récemment, lumineux-zone des techniques moléculaires, comme chromogène ISH (CISH) et argent ISH (SISH), étaient devenus des méthodes fiables pour détecter les HER2 hétérogénéité dans les tissus FFIP, avec quelques avantages par rapport aux fluorescents ISH (poisson)12. Malheureusement, l’analyse en vrac des cas unique reste impraticable dans les études de cohorte importante. Plusieurs groupes ont suggéré que la combinaison d’histochimie, IHC et ISH avec technologies TMA pourrait constituer une stratégie utile dans l’étude du cancer biology13,14,15,16. Avec cette méthode largement adoptée, des échantillons de tissus provenant de patients différents peuvent être analysés en même temps, réduisant au minimum le tissu et les réactifs utilisés et favorisant ainsi l’analyse uniforme d’une grande série de cas14. Cependant, aucun des protocoles ne sont disponibles pour la caractérisation moléculaire simultanée de haut débit de plusieurs échantillons de tissus qui a subi une transformation différente en termes de réactifs, temps de fixation et des méthodes de conservation indépendants, par exemple sous le nom d’archives pâtés de maisons.

Étant donné les implications pronostiques et cliniques de l’hétérogénéité spatiale HER2 dans les cancers du sein, nous avons développé une plateforme intégrée moléculaire pour évaluer en grande série de cas hétérogène transformés. Ici, nous dépeindre les stratégies de laboratoire pour générer et analyser l’hétérogénéité intra-tumorale de HER2 amplification dans la TMA de rendement élevé de cancer du sein au moyen de l'ES. Le protocole suivant a été développé pour les tumeurs mesurant > 5 mm (> pT1b selon la classification TNM 2017)17. Pour les lésions plus petites, nous recommandons de procéder l’analyse sur des coupes sériées intégral. Notre procédure permet l’analyse simultanée d’IHC et recueillent des jusqu'à 30 cancers du sein, qui englobe une moyenne de 6 zones distinctes (intervalle de 4 à 8) pour chaque cas. Au total, 180 carottes de tissu de 1 mm de diamètre, avec 500 µm entre les noyaux et de 2 mm entre la grille et les bords seront générés pour chaque bloc TMA.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été approuvée par le Conseil de révision institutionnelle de IRCCS Ca' Granda Foundation, l’hôpital Policlinico, Milan, Italie.

1. sélection des Patients et des échantillons de tissus

  1. Récupérer les slides d’archivage de tous les cas à analyser, y compris toutes les disponible hématoxyline et éosine (H & E) IHC diapositives depuis le diagnostic initial et, le cas échéant, un H & E d’égalé le tissu mammaire non néoplasiques (p. ex., marge chirurgicale) .
  2. Effectuer les révisions de cas.
    Remarque : Pour cette tâche, au moins deux pathologistes avec expérience en pathologie mammaire devraient discuter les diapositives de diagnostics et résoudre les désaccords collégialement. Utiliser un microscope classique ou outils de télépathologie (favorable à ces derniers dans des études multicentriques). Le cas échéant, exclure tous les cas discordants.
    1. Effectuer la re-classification histologique de tous les cas, selon la dernière édition de la classification de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) des tumeurs du sein18.
    2. S’assurer que le tissu normal pour chaque cas, s’il est présent dans les échantillons cliniques d’archivage, comprend au moins une unité canalaire-lobulaire terminale non néoplasiques.
    3. Identifier toutes les zones néoplasiques voir hétérogènes cytologiques, architectural, ou IHC caractéristiques à l’aide d’un microscope lumineux-zone (doit être effectuée conjointement par un pathologiste et techniciens qui construira la TMA).
  3. Mettez en surbrillance les zones topographiques discrets avec un marqueur sur la lame de verre ou avec le bon outil sur un logiciel de diapositives numériques (Figure 1 a).
  4. Se fondant sur les diapositives sélectionnées, récupérer les blocs FFIP correspondants provenant des archives.
    Remarque : Pour optimiser la TMA construction, afin d’éviter l’appauvrissement des tissus et de préserver la TMA punch intégrité structurale, cas avec < 1 mm d’épaisseur tissu résiduel doit être exclu.

