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Article de méthode

Injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique et livraison de cellule dans un modèle préclinique grand

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DOI :

10.3791/56699

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21 janvier 2018

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1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nouvelles stratégies thérapeutiques en médecine régénérative cardiaque nécessitent des études étendues et détaillées dans des modèles animaux précliniques grands avant ils peuvent être considérés pour une utilisation chez l’homme. Ici, nous démontrons une technique d’injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique chez le lapin, qui est précieux pour l’efficacité de ces traitements novateurs des tests d’hypothèses.

Résumé

Thérapie cellulaire et génique sont passionnants et des stratégies prometteuses dans le but de la régénération cardiaque dans le cadre de l’insuffisance cardiaque avec réduit la fraction d’éjection (HFrEF). Avant de pouvoir être considérées comme devant servir et mis en œuvre chez l’humain, des études précliniques sont tenus dans des modèles animaux grands pour évaluer l’innocuité, l’efficacité et sort de l’injection de co-Set (par exemple, les cellules souches) livrée une fois dans le myocarde. Petits rongeurs modèles offrent des avantages (p. ex., rapport coût/efficacité, susceptibilité manipulations génétiques) ; Cependant, compte tenu des limitations inhérentes à ces modèles, les résultats dans ces traduisent rarement à l’infirmerie. À l’inverse, grands modèles animaux comme les lapins, ont des avantages (p. ex., électrophysiologie cardiaque similaire, par rapport aux humains et autres animaux de grande taille), tout en conservant un bon équilibre économique. Ici, nous démontrons comment réaliser une technique d’injection (IMI) de guidée par échocardiographie intramyocardique contraste percutanée, qui est peu invasive, sûr, bien toléré et très efficace dans la prestation ciblée d’injectates, y compris les cellules, dans plusieurs localités dans le myocarde d’un modèle de lapin. Pour la mise en œuvre de cette technique, nous avons également pris avantage d’un système d’échocardiographie clinique largement disponibles. Après avoir mis en pratique le protocole décrit ici, un chercheur ayant connaissance de base d’échographie va devenir compétent dans l’exercice de cette technique polyvalente et mini-invasive pour utilisation en routine dans les expériences, visant à la vérification des hypothèses de la capacités de cardiaque thérapeutique régénératrice dans le modèle de lapin. Une fois que la compétence est atteint, l’ensemble de la procédure peut être réalisée au sein de 25 min après anesthésier le lapin.

Introduction

Thérapies cellulaires et géniques sont passionnant et jamais développer des stratégies pour régénérer/réparer le myocarde blessé dans HFrEF. Quelques études ont comparé l’efficacité (p. ex., taux de rétention cellulaire) des différentes routes de livraison de la cellule, qui ont constamment démontré la supériorité de l’IMI sur routes intracoronaire ou intraveineuse1,2 , 3 , 4 , 5. il n’est donc pas surprenant qu’une grande partie des études sur des modèles translationnelles de la thérapie de cellules souches du myocarde blessé, livrer l’injection co-Set via IMI réalisée sous vision directe dans un thorax ouvert procédure6,7 . Toutefois, cette approche présente plusieurs limites, y compris le caractère invasif de la procédure, qui comporte le risque de mortalité de peri-procédure (souvent sous-déclarée)8. En outre, un IMI sous vision directe n’élimine pas la possibilité pour une injection accidentelle dans la cavité ventriculaire. Dans la pratique clinique un IMI au cours de la chirurgie du thorax ouvert pourrait être une méthode appropriée pour la livraison de cellules thérapeutiques, par exemple, au cours de l’artère coronaire pontage coronarien (CABG) ; de la greffe Toutefois, cette approche peut ne pas convenir à livraison de cellule cardiomyopathie global d’origine non ischémique (p. ex., HFrEF secondaire à une cardiomyopathie induite par l’anthracycline (AICM)).

