Article de méthode

Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

DOI :

10.3791/56742

⸱

12 janvier 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode pour réaliser l’intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain par le système transcriptionnellement réglementé de la Belle au bois dormant . Préparation de l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux, la transduction in vitro des cellules humaines et l’analyse moléculaire sur les cellules transduits sont signalés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le transposon de Belle au bois dormant (SB) est un système intégrant non viraux avec une efficacité prouvée pour transfert génétique et la génomique fonctionnelle. Pour optimiser les machines de transposon SB, une transposase hyperactif transcriptionnellement réglementé (SB100X) et le transposon axée sur le T2 sont employés. En règle générale, la transposase et transposons sont fournis transitoirement par transfection de plasmide et expression SB100X est pilotée par un promoteur constitutif. Nous décrivons ici une méthode efficace pour fournir les composants SB aux cellules humaines qui sont résistantes à plusieurs méthodes de transfection physiques et chimiques, pour contrôler l’expression SB100X et stablement intégrer un gène d’intérêt (IGE) à travers un « copier / coller » SB mécanisme. L’expression de la transposase hyperactif est étroitement contrôlée par le système Tet-ON, largement utilisé pour contrôler l’expression des gènes depuis 1992. Le gène d’intérêt est flanqué des séquences inversées répétées (IR) du transposon T2. Les deux composantes de SB sont emballés dans l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux transitoirement produites dans les cellules HEK293T. Les cellules humaines, les lignées cellulaires ou cellules primaires provenant de tissus humains, sont en vitro transitoirement transduites avec des vecteurs viraux. Lors de l’addition de la doxycycline (dox, tétracycline analogique) dans le milieu de culture, un réglage fin de l’expression de la transposase est mesurée et se traduit par une intégration durable du gène d’intérêt dans le génome des cellules traitées. Cette méthode est efficace et applicable à la lignée cellulaire (par exemple, les cellules HeLa) et les cellules primaires (p. ex., les kératinocytes humains primaires) et représente donc un outil précieux pour le génie génétique et transfert de gènes thérapeutiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transposase SB100X hyperactive, couplée à du transposon axée sur le T2 a déjà été utilisée dans le gène précliniques thérapie demandes1,2,3, génome modifications4,5, et cellules souches pluripotentes induites (iPSC) reprogrammation6,7. En règle générale, les éléments de SB sont transitoirement fournis par transfection de plasmide et un promoteur constitutif fort conduit à l’expression de la transposase. Toutefois, malgré l’amélioration des nouvelles méthodes de transfection, livraison du système bi-composant demeure un défi pour de nombreuses applications. Ainsi, le développement d’un nouveau protocole de livraison a un intérêt croissant. En plus de méthodes de transfection pour plasmide ARNm et8 9, livraison viral basé sur adénoviraux10,11, adeno-associated virus (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 et vecteurs LENTIVIRAUX15 a été proposé dans le passé. Notamment, le système de choix doit garantir une prestation transitoire des composants SB sans intégration du vecteur viral. Néanmoins, l’expression constitutive de la transposase soulève des questions de sécurité en raison du risque de rehopping incontrôlable du transposon.

Par conséquent, la régulation transcriptionnelle de SB100X par un système raffiné de Tet-ON est le premier défi. Mis à jour le promoteur Tet-sensible, obtenu en remplaçant le promoteur développés minime cytomégalovirus (CMV) original avec le promoteur minimal (-81) du gène du Virus Herpès Simplex 1 (HSV1)16, Timidine Kinase (TK) par est cloné en amont de la SB100X ADNc (pTetOTKSB100X). La mutation inverse-tétracycline-transactivateur rtTA2s-M217 est exprimée sous le contrôle du promoteur constitutif fort (promoteur phosphoglycérate, PGK) cloné dans un plasmide différent (VR-PGKrtTA2S-M2). Lors de l’ajout au milieu de culture, dox lie la rtTA2s-modulateur M2 et longes le promoteur Tet ou complex, consistant en une induction étroitement réglementée de SB100X expression18.

