Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

Résumé

Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.

Résumé

L’atrophie géographique (GA), le dernier stade de la dégénérescence maculaire liée à l’âge sèche se caractérise par la perte de la couche pigmentaire rétinien épithéliale (RPE), qui mène à la dégénérescence ultérieure des structures rétiniennes vitales (par exemple, photorécepteurs) causant déficience visuelle grave. De même, pre-perte et diminution de l’acuité visuelle est vu dans suivre à long terme jusqu'à des diabétiques avancée liées à l’âge dégénérescence maculaire humide (AMD) recevant un traitement anti-vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF) intravitréenne. Par conséquent, d’une part, il est fondamental pour calculer efficacement les cellules RPE provenant d’une source illimitée qui pourrait servir de traitement substitutif. En revanche, il est important d’évaluer le comportement et l’intégration des cellules dérivées d’un modèle de la maladie entraînant chirurgicale et des méthodes d’imagerie comme près que possible de celles appliquées dans les humains. Ici, nous fournissons un protocole détaillé basé sur nos publications antérieures qui décrit la génération d’un modèle préclinique de l’Assemblée générale à l’aide de le œil de lapin albinos, pour évaluer les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des cellules épithéliales pigmentaire rétinien (CSEh-RPE) dans un paramètre cliniquement pertinente. PRE-CSEh différenciée sont transplantées yeux naïfs ou les yeux NaIO₃-induite de GA-comme la dégénérescence rétinienne à l’aide d’une technique 25 G transvitreal pars plana. Évaluation des zones dégénérées et transplantés est réalisée par imagerie en temps réel non invasif multimodale à haute résolution.

Introduction

Ce protocole décrit la génération d’un modèle préclinique grand aux yeux de l’atrophie géographique (GA) qui permet l’évaluation de l’intégration de CSEh-RPE transplanté dans l’espace sous-rétinienne. Les méthodes décrites en détail ici ont été utilisés dans les 3 publications récentes qui démontrent la production d’une population enrichie, pure et fonctionnelle des cellules RPE de CSEh¹, ainsi que la création de dommages rétiniens externe et un phénotype de type GA induite par l’injection sous-rétinienne de solutions salines et physiologiques (c.-à-d., BSS et PBS) ou NaIO₃ dans le lapin yeux^2,3. De plus, nous avons démontré que greffes de suspension sous rétinien de CSEh-RPE forment une vaste monocouches fonctionnelles avec photorécepteur sauvetage capacité².

Plusieurs avantages accompagnent l’utilisation de le œil du lapin pour la génération d’un modèle de GA de la maladie. Tout d’abord, la taille de le œil du lapin, qui est de 70 % le volume d’un œil humain adult, permet cliniquement significative transplantation en utilisant une densité cellulaire qui est beaucoup plus faible que couramment utilisés dans les petits yeux rongeur (1 000 cellules/µL par rapport à 50 000 cellules/µL)^{4 , 5}. Deuxièmement, la chirurgie chez les rongeurs est généralement transscleral par le biais de la choroïde, qui compromet la barrière rétinienne et potentiellement déclenche une réaction inflammatoire et un éventuel rejet⁶. Ensemble, les deux facteurs peuvent conduire à multicouches et agglutination des cellules transplantées et une intégration dans l’ensemble pauvre des cellules transplantées dans un tissu rétinien natif perturbé. Toutefois, le modèle de lapin aux grands yeux permet de réaliser une technique chirurgicale avec instrumentation identique au milieu clinique. Troisièmement, un modèle aux grands yeux permet également à haute résolution in vivo d’imagerie et de surveillance des cellules transplantées et la rétine sus-jacente à temps^1,2,3. Ainsi, les auteurs décrivent un modèle préclinique cliniquement pertinent et rentables qui devrait être une alternative intéressante aux rongeurs pour tous ceux qui s’intéressent à la recherche de la rétine normale et malade et l’espace sous rétinien.

Protocole

Le protocole suivant suit les directives de protection des animaux de Karolinska Instituet. Toutes les expérimentations animales, à l’aide de lapins albinos de Nouvelle-Zélande (Table des matières) ont été approuvées par le Comité régional d’éthique animale (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permis : dnr 56/15). L’utilisation des CSEh (dnr 2011/745-31/3) et le transfert et la manipulation des CSEh-RPE (dnr 2013/813-31/2) est aussi conformément à la législation suédoise Karolinska Institutet et a été approuvé par le (Comité de l’éthique humaine régionale Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm).

