Collecte et Extraction des échantillons d’Air professionnel pour l’analyse de l’ADN fongique

Résumé

Détermination de la diversité fongique au sein d’un environnement est une méthode utilisée dans les études de santé au travail afin d’identifier les risques pour la santé. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN provenant d’échantillons d’air professionnel pour l’amplification et le séquençage des régions ITS fongiques. Cette approche détecte plusieurs espèces fongiques qui peuvent être négligées par les méthodes d’évaluation traditionnelles.

Résumé

Les méthodes traditionnelles d’identification fongiques expositions dans des environnements professionnels, comme la culture et les approches axées sur la microscopie, présentent plusieurs limites qui ont conduit à l’exclusion de nombreuses espèces. Avancées dans le domaine au cours des deux dernières décennies ont conduit les chercheurs en santé au travail à se tourner vers des approches moléculaires pour l’identification des risques fongiques. Ces méthodes ont permis de détecter de nombreuses espèces dans des environnements intérieurs et professionnels qui n’ont pas été détectés à l’aide de méthodes traditionnelles. Ce Détails du protocole une approche permettant de déterminer la diversité fongique dans l’air des échantillons par l’extraction d’ADN génomique, d’amplification, séquençage et identification taxonomique des fongiques interne transcrits régions intergéniques (ITS). SES résultats de séquençage dans la détection de nombreuses espèces de champignons qui ne sont pas détectés ou difficilement identifiables au niveau de l’espèce à l’aide de la culture ou la microscopie. Alors que ces méthodes ne fournissent pas de mesures quantitatives du fardeau fongique, ils offrent une nouvelle approche pour l’identification des dangers et peuvent être utilisées pour déterminer la richesse globale en espèces et la diversité au sein d’un milieu de travail.

Introduction

Exposition fongique dans les environnements d’intérieurs et au travail peut entraîner des morbidités respiratoires, y compris la sensibilisation allergique et l’asthme¹. Identification des dangers fongiques est importante pour évaluer le risque et prévenir l’exposition des travailleurs. Ces risques fongiques peuvent être le résultat d’une contamination intérieure, intrusion d’air extérieur ou perturbations environnementales qui entraînent le transport des matières fongiques dans des zones où les travailleurs sont présents². Méthodes pour évaluer l’exposition fongique ont inclus la culture viable échantillonnage ainsi que....

Protocole

1. préparation de l’échantillonneur d’aérosol NIOSH

Remarque : Le sampler d’aérosol NIOSH est un échantillonneur d’aérosol biétage cyclone qui recueille les bioaérosols avec deux tubes de prélèvement d’échantillons et un filtre de polytétrafluoroéthylène (PTFE).

1. Avant le montage, inspecter soigneusement l’échantillonneur. Vérifiez l’échantillonneur pour s’assurer qu’il n’est pas endommagé, toutes les vis sont en place et confortable et le ruban d’étanchéité autour de la couture formée par les deux moitiés est intact. Inspecter le sampler joint torique pour assurer qu'il n’a pas les pseudos, fissures ou déchirures et qu’elle a une ....

Résultats

La distribution des espèces dans un environnement peut être évaluée à l’aide de l’abondance relative en déterminant le nombre de clones de chaque OTU identifiée dans les échantillons d’air. La figure 6 est un graphique de la Couronne représentant les espèces taxonomiquement placés au sein d’un environnement intérieur après 60 min d’échantillonnage de l’air. On peut constater que l’environnement contienne une variété d’espèces au sein des deux principaux embra.......

Discussion

Détermination de la diversité fongique au sein d’un milieu de travail à l’aide d’approches axées sur le séquençage a amélioré évaluation identification et exposition des risques fongiques. En utilisant cette approche a permis la détection de nombreuses autres espèces fongiques qui sont souvent non détectés à l’aide de la culture ou les méthodes d’évaluation axée sur la microscopie. Une méthode d’échantillonnage bioérosols des environnements professionnels et intérieures et l’extraction de l’ADN génomique des échantillons.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Échantillonneur à cyclone de bioaérosols NIOSH BC251	NIOSH	BC251	L’échantillonneur NIOSH n’est pas encore disponible dans le commerce. Veuillez contacter William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) pour plus d’informations sur l’obtention de l’échantillonneur NIOSH
Fisherbrand Tubes de microcentrifugation stériles avec bouchons à vis	Fisher Scientific	02-681-373	Tubes de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 mL pour l’échantillonnage de l’air ; le filetage supérieur de la vis doit correspondre au filetage de l’échantillonneur NIOSH
Falcon 15 mL Tubes à centrifuger coniques	Corning	352096	15 mL pour l’échantillonnage de l’air
Ruban de vinyle pour salle blanche, facile à enlever, 1/4" de largeur	McMaster-Carr	76505A1	Ruban d’étanchéité
Cassette filtrante, styrène transparent, 37 mm	SKC Inc.	225-3LF	Cassette d’échantillonnage en 3 pièces (sans filtre). Contient : base de cassette, capot d’extension, capuchon de cassette et bouchons d’entrée/sortie Filtres
membrane fluoropores hydrophobes PTFE, 3.0 & micro ; m, 37 mm	EMD Millipore	FSLW03700	Contenait : 37 mm, 3.0 & micro ; m Filtres en PTFE et coussinets de support
Pince à filtre Fisherbrand Pince	à filtre	Fisher Scientific	09-753-50
Modèle 502 Precision PanaPress	PanaVise	502	est construite à partir de cette presse à arbre de précision
Scotch Super 33+ Ruban électrique en vinyle	McMaster-Carr	76455A21	Ruban de 19 mm
Pot d’étalonnage polyvalent, Grand	SKC Inc.	225-112	bocal d’étalonnage
Pompe d’échantillonnage PCXR4 universelle	SKC Inc.	Pompe d’échantillonnage	224-PCXR4
Débitmètre massique 4140	TSI Inc.	Débitmètre 4140
Roche High Pure PCR Template Kit	Roche Diagnostics	11796828001	Kit utilisé pour l’extraction de l’ADN génomique. Contient : Tampon de lyse, Tampon de liaison, Protéinase K, Tampon d’élimination des inhibiteurs, Tampon de lavage, Tampon d’élution, Tubes filtrants en fibre de verre et tubes de collecte de 2 ml
Fisherbrand Tubes à bouchon à vis en polypropylène renforcé de 2 ml Fisher	Scientific	15340162	de 2 ml pour l’homogénéisation des billes
Billes de verre, lavées à l’acide, 212-300 & micro ; m	Sigma-Aldrich	G1277	billes de verre
Fisher Scientific Broyeur à billes 24 Homogénéisateur	Fisher Scientific	15-340-163	Homogénéisateur
billes CelLytic B Cell Réactif, 10X	Sigma-Aldrich	C8740	réactif de lyse
Platinum Taq polymérase	Invitrogen	10966-018	Contient : Platinum Taq polymérase, 10X tampon PCR (pas de MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extenseur
dNTP Mix	Invitrogen	18427-088	10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	Kit utilisé pour purifier les amplicons fongiques. Contient : Tampon PB (tampon de liaison), Tampon PE (tampon de lavage), Tampon EB (tampon d’élution), colorant indicateur de pH (en option) et colorant de chargement GelPilot
Owl EasyCast Mini Gel Système d’électrophorèse Thermo	Fisher	B1 ou B2
TrackIt 1 KB Plus Échelle à ADN Thermo	Fisher	10488-085	Échelle à ADN

à La presse à cassette pneumatique de