Le deuxième grand défi découle de l’inefficacité transfection de cellules humaines primaires par plusieurs méthodes physiques et chimiques. Pour délivrer efficacement la transposase dans les cellules humaines résistants à la transfection, les SB100X et les rtTA2s-cassettes d’expression M2 sont emballés dans deux intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux (IDLVs)19: IDLVTKSB et IDLVrtTA2s- M2. Vecteurs viraux sont transitoirement produits des vecteurs troisième génération de cellules HEK293T20 et Pseudo avec la glycoprotéine G du Virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G), qui lui confère un large spectre de l’infection. Particules de vecteur sont concentrées par ultracentrifugation et titrés par immunocapture de p24 VIH-1 Gag. Pour transmettre des lignées cellulaires et les cellules primaires, particules de vecteur sont complexés avec polybrene et sont incubés avec cellules cibles en présence ou en absence de dox. Activation de toxicomanes de SB100X expression dans les cellules transduits est mesurée par quantitative RT-PCR (qRT-PCR)18.

Une fois que l’expression SB100X Tet réglementés est démontrée, transposition des IgE (p. ex., protéine fluorescente verte, GFP) dans le génome de cellule cible suit les événements moléculaires clairement schématisées par Bak et Mikkelsen21. Une troisième jusque vecteur transportant une cassette d’expression pour les pouvoirs publics indiens cloné entre l’IRs T2-transposon (IDLVT2) doit être construit et conditionnés comme indiqué ci-dessus. Enfin, les trois vecteurs jusque peuvent être utilisés efficacement transduce (p. ex., les kératinocytes primaires) des cellules humaines in vitro et intégrer le gouvernement de l’Inde en présence de doxycycline,18.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. les plasmides employées

NOTE : Plasmide VR-PGKrtTA2S-M2 a été aimablement fournie par Prof. Zappavigna (Université de Modène et Reggio Emilia, Modène, Italie). Le plasmide de pCMVSB100X portant la séquence codante de la transposase hyperactif et plasmide transposon pT2/BH ont été gracieusement fournis par Prof Z. Ivics (l’Institut Paul Ehrlich, Langen, Allemagne) et le Prof. Z. Izvak (Centre Max Delbrück de médecine moléculaire, Berlin, (Allemagne).

  1. Pour tout clonage dans Escherichia Coli (e. coli), suivre la stratégie de clonage de la procédure de choix et d’enzymes de restriction ou amplification par PCR du fragment à être cloné.
    Remarque : Le tableau 1 résume l’ensemble des plasmides employées dans le présent protocole. Une description et les références pour chaque plasmide sont fournis.

2. production de vector virale

Remarque : Tous les vecteurs viraux sont produites sous une hotte biologique à un niveau de confinement de biosécurité BSL2, conformément aux règles institutionnelles et les règlements.