Il ne fait aucun doute que cardiopathie ischémique (IHD) est la cause la plus fréquente de HFrEF (~ 66 %)9,10; Toutefois, cardiomyopathie non ischémique, y compris AICM, touche encore une proportion importante de patients atteints de HFrEF (33 %)9 . En effet, les récents progrès en oncologie clinique ont donné lieu à plus de 10 millions de survivants du cancer dans les seuls Etats-Unis11, avec un nombre similaire en Europe, une tendance générale vers l’amélioration de la survie des patients atteints de cancer12 ,,13. Ainsi, explorer les avantages de nouveaux traitements tels que la greffe de cellules souches pour une cardiomyopathie non ischémique, ainsi que l’essai d’un itinéraire efficace et peu invasif de la livraison de cellules souches est d’une importance capitale, étant donné le nombre croissant de patients touchés par la cardiotoxicité secondaire aux médicaments anticancéreux.

À noter, des études utilisant la thérapie de cellules souches visant à la réparation/régénérer le myocarde blessé fréquemment des tests d’hypothèses implique l’utilisation de petits rongeurs (par exemple, les souris et rats). Ces modèles nécessitent souvent des systèmes à ultrasons cher haute fréquence pour l’évaluation de la fonction myocardique, généralement équipée de transducteurs de rangée linéaire qui ont certaines limites inhérentes aux associés (p. ex., réverbération)14. Toutefois, autres modèles tels que les lapins, ce qui représente un grand modèle préclinique, ont certains avantages pour les tests d’hypothèse des traitements de cellules souches chez HFrEF. Ainsi, contrairement à des rats et des souris, lapins maintiennent un système de transport+ 2 Ca et électrophysiologie cellulaire qui ressemble à celle des humains et autres animaux de grande taille (par exemple, les chiens et les porcs)15,16,17 ,18,19. Un autre avantage, c’est leur susceptibilité pour échographie cardiaque d’imagerie utilisant relativement peu coûteux et de systèmes d’échocardiographie clinique largement disponible équipés relativement transducteurs phase array haute fréquence, par exemple, 12 MHz, telles que ceux fréquemment utilisés en cardiologie néonatale et pédiatrique. Ces systèmes permettent l’imagerie échocardiographique excellent avec la pointe de la technologie, et ils profitent de la supériorité de harmonic imaging20. Par ailleurs, des tests d’hypothèse étendue du potentiel des thérapies régénératives cardiaques (par exemple, la thérapie de cellules souches), de leur sécurité, efficacité, cardiomyogénique potentiel, ainsi que d’évaluation du devenir de l’injection de co-Set une fois délivrées dans le myocarde, est obligatoire avant elles peuvent être considérées comme à usage humain, et ils nécessitent l’utilisation de grands modèles animaux précliniques, tels que le lapin17,19. Ici, nous décrivons une technique mini-invasive pour la livraison de la cellule via IMI contraste-échocardiographie percutanée guidée en utilisant un système clinique échocardiographie, qui vise à la thérapie à base de greffe de cellules souches non ischémique cardiomyopathie20 . Nous décrivons aussi les avantages de l’encre de Chine (InI, encre de Chine, également connu sous le nom) comme un traceur échographie de contraste agent et in situ de l’injection de co-Set dans le coeur de lapin.

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Protocole

Les expériences décrites dans les présentes ont été approuvées par le Comité éthique de la recherche de l’Université de Murcia, Espagne et ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE de la Commission européenne. Les étapes décrites ont été effectuées dans le cadre des protocoles d’exploitation standards qui faisaient partie du plan de travail et n’ont pas été effectuées uniquement dans le but de filmer la vidéo ci-jointe au présent document.

1. préparation des cellules et le vecteur d’Expression chez les mammifères

NOTE : Ici, nous décrivons brièvement un protocole pour la préparation et la transfection d’une lignée cellulaire (rein embryonnaire humain 293 (HEK-293)) ; Toutefois, les protocoles spécifiques de cellule appropriée pour le type de cellule d’intérêt devraient être optimisée (par exemple, les cellules souches).