2. concevoir et construire des TMA basée sur la Technique de Kononen

  1. Créer et ouvrir un nouveau fichier de feuille de calcul comportant les comptes rendus des zones distinctes de chaque cas. Comprennent les données suivantes sur des colonnes distinctes, comme illustré dans le tableau 1 : ID de cas, bloc ID, ID de zone, type de tissu (par exemple, les tissus normaux, composant envahissantes histotype, in situ composant histotype), topographie (p. ex., noyau de la tumeur, avant envahissante), morphologie (p. ex., qualité nucléaire, architecture, mitoses, caractéristiques cytologiques), statut des biomarqueurs (p. ex., récepteurs de œstrogènes (ER), récepteur de progestérone (PR), Ki67 et HER2) et toutes les autres fonctionnalités d’IHC disponibles.
    1. Enregistrez le document.
  2. Créez un projet TMA.
    1. Installez et ouvrez le logiciel de concepteur de TMA.
    2. Définir le destinataire de la TMA ou des blocs : accès via le menu File > New > bloc ou en utilisant CTRL + B.
    3. Cliquez dans le premier champ à remplir ou appuyez sur la touche de tabulation et tapez dans les dimensions du bloc de paraffine : largeur 35 (mm) hauteur (mm) 20. Tapez « 2 » comme valeur « marge » (c'est-à-dire, la distance du bord de la paraffine en mm) (Figure 1 b). Enregistrer les données en cliquant sur le bouton approprié. Le nouveau modèle du bloc destinataire est maintenant enregistrée et prête à être utilisée dans les nouveaux modèles de tableau de tissu.
    4. Créez un projet de tableau des tissus : accès au menu File > New > tissu Array ou à l’aide de CTRL + T.
    5. Indiquer le nom de l’auteur, commentaires et tableau tissu, puis cliquez sur « suivant ». Cliquez sur l’icône « import », choisissez le fichier de modèle de bloc destinataire créée précédemment et cliquez sur « suivant ».
    6. Choisissez 1 mm comme taille de spot en cliquant sur le bouton rond. Choisissez 500 µm comme spot espacement qui est l’espace entre deux centres de spots voisins. Cliquez sur l’icône représentant une calculatrice pour calculer le nombre total de spots créés, qui devrait être 231. Cliquez sur « suivant ».
    7. Définir le mode de numérotation spot en cliquant une fois dessus. Cliquez sur le bouton « définir » pour créer des grilles et des grilles. Supprimez la ligne centrale (ligne 6) et les colonnes 8 et 15. Maintenir les 3 points de la ligne 1 pour l’orientation. La carte finale devrait porter sur un nombre total de 183 points, tel que représenté dans la Figure 2.
    8. Définir la liste des types de tissus : accès via le menu File > New > Liste des types de tissus ou à l’aide de CTRL + L.
    9. Insérer les descriptions de tissus préalablement définies. Appuyez sur flèche vers le bas ou cliquez sur le bouton + pour ajouter une ligne.
    10. Définir le projet : accès via le menu Fichier > Nouveau > projet Booster ou à l’aide de CTRL + p.
    11. Indiquer le nom de la gamme de tissus, commentaires et auteur, puis cliquez sur « suivant ». Importer le fichier de feuille de calcul, la liste des types de tissus et le modèle de tableau de tissus créé précédemment en cliquant l’icône appropriée.
    12. Cliquez sur « tout sélectionner » et définissez le nombre de places pour chaque type de tissu ; Cliquez sur le bouton « match » pour appliquer les paramètres. Un tableau énumérant le nombre total de cœurs qui sera échantillonné et transférés aux bénéficiaires blocs dans ce projet s’affiche. Enregistrez le projet et fermer le programme.
  3. Préparer les blocs de l’accepteur (Figure 1 b).
    1. Remplir des moules métalliques nettoyés avec paraffine élastique à 65 ° C.
    2. Laissez les blocs de paraffine pour refroidir à température ambiante pendant une nuit à l’intérieur des moules métalliques.
    3. Extrait les blocs de paraffine les moules métalliques. En cas de fissures, jeter le bloc et répétez les étapes 2.3.1-2.3.3.
  4. Construire la TMA en utilisant un arrayer automatisée ou semi-automatisée19.
    1. Récupérer toutes les blocs FFIP et les sections correspondantes de H & E avec des annotations.
    2. Activer l’arrayer et insérer l’accepteur ou des blocs sur le carrousel arrayer.
    3. Ouvrez le logiciel de station de contrôle arrayer, cliquez sur « Nouveau tissu Array » et chargez le projet précédemment créé (Figure 1).
    4. Cliquez sur « Continuer » et sélectionnez la position du ou des blocs du donneur dans le menu.
    5. Définir la position de départ sur chaque bloc destinataire : utilisez les touches fléchées pour déplacer le faisceau laser et l’aligner avec le bord supérieur gauche sur la paraffine du bloc destinataire.
    6. Cliquez sur « suivant » et répéter pour l’alignement vertical.
    7. Cliquez sur « suivant » pour créer automatiquement un trou dans la coordonnée définie précédemment du bloc destinataire (accepteur).
    8. Vider le poinçon.
    9. Placez le bloc de donateurs pour l’échantillonnage et retirer un noyau de tissus de la zone précédemment annotée d’intérêt.
    10. Insérez le noyau de tissu donneur dans l’orifice du bloc destinataire (accepteur).
    11. Retirer le bloc de donateurs de l’arrayer.
    12. Répétez les étapes 2.4.5-2.4.11 jusqu'à ce que l’ordre des médecins sont terminée.
  5. Mettez l’intrados du bloc TMA nouvellement généré sur une diapositive vierge stérile et placez-les dans le four de laboratoire à 45 ° C pendant 5 min.
  6. Appuyez doucement sur le bloc sur la lame pendant 5 s pour aplatir les noyaux du tissu. Répéter une fois (pour un total de 2 fois).
  7. Retirer le bloc TMA avec la diapositive du four, retourner et détacher délicatement le bloc de la diapositive.
  8. Couvrir la surface du tissu TMA avec une fine couche de paraffine élastique à 65 ° C.
  9. Laissez le bloc TMA à température ambiante pendant 2 h.
  10. Transfert du bloc TMA à 4 ° C pendant 24 h.
    Remarque : Le bloc TMA peut être stocké à 4 ° C jusqu'à l’épuisement.