  1. Cellules HEK293T adhérentes de la culture dans un milieu d’Eagle modifié de Dulbecco additionné de 10 % de sérum de HyClone, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 2 mM de glutamine.
  2. Jour 0 : Préparer cinq préparation virale des plaques de 15 cm et semences 5.5x106 cellules dans 30 mL de milieu.
  3. Jour 1 : Transfection
    1. Avant de commencer la transfection, préparation de 100 mL de sérum de tampon 2 x HEPES (HBS) :
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10,0 mL
      Na2HPO4 (0,5 M) 0,3 mL
      Stérile 84,1 mL d’eau
      Ajuster le pH 7.1 avec 37 % HCl.
      Remarque : 2 x HBS peuvent être stockés à 4 ° C. Un pH exact est extrêmement important pour la transfection efficace. Le pH optimal se situe entre 7.10 à 7.12.
    2. Éliminer le milieu et ajouter 22,5 mL/plaque de frais moyen 4 h avant la transfection.
    3. Transfecter de cellules HEK293T avec le plasmide de transfert, le plasmide d’emballage de pMD.Lg/pRRE.D64VInt, le plasmide pMD2.G de codage à l’enveloppe et le pRSV-Rev (tableau 1) selon la montant/plaquette :
      transfert plasmidique 25.00 µg
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16,25 µg
      pMD2.G 8,75 µg
      pRSV-Rev 6,25 µg
      NOTE : Plasmide DNAs sont préparés selon le protocole de CsCl décrit par Maniatis22 ou en utilisant un kit de purification de plasmide exempte d’endotoxine.
      1. Resuspendre 56,25 µg d’ADN (mélange de 4 plasmides) à 1,125 mL d’eau stérile et ajoutez 125 µL de 2,5 M CaCl2 (solution A).
      2. Ajouter 1,250 mL de 2 x HBS dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL (solution B).
      3. Ajouter un (1,250 mL) à B (1,250 mL) quelques gouttes tout en bulles avec une pipette de 1 ou 2 mL (solution de transfection, volume total 2,500 mL).
      4. Incuber pendant 20 min à température ambiante (RT).
      5. À l’aide d’une micropipette P1000, distribuer toute la solution de transfection (2,500 mL) à la monocouche cellulaire goutte à goutte.
    4. Incuber pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, 5 % de CO2.
  4. Jour 2 : Enlever le milieu et ajouter 15 mL de milieu frais (reportez-vous à l’étape 2.1).
  5. Jour 3 : Rassembler et concentrer le surnageant contenant des particules lentiviral.
    1. Recueillir le surnageant (environ 70 mL) de tout (n = 5) plaques de cellules transfectées, filtrer à travers un 0,45 µm SPE filtre et remplissage les 2 tubes de polyallomère (1po x 3,5 pouces) / viral préparation.
    2. Concentrer les particules de vecteur par ultracentrifugation à 106 000 x g pendant 2,5 h, à 15 ° C avec frein.
    3. Immédiatement après l’arrêt de l’ultracentrifugation (pour éviter la remise en suspension de la pastille dans le tube), doucement, transvaser le surnageant dans un récipient contenant 10 % eau de Javel et de suspendre les 2 granules à peine visibles dans 100 µL de PBS 1 x (+ 1 % BSA). Ceci est normal car la pastille est claire et très petit. Utiliser le vecteur concentré fraîchement préparé ou aliquot et stocker les préparations virales à-80 ° C.
      ATTENTION : Le surnageant contient des Particules Lentivirales qui doivent être blanchis soigneusement avant de le jeter dans les poubelles de biohazard.
  6. Pour titrer la préparation de vecteurs viraux, utiliser un kit d’immunocapture p24 VIH-1 Gag selon le protocole du fabricant.
    Remarque : Afin de normaliser la production de vecteurs viraux, réactifs à base de liposomes pourraient être employés. Néanmoins, le titre de vecteur viral est fortement tributaire de l’efficacité de transfection et la pureté de l’ADN de plasmide.

3. transduction des lignées cellulaires humaines (par exemple, les cellules HeLa)

Remarque : Les cellules HeLa sont cultivées dans un milieu d’aigle modifié de Dulbecco additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 2 mM de glutamine. Le tableau 1 résume l’ensemble des vecteurs utilisés dans le présent protocole. Une description pour chaque vecteur est fournie. Transduction de cellules HeLa permet la vérification de la régulation transcriptionnelle de transposase SB dans la meilleure combinaison de dose des deux vecteurs jusque. Variation des doses jusque peut être liée à vector titrage de la particule et le type de cellule cible.

  1. Jour 0 : 2 x 105 cellules dans 3 mL de milieu pour chaque puits d’une plaque 6 puits de graines. Préparer 4 puits.
  2. Jour 1 : Transduction des cellules HeLa.
    1. Pour chaque condition, diluer les vecteurs LENTIVIRAUX pour un volume final de 1 mL de milieu (voir la Note ci-dessus) en présence de 10 μL de polybrene (concentration finale 8 μg/mL) :
      Dilution pour puits #1 : se moquer des cellules transduits (témoin négatif).
      Dilution pour bien #2 : vecteur IDLVTKSB (2 600 ng de p24).
      Dilution pour puits #3, #4 : vecteur IDLVTKSB (2 600 ng de p24) + IDLVrtTA2s-M2 vectoriel (9 600 ng de p24).
    2. Retirer le support de chaque puits où les cellules HeLa ont été plaqués au jour J0 et ajoutez des dilutions de vecteur lentiviral au bien correspondant.
    3. Spinoculate la plaque 6 puits à 754 x g pendant 45 min à 20-25 ° C et puis changer la plaque 6 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO2.
    4. Après 6 h, remplacer les vecteurs contenant moyens avec un milieu frais dans tous les puits et ajouter la doxycycline à 1 μM de bien #4. Mettre la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C pendant 48 h.
  3. Jour 3 : Préparation du culot pour extraction de l’ARN.
    1. Avant de détacher les cellules, préparer une solution de travail de la trypsine (1 x) :
      2,5 % trypsine (x 10) 5,0 mL
      500 mM EDTA (concentration finale = 5 mM) 0,5 mL
      1 x mL de PBS 44,5
    2. Solution de travail de la trypsine chaud à 37 ° C avant utilisation. Stocker la solution de travail de la trypsine à 4 ° C.
    3. Éliminer le milieu et laver les cellules avec du PBS 1 x. Ajouter 0,5 mL de solution de travail de la trypsine préchauffé 37 ° C à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 7 min (dans un incubateur de culture cellulaire).
    4. Après l’incubation, ajouter 0,5 mL de sérum contenant moyen dans chaque puits pour inactiver la trypsine et recueillir les cellules dans un tube à centrifuger. Rincer bien une fois avec 3 mL de PBS 1 x et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 240 x g.
    5. Laver les cellules avec 5 mL de solution 1 PBS x, centrifuger pendant 5 min à 240 x g et jeter le surnageant. Utilisez les granules des cellules fraîchement prélevés ou stocker à-80 ° C. Extraire l’ARN total de pastilles à réaliser la RT-PCR semi-quantitative (voir étape 6).