  1. Maintenir les cellules HEK-293 en hyperglycémie Dulbecco de l’aigle modifié (DMEM) additionné de sérum de veau foetal de 10 % (FCS), 2 mM de Glutamine, pyruvate de sodium 1 %, 1 % pénicilline/streptomycine et incubés à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO2 . Une fois que les cellules sont Sub confluentes, divisé selon un ratio de 1:3.
  2. Commencer à diviser les cellules en aspirant les médias, puis lavage une fois avec le phosphate stérile solution saline tamponnée (PBS), enlever l’excès PBS et puis incuber avec 2,5 mL de 0,5 x acide de trypsine-tétraacétique (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Ajouter un volume de médias DMEM (complété comme décrit ci-dessus) pour arrêter la réaction, puis détacher les cellules en lentement et doucement aspirant de haut en bas avec une pipette électronique.
  3. Ensuite, transférer la suspension cellulaire à un conteneur approprié (par exemple, tube à centrifuger conique 15-50 mL). Centrifuger dans un seau de swing (x 100 g), éliminer le surnageant et laver le culot deux fois avec du PBS stérile.
  4. Resuspendre le culot dans les médias DMEM fraîches et graines à une densité de cellule appropriée (par exemple, 1 x 106 cellules dans une fiole de2 75 cm) en flacons de culture fraîche ou des grands plats selon les pratiques de laboratoire local.
    1. Remplacer les médias existants avec les supports neufs tous les 2 jours.
      Remarque : Le vecteur d’expression a été dérivé de pIRES1hyg et utilisé selon les instructions du fabricant comme décrites précédemment21. p(EGFP) IRES1hyg a été généré par subcloning EGFP ARNC comme un BamHI + NotI Insérez pEGFP-N1 dans le BamHI + NotI digéré pIRES1hyg21.
  5. 1 jour avant la transfection, les cellules de semences HEK-293 à une densité de 0,5 x 105 cellules/cm2 en plaques de culture de tissu de 12 ou 24 puits.
  6. Le jour de la transfection, préparer des ADN-lipides transfection réactif complexes dans des tubes de microcentrifuge séparée 1,5 mL (1 tube/puits).
    1. Commencez par ajouter 250 µL de milieu de sérum réduit dans chaque tube et puis ajoutez 4 µg ADN (mélanger délicatement).
    2. Par la suite, ajouter 250 µL du mélange préalablement préparé de 10 µL de réactif de transfection lipidique et 250 µL de milieu de sérum réduit, dans chaque tube (mélanger à nouveau doucement).
    3. Enfin, poursuivez transfections, en incubant les cellules HEK-293 avec complexes de réactif de transfection ADN lipides pendant 4 h, puis remplacer par milieu DMEM tel que décrit ci-dessus (étape 1.1) et incuber pendant une autre 48 h a. sélection de médicaments Perform Ecurie transfectants avec 100 µg/mL hygromycine B.
  7. Détacher les cellules HEK-293 avec la trypsine tel que décrit ci-dessus (étape 1.2). Après avoir lavé les cellules dans du PBS stérile, remettre en suspension dans un véhicule approprié (par exemple, 10 % v/v InI dans du PBS), d’obtenir une concentration finale de cellule de 5 x 106/ml.

2. préparation du lapin

NOTE : Le positionnement du lapin et le transducteur pour IMI n’est pas optimal pour évaluer la morphologie et le fonctionnement du cœur de l’animal. Ainsi, il est conseillé d’effectuer un examen échocardiographique complet20 avant l’IMI (voir ci-dessous) et aux périodes ultérieures telles que définies par le protocole expérimental. Cela aura pour but d’évaluer anatomique et fonctionnel caractéristiques de référence du coeur chez l’animal qui recevront une injection et également évaluer les effets, de l’IMI dans le fonctionnement du cœur.