3. histochimiques et Analyses immunohistochimiques

  1. Couper des sections de la TMA.
    1. Placez les TMA accepteur ou des blocs avec la paraffine-face vers le bas sur une surface de-10 ° C pendant 10 min refroidir la paraffine.
    2. Remplir un bain flottant avec de l’eau ultrapure et régler chaleur à 38 ° C.
    3. Placez une lame neuve sur un microtome rotatif et insérez le bloc dans le mandrin de microtome, donc le bloc de cire fait face à la lame et est aligné dans le plan vertical.
    4. Approcher le bloc délicatement avec la lame et couper quelques coupes minces afin d’assurer que le positionnement est correct ; ajuster si nécessaire.
    5. Couper 3 sections µm d’épaisseur.
    6. Ramasser les sections à l’aide de la pince à épiler et elles flottent sur la surface l’eau de la baignoire.
    7. Choisir les sections sur l’eau du bain sur lames de verre ordinaire et IHC/ISH.
    8. Placez les diapositives sur une grille et stockez-les dans le four à 45 ° C durant la nuit.
      Remarque : Une fois préparés, les sections TMA devraient être colorées sous 24h.
  2. Effectuer une coloration histochimique (H & E) à l’aide d’un appareil.
    1. Insérer les diapositives dans le support de l’appareil et placez-les à 60 ° C pendant 10 min.
    2. Ouvrir le tiroir de chargement de l’appareil et insérer que le panier avec le TMA glisse dans l’une des stations de charge avec une pince standard de H & E vers l’extérieur.
    3. Une fois que le tiroir est fermé, le clip sera automatiquement reconnu par le système, et débutera le protocole suivant : station de four à 37 ° C (6 min), xylène (2 min), xylène (2 min), l’éthanol 100 % (2 min), l’éthanol 100 % (2 min), éthanol à 95 % (2 min), éthanol à 95 % (2 min) , distillée eau (4 min), hématoxyline de Carazzi (9 min), l’eau courante à basse pression (2 min), éosine 1 % (1 min), l’eau courante à basse pression (2 min), éthanol à 95 % (20 s), éthanol à 95 % (20 s), éthanol à 95 % (20 s), éthanol à 95 % (20 s), éthanol 100 % (15 s), l’éthanol 100 % (15 s) , xylène (30 s), xylène (30 s).
    4. Décharger les grilles du tiroir et monter la lame avec une lamelle couvre-objet.
      1. Recueillir une goutte de monture avec une pipette et le mettre sur un bord extérieur de la diapositive de la couverture.
      2. Placez le côté humide de la lamelle couvre-objet sur la diapositive et laisser le support sécher pendant 30 min.
  3. Effectuer IHC coloration pour ER, PR, Ki67 et HER2 à l’aide d’une immunostainer automatique.
    Remarque : Avant de commencer une course coloration, démarrage du système et vérifier les flacons de réactifs consommables (Table des matières) et les conteneurs à déchets.
    1. Placez les glissières TMA pour analyser à 60 ° C pendant 10 min.
    2. Démarrer l’instrument immunostainer et le logiciel.
    3. À la vue de l’accueil, cliquez sur protocoles, puis puis cliquez sur créer/modifier des protocoles.
    4. Sélectionnez la norme DAB (3, 3'-diaminobenzidine) procédure d’IHC pour modifier le modèle de base.
    5. Drapeau « Déparaffinage » dans la zone de liste et la valeur de la température moyenne à 72 ° C.
    6. Drapeau de la solution de démasquer cc1, la valeur de la température moyenne à 95 ° C et le temps d’incubation à 36 min.
    7. Drapeau de la boîte de l’anticorps primaire, insérez l’ID du distributeur en ligne ER (le logiciel instrument reconnaîtra le distributeur sur le Carrousel de réactif) et régler la durée de l’incubation à 16 min.