1. sous-rétinienne Injection d’Iodate sodique (NaIO₃) dans un modèle Animal aux grands yeux

1. Anesthésier les animaux par voie intramusculaire dans la cuisse avec un mélange de kétamine 35 mg/kg et de xylazine 5 mg/kg de sérum physiologique à l’aide d’une seringue de 30 G, et dilater les pupilles avec collyre topique à l’aide d’un mélange de phényléphrine cyclopentolate et 2,5 % de 0,75 %. Bonne anesthetization est confirmée si l’animal ne réagit pas à une pincée dure de sa patte arrière.
2. Placer le lapin sous le microscope chirurgical avec la tête orientée vers le chirurgien (Figure 1 a). Utilisez un rétracteur de couvercle pour enlever une membrane nictitante et de paupières avec un linge stérile pour minimiser le risque de contamination. Utilisation équilibrée de solution saline (BSS) pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie dans les deux yeux.
3. Pour microchirurgie, utiliser un port-2 (ou 3-port en option) 25 G transvitreal pars plana technique avec des valves des trocarts pour l’insertion des instruments microchirurgicaux (Figure 1 b). La machine de vitrectomie multifonction dispose de ports pour connecter une canule d’infusion unique, endoillumination, vitrector et endolaser. Pour les injections sous-rétinienne, seulement l’endoillumination est obligatoire, qui fait une mise en place de 2 ports suffisante. Insérer l’endoillumation par le trocart gauche supérieur et utiliser le trocart droit supérieur pour la canule d’injection sous-rétinienne.
   1. Pour une configuration 3-port, utilisez le trocart temporal inférieur pour la canule de perfusion BSS. Si les instruments optionnels (par exemple, un vitrector) sont utilisés, introduisez-les à travers le trocart droit supérieur.
   2. Insérer les trocarts supérieurs 2 1-2 mm du limbe à l’aide de pinces à griffes pour attraper et déplacer la conjonctive recouvrant le site d’insertion.
   3. Assurez-vous que les trocarts sont insérée transsclerally un angle 30-45° limbus parallèles et continuez jusqu’au milieu de la pointe du trocart. Puis tournez le trocart à 90° et avancer dans le œil, visant au pôle postérieur de l’oeil. Cette procédure va éviter une fuite après une chirurgie de le sclerotomies et également réduire le risque d’endophtalmie (c'est-à-dire, une infection bactérienne dans les yeux). Voir aussi la Figure 2 b pour les postes de trocart.
   4. Mettre une lentille de contact à usage unique plat sur la cornée afin de visualiser la rétine, avec des larmes synthétiques comme gel de contact entre l’oeil et la lentille de contact (Figure 1 a).
   5. Attirer 500 µL de NaIO₃ dans une seringue de 1 mL relié à un tube d’extension (exploité par l’assistant) et une canule de polytip 38 G (opéré par le chirurgien).
   6. Insérer la sonde d’endoillumination par le trocart gauche supérieure et la canule d’injection par le trocart droit supérieur et faire avancer la canule à travers l’espace vitré vers la rétine, visant pour la zone juste en dessous de la tête du nerf optique.
   7. Permettre à l’extrémité de la canule au toucher lentement la rétine jusqu'à ce qu’un blanchiment focal est visible. L’injection elle-même va pénétrer la rétine, permettant une livraison sous-rétinienne. Ne laissez pas la canule pénètrent dans la rétine, car cela peut provoquer une hémorragie.
   8. Injecter 50 µL de NaIO₃ subretinally pendant 5 s. Étant donné qu’un plan de clivage naturel entre la rétine et la choroïde sous-jacente, une cloque translucide visible fasse progressivement pendant l’injection.
   9. Pendant l’injection, lentement rétracter l’aiguille, mais veillez à ce que l’extrémité est maintenue dans la cloque pour minimiser le reflux.
   10. Après le retrait de la canule d’injection et d’endoillumation, enlever les trocarts, conformément à l’aide de pinces à griffes et appliquez une légère pression pendant 30 s aux sclerotomies sans suture hermétique à l’aide de la pointe ou l’extrémité arrondie de la pince.
4. En donner 10 mL de sérum physiologique par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation. Ne donnez pas de stéroïdes topiques post-chirurgicale ou antibiotiques. Analgésiques de donner 0,5 mL de buprénorphine 0,3 mg/ml par voie sous-cutanée après chirurgie, ainsi que le jour après la chirurgie.
5. Après utilisation, lavez tous les instruments en immergeant pendant quelques secondes tout d’abord dans l’éthanol à 70 %, deuxièmement en éthanol à 45 % et enfin dans l’eau distillée. Séchez-les bien avec une serviette en papier.
6. Assister les animaux jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience suffisante et placent tout seul amincie. Si nécessaire (par exemple, aux fins de l’immunohistochimie), euthanasier les animaux par injection intraveineuse de 100 mg/kg de pentobarbital (voir Table des matières).
7. Attendre 7 jours pour procéder à la transplantation de cellules de CSEh-RPE.