  1. Effectuer cet examen de façon aveugle et suivant les directives du Comité de l’American College of Veterinary Internal Medicine et la American Society of Echocardiography/European Association échocardiographie d’imagerie cardiovasculaire 22 , 23 , 24.
  2. Obtenir un suivi simultané 1-plomb électrocardiogramme (ECG) tout au long de l’étude échocardiographique ensemble.
  3. Anesthésier le lapin avec la kétamine 10 mg/kg, combiné avec la médétomidine 200 µg/kg, intramusculaire (I.M.).
  4. Vérifier le niveau de l’anesthésie après 10-20 min après l’administration de l’anesthésie.
  5. À l’aide d’une tondeuse à cheveux enlever les poils de la poitrine largement (par exemple, au-dessous du cou dans la région sub xiphoid) (Figure 1 a).
  6. Rasage des régions supplémentaires de 1 à 2 cm2 sur la face interne de la patte avant droite (région mediocubital) et de deux membres postérieurs (région mediotibial) (Figure 1 b).
  7. Placer les électrodes ECG auto-adhésives sur les régions rasées des membres de façon synchrone de surveiller le rythme cardiaque au cours de la procédure (Figure 1).
  8. Placez l’animal en position couchée sur une couverture thermique, décubitus avec les membres tendus à l’aide de ruban chirurgical, attaché à la table (Figure 1).
    1. Veillez à ce que les oreilles sont fléchis vers l’arrière, derrière la tête/dos du lapin et à une position qui est plus faible que ses pattes avant, car cela aide à maintenir un positionnement correct du thorax de l’animal tout au long de la procédure.
  9. Permettre à l’animal de respirer spontanément alors qu’administrer de l’oxygène par masque facial dans l’ensemble de la procédure dans son ensemble (100 %, 2 à 3 L/min).

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Figure 1. Préparation du lapin pour IMI. (A) pince à cheveux du thorax ; (B) pince à cheveux de membres ; (C) fixer des électrodes et de positionner le lapin avec les jambes tendues sur une couverture thermique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. Technique de IMI guidée par échocardiographie de contraste percutanée chez le lapin