4. transduction de cellules humaines primaires (p. ex., les kératinocytes)

Remarque : Des kératinocytes humains primaires sont ensemencées sur 3 t 3-J2 mortellement irradiés cellules (couche de conducteur)23, un gentil cadeau de Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Suisse).

  1. La croissance de cellules 3 t 3-J2 souris Swiss Eagle modifié de Dulbecco milieu additionné de 10 % de sérum de bovin donneur, 50 U/mL de pénicilline-streptomycine et 4 mM de glutamine (moyenne de 3 t 3).
  2. Croissance des kératinocytes ensemencés sur cellules 3 t 3-J2 mortellement irradiés dans un milieu DMFC, milieu d’Eagle modifié d’un Dulbecco et mélange de médias F12 du jambon (3:1) contenant du sérum de veau fœtal (10 %), la pénicilline-streptomycine (1 %), glutamine (2 %), l’insuline (5 µg/mL), adénine ( 0.18 mM), hydrocortisone (0,4 µg/mL), la toxine cholérique (0,1 nM) et la triiodothyronine (2 nM).
  3. Jour 0 : Semences 3 x 105 mortellement irradié cellules 3 t 3-J2, préalablement diluées dans un milieu à une concentration finale de 1 X 105 cellules/mL, dans chaque puits de la plaque 6 puits 3 t 3. Préparer 9 puits.
  4. Jour 1 : Transduction de kératinocytes primaires
    NOTE : Transduction de kératinocytes permet la quantification de la régulation transcriptionnelle de transposase SB dans la meilleure combinaison de dose des deux vecteurs jusque (par qRT-PCR) et de vérifier l’intégration de la GOI (GFP) dans les cellules cibles (par cytofluorométrique analyse).
    1. Avant de détacher les cellules, préparer la solution de travail de la trypsine :
      0,5 % trypsine-EDTA (x 10) 5,0 mL
      500mM EDTA (concentration finale = 5 mM) 0,5 mL
      1 x mL de PBS 44,5
    2. Solution de travail de la trypsine chaud à 37 ° C avant utilisation. Stocker la solution de travail de la trypsine à 4 ° C.
    3. Pour détacher les kératinocytes sont en culture, éliminer le milieu, laver les cellules avec du PBS 1 x et ajouter 1 mL de solution de travail de la trypsine préchauffé dans chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire.
    4. Après l’incubation, remettre en suspension les cellules d’un puits soigneusement et transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger contenant 2 mL sérum contenant du milieu (si plusieurs cellules sont encore attachés, incuber pendant une minutes supplémentaires à 37 ° C). Rincez bien une fois avec 3 mL de 1 x PBS ou un milieu frais et ajouter la solution de rinçage dans le tube à centrifuger la suspension cellulaire.
    5. Centrifuger pendant 5 min à 580 x g et éliminer le surnageant.
    6. Laver les cellules avec 5 mL de solution 1 PBS x, centrifuger pendant 5 min à 580 x g et éliminer le surnageant.
    7. Dans un tube de 15 mL en polypropylène, diluer 1.6x105 kératinocytes dans 1 mL de milieu DMFC, une dilution pour chaque condition.
    8. Diluer les vecteurs LENTIVIRAUX dans 1 mL de milieu DMFC en présence de 20 μL de polybrene (concentration finale de 8 µg/mL à un volume final de 2 mL) :
      Les dilutions pour puits #1, #2, #3 : se moquer des cellules transduits (témoin négatif sans vecteurs).
      Les dilutions pour puits 4 #, 5 # : vecteur IDLVTKSB (13 000 ng de p24) + IDLVrtTA2s-vecteur M2 (48 000 ng de p24).
      Les dilutions pour puits #6, #7, #8, #9 : vector IDLVTKSB (13 000 ng de p24) + IDLVrtTA2s-vecteur M2 (48 000 ng de p24) + IDLVT2 vector (9 160 ng de p24).
    9. Transmettre les cellules en suspension en ajoutant chaque dilution vecteur lentiviral (1 mL) à la suspension de kératinocytes correspondante (1.6x105 kératinocytes dans 1 mL).