2. sous-rétinienne Transplantation de cellules de CSEh-RPE chez les animaux traités

1. Administrer 2 mg (100 µL) de triamcinolone intravitréenne chez des animaux anesthésiés à l’aide d’une aiguille d’injection de 30 g insérée 1-2 mm à partir du limbe dans le quadrant temporal inférieur 1 semaine avant la transplantation des CSEh-RPE et re-administrer tous les 3 mois. Assurez-vous de la pointe vers le pôle postérieur de le œil pour éviter une touche de lentille.
2. Culture une monocouche de CSEh-RPE comme décrit plus haut¹.
3. Supprimer les milieux de la différenciation cellulaire (voir Table des matières) d’une monocouche confluente 24 puits CSEh-RPE et laver chaque bien avec 500 µL de PBS sans Ca^{2 +} et Mg^{2 +}. Répétez l’opération une fois de plus, pour un total de 2 lavages.
4. Jeter le surnageant, ajouter 500 µL de trypsine chaque puits et incuber pendant 12 min à 37 ° C.
5. Inclinaison de la plaque et retirez délicatement la trypsine (cellules doivent rester attachées à la plaque). Prélever des cellules dans 800 µL de médias de différenciation préchauffée frais 37 ° C par la pipette doux, ou même gratter si nécessaire, pour obtenir une suspension monocellulaire.
   Remarque : Utilisez une passoire de cellule de 40 µm si on observe des amas de cellules.
6. Comte de cellules dans une hémocytomètre chambre à l’aide de 0,2 % bleu de Trypan, selon les instructions du fabricant.
7. Ajouter 5 mL de différenciation des cellules médias et centrifuger à température ambiante, 300 x g pendant 5 min.
8. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans du PBS de fraîchement stérilisée par filtration (passé à travers un filtre de seringue 25 mm) à une concentration finale de 1 000 cellules/µL.
9. Aliquote la suspension cellulaire précédent dans 600 µL d’extraits et de garder sur la glace jusqu'à et Pendant la chirurgie.
10. Anesthésier les animaux par voie intramusculaire dans la cuisse avec un mélange de xylazine kétamine et 5 mg/kg de 35 mg/kg de sérum physiologique à l’aide d’une seringue de 30 G. Dilater les pupilles avec collyre topique à l’aide d’amix de phényléphrine cyclopentolate et 2,5 % de 0,75 %. Bonne anesthetization est confirmée si l’animal ne réagit pas à une pincée dure dans sa patte arrière.
11. Placer le lapin avec la tête orientée vers le chirurgien. Utilisez un rétracteur de couvercle pour enlever une membrane nictitante et de paupières avec un linge stérile pour minimiser le risque de contamination. BSS permet de prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie dans les deux yeux.
12. Pour microchirurgie, utiliser un port-2 (ou 3-port en option) 25 G transvitreal pars plana technique avec trocarts placés dans les mêmes positions, comme décrit dans l’étape 1.3 et la Figure 2. Si les sclerotomies précédentes sont visibles, effectuez insertion trocart juste à côté, mais pas par l’intermédiaire de ceux-ci, afin de minimiser le risque de fuite postopératoire.
    1. Mettre une lentille de contact à usage unique plat sur la cornée afin de visualiser la rétine, avec des larmes synthétiques comme le gel de contact entre l’oeil et la lentille de contact (Figure 1 a).
    2. Après pointe bon positionnement (voir les étapes 1.3.5 et 1.3.6), injecter 50 µL d’une suspension de CSEh-RPE doucement mélangé (50 000 cellules) subretinally. But pour le centre de la zone de₃ prétraités NaIO que se distingue par un réflexe de la caractéristique « métallique » endo-illumination. La rétine neurosensorielle devrait séparer facilement créer une cloque clairement visible. Rincer l’aiguille stérile H₂O entre les deux lapins/après utilisation pour éviter le colmatage en raison de la cellule de l’aiguille des touffes. Changement de l’aiguille lorsque l’obstruction est remarqué.
    3. Pendant l’injection, lentement rétracter l’aiguille mais veillez à ce que l’extrémité est maintenue dans la cloque pour minimiser le reflux.
    4. Après le retrait de la canule d’injection et d’endoillumation, enlever les trocarts, conformément à l’aide de pinces à griffes et appliquez une légère pression pendant 30 s aux sclerotomies sans suture hermétique à l’aide de la pointe ou l’extrémité arrondie de la pince.
13. En donner 10 mL de sérum physiologique par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation. Ne donnez pas de stéroïdes topiques post-chirurgicale ou antibiotiques. Analgésiques de donner 0,5 mL de buprénorphine 0,3 mg/ml par voie sous-cutanée après chirurgie, ainsi que le jour après la chirurgie.
14. Après utilisation, lavez tous les instruments en immergeant pendant quelques secondes, tout d’abord dans l’éthanol à 70 %, deuxièmement en éthanol à 45 % et enfin dans l’eau distillée. Séchez-les bien avec une serviette en papier.
15. Assister les animaux jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience suffisante et placent tout seul amincie. Le cas échéant (p. ex. à des fins d’immunohistochimie), euthanasier les animaux par injection intraveineuse de 100 mg/kg de pentobarbital.