  1. Nettoyez et désinfectez la peau du thorax avec une solution de chlorhexidine.
    1. Utilisez une technique aseptique tout au long de l’ensemble de la procédure, selon les meilleures pratiques actuelles.
    2. Chaque fois que possible et si possible, effectuer une procédure totalement stérile, y compris, mais non limité à, l’utilisation de matériel stérile tels que robes, gants, chirurgicales enroulés tentures, pansements stériles pour la table, comme une échographie stérile gaine-housse et gel ultrasonique stérile. Cela permettra de réduire au minimum le risque d’introduction d’agents pathogènes à l’IMI de réception des animaux et est une pratique courante en milieu clinique (p. ex., au cours de la ponction cardiaque).
      Remarque : Il est recommandé de toujours procéder conformément aux réglementations locales et nationales de recherche animale applicable à l’institution locale et pays de la pratique.
  2. Appliquez du gel de transmission ultrasonique à la poitrine et/ou au transducteur, avec son câble transducteur autour de cou de l’expérimentateur, effectuer un balayage rapide de fenêtre du cœur de l’animal, qui est souvent utile de visualiser l’anatomie et de planifier l’IMI.
  3. Placer le transducteur manuellement au 4ème-6ème espace intercostal, 2-3 cm de la ligne parasternale droite avec un angle d’incidence de ~ 90 ° en ce qui concerne le côté droit de la paroi thoracique (Figure 2 a).
  4. Régler la position de la sonde par rapport à l’espace intercostal ainsi que ses antéro-postérieure et dorsoventral angle pour optimiser une vue axe court modifiés au niveau des muscles papillaires. Identifier dans ce point de vue, le ventricule droit (RV), ventricule gauche (VG), septum interventriculaire (IVS), paroi postérieure (PW), ainsi qu’antérolatérale (AL) et les muscles papillaires périostite (PM) (Figure 2 b).
    1. Avoir un large champ de vision en augmentant significativement la profondeur en utilisant le contrôle approprié sur le système (p. ex., bouton, cadran).
    2. Une attention particulière à l’obtention d’une image symétrique dans cette vue, mais aussi une différenciation appropriée des contours endocardiques et épicardiques et, si nécessaire, régler au moyen de contrôles d’optimisation image (par exemple, gain).
  5. Une fois la vue échocardiographique optimale est obtenue (Figure 2 b), maintenir cette position pendant tout le reste de la procédure, alors qu’un deuxième opérateur effectue l’IMI (voir ci-dessous).
    1. Tout en tenant le transducteur, évitez de cacher la marque orientation transducteur, qui doit toujours être dirigé vers l’avant, permettant ainsi à son alignement avec l’aiguille dans les étapes suivantes (Figure 2 a, C).
  6. Avec une aiguille 24-G attachée à une seringue de 1 mL, placer l’aiguille près du cuir chevelu de l’hémithorax gauche en position de mise en miroir symétrique en ce qui concerne le transducteur. Ensuite, aligner manuellement l’aiguille avec la marque de l’orientation de transducteur à un angle de ~ 90° (Figure 2) et avancer lentement l’aiguille à travers la peau et dans la cavité thoracique.
    Remarque : L’insertion de l’aiguille percutanée dans cette position et l’orientation facilite la visualisation de l’aiguille dans le plan du faisceau ultrasonore (Figure 2D, E), permettant ainsi la surveillance en temps réel et, si nécessaire, adaptation des l’emplacement de l’aiguille par rapport à la région cible du myocarde (Figure 2 G, H).
  7. Avec la pointe à l’emplacement cible, lentement livrer l’injection de co-Set (à 0,25 mL par site d’injection) au sein de 10-30 s (Figure 2E), tandis que lentement et doucement se rétracter l’aiguille pendant l’injection pour augmenter l’étendue du myocarde traités.
    1. Utilisez InI 10 % (v/v) dilué dans du PBS de normalisation de la technique et comme un traceur sur place tout en acquérant des compétences, aussi bien quant à confirmer le succès ciblant tous les quatre sites de IMI dans le myocarde de la pathologie et l’histopathologie (voir Représentant des résultats). Lorsqu’on atteint les compétences, InI pourrait être remplacé par un agent de contraste ultrasonore commercial adapté si vous le souhaitez.
      NOTE : Remise de 10 % (v/v) InI dilué dans du PBS avec ou sans cellules dans la donne myocarde transmural hyperechogenicity (c.-à-d., écho aspect brillant) sur le site de cible d’injection (Figure 2E, F). Transitoire décélération ou accélération du rythme cardiaque, associé à des contractions ventriculaires prématurées (p. ex., isolé, distiques et les triplés) sont fréquemment observés dès le premier contact de l’aiguille avec l’épicarde ainsi que pendant ou peu après l’IMI. Toutefois, aucune arythmie mortelle n’est élaborées et des effets indésirables aigus sont rarement observés en utilisant jusqu'à 0,25 mL (1,25 x 106 cellules) d’injection co-Set par site d’injection IMI (voir Représentant résultats et Discussion).
  8. Effectuer des changements subtils dans l’angle d’incidence de l’aiguille comme nécessaire pour terminer les injections de 0,25 mL pour chacun des sites de IMI quatre cible (trois dans la ventricule gauche libre mur (LVFW) et celui de l’IVS).
  9. À l’issue de la procédure d’IMI guidée par échocardiographie de contraste percutanée, évaluer le rythme cardiaque (par exemple, par le biais de série ECG trace et/ou 24h Holter ECG) et effectuer des analyses échocardiographiques fenêtre pour vérifier l’absence de complications, jusqu'à ce que l’animal est complètement remis de l’anesthésie et seulement puis transfert à un cycle de lumière ambiante.
    1. Ici, nous utilisons 24h Holter ECG pour surveiller les effets de l’IMI avec InI sur le rythme cardiaque pendant 24 h. Pour ce faire, nous avons comparé un groupe de 6 lapins avec phénotype normal (groupe Normal) et un groupe de 6 lapins ayant reçu l’administration intraveineuse de la doxorubicine (cardiotoxiques anthracycline médicament a, couramment utilisé pour le traitement du cancer ; Groupe DOX) à une dose de 2 mg/kg/semaine pendant 8 semaines et ensuite les deux cohortes reçu IMI avec InI.