    8. Drapeau de la boîte de Counterstaining, sélectionnez l’hématoxyline I, ainsi que le temps d’incubation à 12 min.
    9. Cliquez sur le bouton « Enregistrer sous » et le nom du protocole.
    10. Répétez les étapes 3.3.3-3.3.9 pour les autres anticorps utilisant les temps d’incubation d’anticorps primaires à l’adresse suivante : PR 16 min, Ki67 16 min et HER2 12 min utilisent des anticorps préalablement diluée prêt à l’emploi (RTU).
    11. À la vue de l’accueil, cliquez sur créer des étiquettes.
    12. Cliquez sur protocoles et ajouter les protocoles ER, PR, Ki67 et HER2 pour chacun de la LMC à analyser.
    13. Cliquez sur le bouton de /Print étroite.
    14. Comme le modèle d’étiquette s’affiche, entrez les codes de la TMA pour l’étiquette.
    15. Cliquez sur le bouton imprimer pour imprimer les étiquettes et de les appliquer ensuite sur les diapositives de la TMA.
    16. Cliquez sur l’icône de l’appareil et réglez le mode de démarrage instrument comme « Prêt ».
    17. Ouvrez le capot qui couvre le Carrousel de réactifs et placer le système de détection des anticorps primaires, puis fermez le capot.
    18. Cliquez sur le bouton frontal sur un tiroir de diapositive pour ouvrir et fermer le tiroir en cliquant sur le bouton même charger les lames de la TMA.
    19. Définissez le mode de démarrage de l’instrument comme « opérationnel » et suivez les instructions.
    20. À la fin de l’exécution, décharger la TMA glisse en appuyant sur l’ouvrir tous les tiroirs à rincer et bouton rempli de diapositives sur l’instrument de contrôle de glisser en réchauffent l’eau savonneuse pour enlever tout réactifs restants.
    21. Laver les diapositives sous basse pression eau froide, déshydrater les diapositives TMA et d’appliquer une lamelle de verre à chaque diapositive.
  4. Effectuer une analyse IHC de ER, PR et HER2 suite à l’American Society of Clinical Oncology (ASCO) / CAP des lignes directrices et de Ki67 conformément aux recommandations de la Ki67 International au groupe de travail Cancer du sein (tableau 2).
    Remarque : Cette analyse doit être effectuée séparément dans les taches de tissus distincts par un pathologiste avec une expérience en pathologie mammaire.
    1. Évaluer l’expression de ER comme positif si ≥ 1 % des noyaux de cellules de tumeur sont immunoréactives20,21,22,23.
    2. Évaluer l’expression PR comme positif si ≥ 1 % des noyaux de cellules de tumeur sont immunoréactives20,21,22,23.
    3. Évaluer l’expression de HER2 comme : a) score 3 + si membrane circonférentielle coloration complète et intense, b) score 2 + si membrane circonférentielle la coloration est incomplète et/ou faible ou modérée et au sein de > 10 % des cellules tumorales envahissantes ou complète et coloration de la membrane circonférentielle est intense et à ≤ 10 % des cellules de tumeur invasive, c) score 1 + si membrane incomplète la coloration est faible/à peine perceptible et à > 10 % des cellules de tumeur invasive, d) négatif si aucune coloration n’est présente ou membrane la coloration est incomplète et faibles/à peine perceptible et au sein de ≤ 10 % de la tumeur invasive cellules3,24.
    4. Évaluer l’indice Ki67 comme le pourcentage de cellules présentant une coloration nucléaire au moins 1 000 cellules néoplasiques au hasard sélectionné plus de 10 domaines de forte puissance (grossissement 400 X)25.

