Article de méthode

À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

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DOI :

10.3791/56726

5 janvier 2018

Dans cet article

Résumé

Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.

Résumé

Répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) est un système de l’immunité adaptative chez les procaryotes qui a été réutilisée par les scientifiques pour générer des nucléases RNA-guidé, comme associés à CRISPR (AC) 9 pour génome eucaryote in situ d’édition. Génie de génome par Cas9 sert à efficace, robuste et facilement modifier les gènes endogènes dans beaucoup de lignées cellulaires de mammifères biomédical pertinents et d’organismes. Ici, nous montrons un exemple de la façon d’utiliser la méthodologie CRISPR/Cas9 pour comprendre la fonction biologique de mutations génétiques spécifiques. Nous modélisons la calréticuline (CALR) mutations dans des cellules de (Ba/F3) de pro-B charge interleukine-3 (mIL-3) par la remise du seul guide RNAs (sgRNAs) ciblant le locus Calr endogène dans la région spécifique où insertion ou délétion (indel ) CALR mutations se produisent chez des patients atteints de syndromes myéloprolifératifs néoplasmes (NPP), un type de cancer du sang. Les sgRNAs créer des cassures double brin (CDB) dans la région ciblée qui sont réparés par fin non homologue rejoindre (NHEJ) pour donner des indels de différentes tailles. Ensuite, nous utilisons le test de transformation cellulaire standard Ba/F3 pour comprendre l’effet de l’expression de niveau physiologique des mutations Calr sur transformation cellulaire hématopoïétique. Cette approche peut être appliquée à d’autres gènes pour étudier leur fonction biologique dans diverses lignées cellulaires de mammifères.

Introduction

CRISPR/Cas9 technologie a récemment révolutionné génome ciblé d’édition dans les organismes et les cellules vivantes. Il est devenu un outil extrêmement puissant pour la recherche biomédicale et est actuellement utilisé comme une voie potentielle pour le traitement de maladies génétiques1. La base de tous les outils d’édition du génome s’appuie sur la création d’une nucléase induite par l’ADN double brin pause (DSB) au locus génomique à modifier. La CDB peut être réparées par non homologue fin-rejoindre (NHEJ) ou axés sur l’homologie réparation (HDR)2,3. L’avantage de la nucléase Cas9 s....

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Protocole

1. sgRNA Design à l’aide des outils en ligne13

  1. Conception sgRNAs ciblant le gène d’intérêt à l’aide des outils disponibles gratuitement en ligne.
    1. Copiez et collez la séquence de référence NCBI du gène d’intérêt dans l’outil de web designer sgRNA Broad Institute : (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Remarque : Cet outil identifie les séquences sgRNA avec des sites de clivage dans les exons et ceux qui s’étendent sur la frontière intron/exon mais toujours s’attacher dans l’exon.
    2. Télécharger et ouvrir le fichier de sortie de texte dans excel.
    3. Met....

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Résultats

À l’aide de la méthode décrite ici, l’objectif de cette expérience est d’étudier les effets fonctionnels de l’introduction de mutations indel au locus Calr endogène sur la transformation des cellules hématopoïétiques. Le système CRISPR/Cas9 est utilisé comme un outil pour créer des mutations Calr endogènes dans les cellules de Ba/F3. Deux sgRNAs ont été choisis pour cibler l’exon 9 du Calr (Figure 1), dans la région où les insertion.......

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Discussion

Nous démontrons l’utilisationdes CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier la fonction biologique de CALR mutations dans les cellules hématopoïétiques. Le succès de ce protocole est fortement tributaire de plusieurs facteurs. Tout d’abord, il est important de savoir quels types de mutations peuvent être responsables du phénotype que l'on souhaite. Dans ce protocole, l’affichage est la transformation des cellules de Ba/F3 à mIL-3 l’indépendance et les types de mutations sont indels dans l’exon 9 de CALR. Tou.......

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Déclarations de divulgation

Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les NIH (R01HL131835), une bourse de chercheur clinique de Damon Runyon et le Consortium de Cancer Starr.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BsmBINew England BiolabsR0580L
BlasticidineSigma Aldrich15025
PuromycinLife TechnologiesA1113803
cellules Stbl3Life TechnologiesC737303
TransIT-LT1Thermo Fisher ScientificMIR2300
Opti-MEMLife Technologies
RPMIThermo Fisher ScientificMT10040CV
DMEMThermo Fisher Scientific10-017-CV
Sérum fœtal bovin (FBS)Omega ScientificFB-11
Pénicilline/streptomycine/L-glutamineLife Technologies10378016
mIL-3Peprotech213-13
psPAX2AddgeneN/A
pCMV-VSV-GAddgeneN/A
pLX_TRC311-Cas9AddgeneN/A
polybreneSigma AldrichH9268
pXPR-011AddgeneN/A
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Genessee Scientific25-507
TamponTAEThermo Fisher ScientificFERB49
LentiGuide-PuroAddgenePlasmide #52963
PNKNew England BiolabsM0201S
T4 ligaseNew England BiolabsM0202S
Kit de purification PCRQiagen28104
Kit MiniprepQiagen27104
51985034

Références

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360(2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and tar....

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Mots-clés

Mutations de la calr ticulineessai de transformation des cellules Ba F3conception d ARN guides uniquesconstruction de vecteurs lentivirauxjonction d extr mit s non homologuesanalyse par cytom trie en fluxessai de viabilit cellulaireinterleukine 3 murine

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