figure-protocol-2
Figure 2 . Injection de contraste percutanée guidée par échocardiographie intramyocardique chez le lapin. (A) mise en place de la sonde dans l’hémithorax droite selon un angle de ~ 90 °. (B) image représentative d’une vue d’axe court parasternale (PSSX) du cœur au niveau des muscles papillaires chez le lapin. (C) l’alignement de l’aiguille à un angle de ~ 90 ° par rapport à la marque de l’orientation du transducteur. (D) emplacement de l’aiguille sur le site de cible dans une vue PSSX du cœur (à noter que l’aiguille est facilement visualisée dans le plan du faisceau ultrasonore). (E et F) démonstration de hyperechogenicity sur le site cible sur intramyocardique injection avec l’encre de Chine (pointes de flèches en surbrillance la hyperechogenicity transmurale). Situation accidentelle (G) l’aiguille dans la chambre de LV (pointes de flèches en surbrillance le puits d’aiguille). (H) de repositionnement de l’aiguille de la paroi libre du LV (pointes de flèches en surbrillance le puits d’aiguille). RV = ventricule droit ; LV = ventricule gauche ; IVS = septum interventriculaire ; PW = paroi postérieure ; AL = antérolatérale muscle papillaire ; PM = périostite muscle papillaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. publier des Analyses IMI

  1. Effectuer une analyse histopathologique des échantillons de tissu cardiaque de lapins.
    1. Fixer le tissu pendant 24 h dans 10 % de formaldéhyde, puis par déshydratation avec l’augmentation des concentrations d’éthanol comme suit :
      • 1 x à 70 % (60 min)
      • 1 x dans le 95 % ethanol/5% méthanol (60 min)
      • 1 x à 100 % (60 min)
      • 1 x à 100 % (90 min)
      • 1 x à 100 % (120 min)
      Remarque : Tous les incubations ci-dessus sont effectuées à température ambiante (RT). Puis, remplacer par deux fois avec 100 % de xylène (1 h, RT) et enfin incorporez à la paraffine en deux étapes (60 min, 58 ° C)25.
    2. Effectuer des coupes de tissu de 4 à 5 µm avec un microtome25. Monter les sections sur les diapositives.
    3. Effectuer la coloration à l’hématoxyline-éosine et méthodes trichrome de Masson25,26,27.
  2. Dans des sections de tissu des coeurs transplantés, exécutez immunohistochemistry pour détecter les cellules EGFP(+) HEK-293 (p. ex., en utilisant la méthode de (ABC) complexe avidine-biotine), brièvement :
    1. La cire coupes de coeur épais de 4 à 5 µm à 100 % de xylène (10 min, à ta). Réhydrater les tissus en le lavant avec une diminution de solutions éthanoliques concentration (x 2 à 100 % (2 min) 2 x dans 95 % (2 min) 1 x à 70 % (2 min) ; 1 x à 50 % (2 min) ; 1 x dans 30 % (2 min) ; 1 x ddH2O (2 min)) à température ambiante.
    2. Effectuer l’inhibition peroxydase endogène en couvrant les sections avec 100 µL de 3 % H2O2 dilué dans du méthanol (préparé avec 5 mL de solution mère de 30 % de H2O2et ajout de méthanol vers le haut pour un volume total de 50 mL) ( incuber 30 min, RT) et ensuite lavage par immersion avec une solution saline tamponnée de Tris (SCT ; pH 7,6).
    3. Effectuer l’antigène mise à nu par traitement enzymatique, en couvrant les sections avec 100 µL de 0,1 % la Pronase (préparée avec 0,01 g la Pronase diluée dans 10 mL TBS) (12 min, RT d’incubation), puis laver avec le SCT (5 min, RT).
    4. Incuber en bloquant la solution (sérum de chèvre normal à 10 % au SCT) à l’aide de 100 µL par glisser (30 min, RT) et le laver avec le SCT (5 min, RT).
    5. Incubez avec protéines fluorescentes poulet anti-verte (GFP) comme anticorps primaire (1/500 au SCT) (1 h, 30 ° C) et laver avec le SCT (5 min, RT).
    6. Incubation avec l’anticorps secondaire biotinylé chèvre-anti-poulet IgG (1/250 au SCT) (1 h, 30 ° C) et laver ensuite avec le SCT (5 min, RT).
    7. Incubez avec complexe avidine-biotine (20 min, 30 ° C) et alors l’étiquette à l’aide de tétrahydrochlorure 3,30-diaminobenzidine (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Enfin, déshydrater par lavage dans l’augmentation des concentrations d’éthanol (1 x à 30 % (2 min) ; 1 x à 50 % (2 min) ; 1 x à 70 % (2 min) ; 2 x dans 95 % (2 min) x 2 à 100 % (2 min)) à ta, contre-colorant sections à l’aide de la méthode de l’hématoxyline-éosine25et puis monter les lames de la couverture. Inclure le positif, négatif, ainsi que de l’isotype contrôles.
      Remarque : Le protocole bref décrit ci-dessus n’est pas prévu pour usage général immunohistochimie ; optimisation pour les tissus d’intérêt et conditions est nécessaire.