4. SISH analyse de HER2

  1. Coupes de TMA (répétez l’étape 3.1).
  2. Effectuer SISH pour HER2 à l’aide d’une immunostainer automatique.
    1. Placez les glissières TMA pour analyser à 60 ° C pendant 10 min.
    2. Démarrer l’instrument immunostainer et le logiciel.
    3. À la vue de l’accueil, cliquez sur protocoles, puis puis cliquez sur créer/modifier des protocoles.
    4. Sélectionnez la procédure « U double ISH CKT » pour modifier le modèle de base.
    5. Pavillon « Séchage » dans la zone de liste et régler la température à 63 ° C pendant 20 min.
    6. Drapeau « Cellule conditionnement » dans la zone de liste, puis « cellule conditionnement CC2 » et réglez la température sur les temps d’incubation et de 86 ° C à 4 min.
    7. Drapeau CC2 doux (Cycle 1), Standard (Cycle 2) et étendu (Cycle 3) pendant 8 min, 12 min et 8 min, respectivement.
    8. Drapeau « ISH-protéase 3 » dans la zone de liste et définir le temps d’incubation à 16 min.
    9. Sélectionnez les sondes HER2DNP et CHR17DIG et définissez le temps d’incubation à 6 h.
    10. Mettre le linge à 76 ° C pendant 8 min.
    11. Régler la durée de l’incubation de polymère (SIL ISH DNP HRP) recueillent à 32 min.
    12. Régler la durée d’incubation d’argent chromogène (SIL ISH DNP CCDP) à 4 min.
    13. Régler la durée de l’incubation multimères rouge (rouge ISH creuser AP) à 24 min.
    14. Régler la durée d’incubation de chromogène rouge (rouge ISH creuser FR) à 8 min.
    15. Drapeau « Counterstaining » dans la zone de liste, sélectionnez « Hématoxyline II » et régler la durée de l’incubation à 8 min.
    16. Drapeau « contre-coloration post » dans la zone de liste, sélectionnez « Réactif de BLEUISSEMENT » et régler la durée de l’incubation à 4 min.
    17. Répétez les étapes de 3.3.11-3.3.15 (sélectionnez modification Protocole U double ISH CKT).
    18. Ouvrir le capot qui couvre le Carrousel de réactifs, placez le linge et les systèmes de détection d’ISH, puis fermez le capot.
    19. Répétez les étapes de 3.3.18-3.3.21.
  3. Effectuer une analyse de l'ES pour HER2: évaluer l’amplification de gène HER2 positif si le rapport de /CEP17 de HER2est ≥2. 0 avec une moyenne HER2 copie numéro ≥4.0 signaux par cellule et négatif si le ratio de /CEP17 de HER2est < 2.0 avec une moyenne de HER2 copier nombre < 4.0 signaux/cellule3,24.
    Remarque : Comme pour IHC, cette analyse doit être effectuée séparément dans les taches de tissus distincts par un pathologiste avec expérience en pathologie mammaire.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au total, 444 du sein envahissant les cancers ont été incorporées au 15 TMAs spécialement optimisés pour les analyses de l’ISH. Parmi les 2 664 points échantillonnés, 2 651 (99,5 %) étaient représentatifs des domaines précédemment sélectionnés et donc considérés comme propices pour les analyses suivantes. L’hétérogénéité intra-tumeur a été déterminée par IHC et SIH, avec un accent particulier sur la répartition hétérogène de clones de HER2-positif dans les zones topographiques distinctes ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons détaillé les stratégies de laboratoire pour effectuer les analyses SISH du gène HER2 et son centromère correspondante dans la TMA de rendement élevé des cancers du sein traités de façon hétérogène. Cette méthode est rentable et peut être effectuée dans la plupart des laboratoires pour l’étude de l’hétérogénéité amplification du gène HER2 dans des cohortes des archives de pathologie du sein Cancer Récupérée forme.