    10. Retirer le support de cellules 3 t 3-J2 mortellement irradiés injectées à jour 0 et plaque transduite kératinocytes (1.6x105 kératinocytes dans 2 mL) sur eux. Bout de transduction d’un puits procéder à celle qui suit.
    11. Incuber à 25 ° C pendant 30 min et ensuite transférer les cellules à 37 ° C dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 6 h.
      Remarque : Ne spinoculate pas les kératinocytes primaire, comme la viabilité et la prolifération seront fortement touchés.
    12. Après 6 h, ajouter 1 mL de milieu DMFC dans chaque puits. Ajouter 1 doxycycline μM (concentration finale) dans les puits #5, #8 et #9. Retourner les cellules à 37 ° C.
  5. Jour 2 : Remplacer les DMFC moyen avec 3 mL de milieu KC 10 ng/ml EGF.
  6. Jour 3 : Trypsinize et laver les cellules provenant de puits #1, #4 et #5 comme indiqué auparavant (voir 4.4.1 à 4.4.6). Congeler des boulettes de cellule à-80 ° C pour extraire l’ARN total pour analyse qRT-PCR (voir étape 7).
  7. Trypsinize cellules de bien #2, #6 et #8 comme indiqué aux paragraphes 4.4.1 à 4.4.5 et effectuer une analyse cytofluorométrique pour l’expression de la GFP (voir étape 5).
  8. Maintenir la culture des puits #3, #7 et #9 au moins 3-4 doublements, suffisantes pour diluer non intégrée des vecteurs IDLVT2 (5 jours pour les kératinocytes primaires plaqués sur la couche de conducteur).
  9. Jour 6 : Environ 5 jours après transduction, trypsinize des cellules (voir étapes 4.4.1 à 4.4.5) provenant de puits #3, #7 et #9 pour réaliser une analyse cytofluorométrique pour l’expression de la GFP (voir étape 5).
    NOTE : Efficacité de cadencement et de transduction expérience sont fortement influencé par type de cellules primaires et par la variabilité des échantillons recueillis.

5. cytofluorométrique analyse sur les kératinocytes primaires transduits

Remarque : Un cytomètre en flux configuré avec un laser bleu (488 nm), un laser rouge (633 nm) et filtres pour la détection de la fluorescence GFP et APC est employée (voir la Table des matières).

  1. Pour discriminer les kératinocytes de la couche de conducteur 3 t 3-J2, étiquette transduite kératinocytes détachés au jour 3 et jour 6 (voir étapes 4.7 et 4.9) avec la souris monoclonal APC-anticorps anti-Feeder conjugué.
    1. Préparer 4 mL de tampon pour chaque échantillon de coloration :
      5 % BF 200 ΜL
      500 mM EDTA (concentration finale = 2,5 mM) 20 μL
      Μl de PBS 1 x 3780
    2. Laver les cellules individuelles avec 1 mL de tampon de coloration. Centrifuger pendant 5 min à 580 x g et éliminer le surnageant.
    3. Dans un tube pour l’acquisition de cytométrie en flux, remettre en suspension les cellules4 5 x 10 à 100 μL de tampon de coloration et ajouter 2 μL d’anticorps anti-Feeder (01:50). Bien mélanger et incuber pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité.
    4. Après 30 min, laver avec 2 mL de tampon de coloration. Centrifuger pendant 5 min à 580 x g et éliminer le surnageant. Resuspendre dans 200 μl de tampon de coloration.
    5. Acquérir des signaux APC et GFP par cytofluorométrique analyse18. La fraction cellulaire GFP+ de la population de cellules APC– indique les kératinocytes transduits.
      Remarque : Si vous le désirez, fixer l’échantillon coloré avant la cytométrie en flux avec paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS 1 x et conserver à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à ce que la course.
  2. Analyser les données de cytométrie de flux en traçant le rapport entre le pourcentage de GFP+cellules au point de terminaison (5 jours) et le pourcentage de GFP+cellules 2 jours après la transduction, normalisée au niveau résiduel de la IDLVT2-transduites cellules.