3. in Vivo rétinienne et imagerie sous-rétinienne

1. Utiliser un appareil de tomographie par SD-domaine spectral cohérence optique avec le logiciel qui l’accompagne (voir Table des matières) pour obtenir la transversales b-scans des animaux traités, conformément aux instructions du fabricant. Pour éviter les images floues, assurez-vous de garder la cornée humide en rinçant avec une solution saline topique toutes les 30 à 60 s.
   1. Placer les animaux anesthésiés et élève-dilatées (voir étapes 1.1 et 2.10) dans un montage réglable pour obtenir un tracé dégagé de la source lumineuse de l’instrument à la rétine de lapin.
   2. Obtenir au moins 3 OCT scans avec simultanée infrarouge-confocale ophtalmoscopie balayage de laser (IR-cSLO) des images de référence de la réflectance représentant la partie supérieure et centrale inférieure de la zone injectée.
   3. Obtenir des images de fond de œil en face avec cSLO bleu, vert, multicolore et infrarouge laser réflectance (c.-à-d., des couleurs laser simultanées multiples), respectivement.
   4. Capturer des images d’autofluorescence lumière bleue (FBA) en utilisant la capacité de laser lumière bleue de l’appareil SD-OCT.

Résultats

Représentant en vivo image de BAF, IR-cSLO et SD-OCT de la rétine de lapin albinos normales sont affichées à la Figure 2. Notez les différentes couches rétiniennes avec leurs niveaux distinctif de réflexion de la lumière captée par l’instrument de SD-OCT.

Dans les Figures 1 a et 1 b de la Figure, le programme d’installation crée de...

Discussion

Dans ce protocole, la génération d’un modèle aux grands yeux de GA et son usage préclinique pour évaluer les CSEh-RPE integration in vivo est décrite.

Pour la traduction de thérapies régénératives pour GA et les maladies apparentées dans la clinique⁷, il est important de développer et d’optimiser des méthodes qui capturent fidèlement les méthodes cliniques de transplantation et d’imagerie. Le lapin est dans cet aspect attrayant : il a un œil relativement import...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu de différenciation NutriStem hESC XF &ndash ; bFGF et &ndash ; TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS sans Ca2+ et Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Filtre à cellules 40 &mu ; m Nylon	VWR	732-2757
Aiguille 30 G 0.5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm Filtre à seringue		Acrodisc PN4612
0,4 % bleu trypan	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Utilisation à 0,2 %
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70 % d’éthanol	Solveco AB	1047
Kétaminol, 100 mg/mL	Intervet, Boxmeer	511519	Utilisation 35 mg/kg de kétamine
Rompun vet, 20 mg/mL	Bayer Santé animale	22545	Utilisation 5 mg/kg de xylazine
Triescence, 40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	par voie intravitériale
, 0,75 % + 2,5 %	APL	321968	Utiliser 1 goutte dans chaque œil
Viscotears	Laboratoires Thé ; a	597562
Solution saline topique	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Use 100 mg/mL pentobarbital
Tube d’extension (marteau)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G polytip canule sous-rétinienne	MedOne Surgical Inc	3219	25 g/38 g
Lentille plate à usage unique	Volk
Barraquer Colibri écarteur de couvercle	AgnTho’s AB	42-020-030
Trocarts sans soupape	Alcon Nordic A/S 8065751448
Pince à griffes	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Appareil de vitrectomie	Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomie TotalL Plus Pak Alcon	Nordic A/S	8065751493
appareil SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Utilisation de Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 plaques de puits	Sarstedt	83.3922
Hémocytomètre Neubauer	VWR	631-0925
Lapins albinos de Nouvelle-Zélande	Lidkö ; pings Rabbit Farm, Suède
		hESC-RPE	Voir numéro de référence 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Utiliser 0,5 mL de buprénorphine par voie sous-cutanée