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Résultats

IMI du contraste percutanée guidée par échographie avec InI :

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, et une fois le positionnement optimal de la pointe de l’aiguille a été confirmé par échocardiographie et l’injection initié, transmurale hyperechogenicity a été observée lors de la livraison de l’InI (10 % v/v dans du PBS) (Figure 2E) , aussi bien que peu de temps après l’IMI à ...

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Discussion

L’objectif principal était de développer une technique mini-invasive qui pourrait être utilisée pour la livraison des cellules souches dans le myocarde de lapins (un grand taille animal modèle préclinique)17,18, tout en profitant de l’utilisation d’un relativement peu coûteux d’imagerie système facilement disponible dans de nombreuses cliniques et centres de recherche. Ici, nous montrons que, en utilisant un système d’échocardiographie clinique, et aidé par l’InI...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz et Manuel Molina excellent soutien apporté lors de la collecte des données et Carlos Bueno pour fournir les cellules EGFP(+) HEK-293. Ce travail a été soutenu en partie par : Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Espagne (JT) (numéro de licence : 11935/PI/09) ; Rouge de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, de VI PN j’ai + D + I 2008-2011 (subvention no. RD12/0019/0001) (JMM), cofinancé par les fonds structurels de l’Union européenne (FEDER) (JMM) ; et, de l’Université de Reading, Royaume-Uni (AG, GB) (financement Central). Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système d’échographie HD11 XEPhilips10670267Système d’échocardiographie.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz transducteur à réseau
de phases Gel de transmission à ultrasons (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  ; cathéter à l’aiguille
Omnifix-F Seringue de 1 mlBraun9161406V
Imalgene (Kétamine)MerialRN 9767Une prescription vétérinaire est nécessaire
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3Une prescription vétérinaire est nécessaire
Coussin
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99Inde (Chine) Encre
Holter SyneflashEla médicalSF0003044Ssystème Holter ECG 24 h.
Électrodes Blue Sensor® ;Ambu (NUMED)VLC-00-SÉlectrodes ECG Holter.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
MicroscopeOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Kit complexe de biotine Avidin.
Anticorps anti-GFP de pouletInvitrogenA10262Anticorps primaire.
Anticorps IgG de chèvre biotinylés anti-pouletLaboratoired’anticorps secondairesBA-9010
3,30-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco' s Eagle medium modifié (DMEM)  ;Fisher Scientific11965084
10 % de sérum de veau fœtal (FCS)Fisher Scientific11573397
0,05 % d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (réactif de transfection lipidique)Fisher Scientific11668019
milieu sérique réduit (Opti-MEM)Fisher Scientific
Hygromycine BCalbiochem (MERCK)400051
Xylène (histologique)Fisher ScientificX3S-4
Solution de peroxyde d’hydrogène (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU
chauffant.Microscope à fluorescence Carl 31985070

Références

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