6. semi quantitative RT-PCR

Remarque : Utilisez un thermocycleur PCR.

  1. Extrait total RNA de transduites ou contrôlent les cellules à l’aide d’un kit de purification d’ARN, selon le protocole du fabricant.
    Remarque : L’ARN Total peut être stockée à-80 ° C.
  2. Synthèse de cDNA dans une réaction de 20 µL à l’aide de 100 ng d’ARN total et un kit de la transcriptase inverse, selon le protocole du fabricant.
    NOTE : ARNC peut être conservé à-20 ° C.
  3. Conception des amorces spécifiques pour SB100X, rtTA2s-M2 et GAPDH (un gène de ménage).
    Modèles proposés :
    SB en avant apprêt : 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB reverse primer : 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 avant l’apprêt : 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 reverse primer : 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH avant apprêt : 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH reverse primer : 5'–CCACCACCCTGTTGCTGTAG–3'
  4. Effectuer des PCR dans une finale réactionnel de 50 µL. En particulier, se réunissent dans chaque tube PCR la réaction suivante :
    ADNc (dilution 1:5) (de l’étape 6.2) 1,00 µL
    Avant l’amorce (stock de 10 µM) 1,00 µL
    Inverser l’apprêt (stock de 10 µM) 1,00 µL
    dNTPs (stock de 10 µM) 1,00 µL
    Tampon (+ MgCl2) (10 x stock) 5,00 µL
    Taq polymérase (stock de 5 U/µL) 0,25 µL
    µL d’eau stérile 40,75
  5. Utiliser le programme suivant du thermocycleur : 1 cycle à 95 ° C pendant 5 min puis procéder à 95 ° C pendant 30 s, 58 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s pour 34 cycles pour SB100X, 32 cycles pour rtTA2s-M2 et 25 cycles pour GAPDH.
  6. Préparer un gel d’agarose à 1 %. Dissoudre 1 g d’agarose dans 100 mL de TBE 1 x (10 x stock dilué dans de l’eau stérile), dans un bécher ou la fiole. Faire fondre au micro-ondes, agitant chaque minute jusqu'à dissolution complète de l’agarose. Refroidir l’agarose fondu jusqu'à ce qu’il atteigne environ 50 ° C et ensuite ajouter 5 µL de bromure d’éthidium (10 mg/mL de bouillon). Verser d’agarose fondu dans un bac à gel assemblé avec un peigne, pour la coulée de gel.
  7. Charger des échantillons (10 µL de chaque) sur le gel d’agarose et effectuer l’électrophorèse.
  8. Si vous le souhaitez, acquérir photo gel et effectuer des analyses densitométriques sur les bandes PCR.

7. RT-PCR quantitative (qRT-PCR)

NOTE : Un système de détection de séquence commerciale est employé. Amorces et 6-carboxyfluorescéine (FAM) sonde de glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) sont achetés dans le commerce.