En raison de l’importance clinique de HER2 dans...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Allemagne, UE39601006Milieu d’enrobage tissulaire, 56 ° ; C point de fusion
Eosin Y  ; solution aqueuse à 1 %Bio Optica, Milan, Italie, UE510002Eosine jaunâtre, soluble dans l’eau
Carazzi' s hematoxylinBio Optica, Milan, Italie, UE506012Hématoxyline d’alun mûrie à l’iodate
de potassium Qualité diamantLaboindustria, Arzergrande, Italie, UE33533Lames de microscope 26x76 mm
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Allemagne, UE14046430011Milieu de montage, sans monomères, à base de polymères de méthacrylate de butylène dans
des lames de microscope FLEX IHCAgilent Technologies (Dako),  ; Santa Clara, CA, USAK8020Lames de microscope revêtues pour l’adhésion du FFPE pour une utilisation dans le système médical IHC
BenchMark ULTRAVentana, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSSystème de coloration des lames
CONFIRM Récepteur anti-œstrogène (ER) (SP1) Anticorps primaire monoclonal de lapinSystème médical Ventana, Tucson, AZ, USA790-4324Anticorps primaire, prêt à l’emploi
CONFIRM Récepteur anti-progestérone (PR) (1E2) Anticorps primaire monoclonal de lapinSystème médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis790-2223Anticorps primaire, prêt à l’emploi
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Anticorps primaire monoclonal de lapinSystème médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis790-4286Anticorps primaire, prêt à l’emploi
PATHWAY HER2 (4B5) Anticorps primaire monoclonal de lapinSystème médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis790-4493Anticorps primaires, prêt à l’emploi
ultraView Universal DAB Detection KitSystème médical Ventana, Tucson, AZ, USA760-500Système indirect, sans biotine, pour la détection des IgG de souris, des IgM de souris et des anticorps primaires de lapin
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH test - Hybridation in situ bicolore approuvé par la FDA pour déterminer le statut du gène HER2 chez les patientes atteintes d’un cancer du sein.
UltraView Silver ISH DNPKit Système médical Ventana, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG DetectionKit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Système médical Ventana, Tucson, AZ, USA780-4149Utilisé dans le processus ISH pour éliminer les protéines qui entourent les séquences d’ADN cibles d’intérêt
HématoxylineSystème médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis760-2021Réactif de contre-coloration à l’hématoxyline de Gill
modifié Hématoxyline II Systèmemédical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis790-2208Réactif de contre-coloration à l’hématoxyline de Meyer modifié
Réactif de bleuissementSystème médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis760-2037Solution aqueuse de carbonate de lithium tamponné pour le bleuissement des sections colorées à l’hématoxyline sur des lames de verre
HybReadyVentana, Tucson, AZ, USA780-4409Tampon à base de formamide pour les dosages
ISH EZ Prep (10x)Système médical Ventana, Tucson, AZ, USA950-102Solution concentrée pour l’élimination de la paraffine des échantillons de tissus pendant les réactions IHC et ISH, et pour diluer 1:10.
Tampon SSC (10X)Système médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis950-110La solution tampon de chlorure de sodium et de citrate de sodium est utilisée pour les lavages rigoureux et pour rincer les lames entre les étapes de coloration et fournir un environnement aqueux stable pour les réactions d’hybridation in situ. Diluer 1:5.
ULTRA LCSSystème médical Ventana, Tucson, AZ, USA650-210Solution de lamelle prédiluée (prête à l’emploi) utilisée comme barrière entre les réactifs aqueux et l’air pour empêcher l’évaporation dans les réactions IHC et ISH
Tampon de réaction (10x)Système médical Ventana, Tucson, AZ, USA950-300Solution tampon à base de Tris (pH 7,6 ± ; 0,2) pour rincer les lames entre les étapes de coloration pendant l’IHC et l’ISH. Diluer 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Système médical Ventana, Tucson, AZ, USA950-223Étapes de prétraitement dans le traitement d’échantillons de tissus pendant IHC et ISH. Prêt à l’emploi.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Système médical Ventana, Tucson, AZ, États-Unis950-224
ultraView Silver Wash IISystème médical Ventana, Tucson, AZ, USA780-003Solution prête à l’emploi pour rincer les lames entre les étapes de coloration IHC et ISH
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Allemagne, EURM 2255Microtome rotatif automatisé
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Allemagne, EUST 5020Poste de travail pour la coloration et le recouvrement automatisés
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1Arrayer semi-automatique pour la construction de TMA avec TMA Designer 2 logiciel embarqué
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne, UEK080254Appareil de capture d’images - scanner numérique de pathologie
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135Cassette
Tissue-Tek Paraform Moule de base standardSakura Finetek Europe B.V7055Moule en métal de base en acier inoxydable
Detection Système médical

Références

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