À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

Nouran S. Abdelfattah; Ann Mullally

doi:10.3791/56726

Article de méthode

À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

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DOI :

10.3791/56726

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5 janvier 2018

Nouran S. Abdelfattah¹ , Ann Mullally¹^,²^,³

¹Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, ²Broad Institute, ³Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.

Résumé

Répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) est un système de l’immunité adaptative chez les procaryotes qui a été réutilisée par les scientifiques pour générer des nucléases RNA-guidé, comme associés à CRISPR (AC) 9 pour génome eucaryote in situ d’édition. Génie de génome par Cas9 sert à efficace, robuste et facilement modifier les gènes endogènes dans beaucoup de lignées cellulaires de mammifères biomédical pertinents et d’organismes. Ici, nous montrons un exemple de la façon d’utiliser la méthodologie CRISPR/Cas9 pour comprendre la fonction biologique de mutations génétiques spécifiques. Nous modélisons la calréticuline (CALR) mutations dans des cellules de (Ba/F3) de pro-B charge interleukine-3 (mIL-3) par la remise du seul guide RNAs (sgRNAs) ciblant le locus Calr endogène dans la région spécifique où insertion ou délétion (indel ) CALR mutations se produisent chez des patients atteints de syndromes myéloprolifératifs néoplasmes (NPP), un type de cancer du sang. Les sgRNAs créer des cassures double brin (CDB) dans la région ciblée qui sont réparés par fin non homologue rejoindre (NHEJ) pour donner des indels de différentes tailles. Ensuite, nous utilisons le test de transformation cellulaire standard Ba/F3 pour comprendre l’effet de l’expression de niveau physiologique des mutations Calr sur transformation cellulaire hématopoïétique. Cette approche peut être appliquée à d’autres gènes pour étudier leur fonction biologique dans diverses lignées cellulaires de mammifères.

Introduction

CRISPR/Cas9 technologie a récemment révolutionné génome ciblé d’édition dans les organismes et les cellules vivantes. Il est devenu un outil extrêmement puissant pour la recherche biomédicale et est actuellement utilisé comme une voie potentielle pour le traitement de maladies génétiques¹. La base de tous les outils d’édition du génome s’appuie sur la création d’une nucléase induite par l’ADN double brin pause (DSB) au locus génomique à modifier. La CDB peut être réparées par non homologue fin-rejoindre (NHEJ) ou axés sur l’homologie réparation (HDR)²^,³. L’avantage de la nucléase Cas9 s....