  1. Pour rétro-transcription, reportez-vous à l’étape 6.2.
  2. Logiciel permet de concevoir des amorces et des sondes spécifiques pour SB100X.
    Conception proposée :
    SB.2 avant l’apprêt : 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 reverse primer : 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    sonde de SB FAM : 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Effectuer la PCR en temps réel dans des plaques de 96 puits avec une PCR Master Mix et amorces + sonde mélange, dans un volume de réaction finale 25 µl. En particulier, examiner la réaction suivante pour chaque puits :
    ADNc (01:10 dilution dans l’eau stérile) 1,00 µL
    2 x µL du mélange réactionnel 12,50
    Amorces + 20 sonde x mélange 1,25 ml
    µL d’eau stérile 10,25
    Remarque : Effectuez toutes les réactions en triple exemplaire. Pour éviter les erreurs de pipetage, préparer un mélange d’au moins n + 3 réactions (sans ADNc). Aliquote à l’aide d’une pipette multicanaux.
  4. Exécutez la PCR en temps réel en utilisant le programme suivant : cycle de 1 à 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min et maintenez à 4 ° C.
  5. Analyser les données qRT-PCR en normalisant l’expression relative (valeur RQ) de la SB100X au niveau de GAPDH du même échantillon ADNc par la quantificationCT deΔΔ–2, à l’aide du logiciel d’analyse de données classique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À l’aide de la procédure présentée ici, trois vecteurs jusque supportant les composants réglementés de SB (SB100X, rtTA2S-transposon M2 et T2-GFP) ont été emballés et permettant de délivrer efficacement et étroitement réglementer le système SB dans les cellules humaines. Figure 1 a présente un schéma pour in vitro transduction des cellules HeLa, qui a été réalisée pour évaluer la régulation transcriptionnelle de SB transposase avec la meil...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici une méthodologie largement accessible pour un GOI stablement intégrer le génome des cellules cibles de la Belle au bois dormant-médiée par transposition. Bien que le système de SB a été développé pour fournir une méthode nonviral pour l’édition de génome, une prestation efficace de la machinerie de l’intégration (transposase et T2 transposon) est obligatoire. Par conséquent, pour utiliser le système SB sur peine transfectable cellules primaires, une livraison virale des composants SB a été rep...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le professeur Zappavigna, Université de Modène et Reggio Emilia, Modène, Italie pour nous avoir fourni le VR-PGKrtTA2S-M2 plasmide. Nous remercions également Prof Z. Ivics (l’Institut Paul Ehrlich, Langen, Allemagne) et le Prof. Z. Izvak (Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, Allemagne) pour les plasmides pCMVSB100X et pT2/BH. Ce travail a été soutenu par DEBRA internationale et le ministère italien de l’Université et de la recherche.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco' Eagle modifié' milieu avec 4,5 g/L de glucose sans L-GlutamineLonzaBE12-614FMilieu de culture cellulaire.
Sérum fœtal bovin HyClone (États-Unis), Sérum caractériséGE Healthcare Life SciencesSH30071.03utilisé HEK293T culture cellulaire pour la production de particules lentivirales.
Pénicilline 10.000 UI/ml Streptomycine 10.000 UI/mlLonzaDE17-602ERéactifs pour milieu de culture cellulaire.
L-Glutamine 200mMLonzaBE17-605ERéactif pour milieu de culture cellulaire.
Réactif de chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS7653pour la préparation HBS 2X.
Tampon HEPES, 1M Stock dans une solution saline normaleLonzaBE17-737ERéactif pour préparation HBS 2X.
Hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na2HPO4· ; 2H2O), 99,5 %Réactif Merck106580pour préparation HBS 2X.
Acide chlorhydrique - Réactif ACS 37 % (HCl)Réactif 320331 Sigma-Aldrichpour préparation HBS 2X.
Eau stérile pour injectionFresenius Kabi-Réactifpour préparation HBS 2X.
0,45 et micro ; m Filtre PESSWhatman10462100Filtres utilisés pour éliminer les débris cellulaires du surnageant viral.
Polyallomère Tubes Beckman BeckmanCoulter326823Tubes pour la concentration de vecteurs IDLV par ultracentrifugation.
PBS-1X sans Ca, MgLonzaBE17-516FTampon pour le lavage cellulaire et la remise en suspension de particules lentivirales.
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA2153(Facultatif) Tampon pour la remise en suspension de particules lentivirales.
HIV-1 Gag p24 kit d’immunocapturePerkin ElmerNEK50001KTKit pour le titrage des particules IDLV.
PolybrèneSigma-Aldrich107689réactif pour améliorer l’efficacité de la transduction.
Trypsine (10X) 2,5 % dans HBSS sans Ca, MgGIBCOBE17-160ERéactif pour détacher les cellules HeLa (solution mère, à diluer).
Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)100938BAnalaR BDHRéactif pour la préparation de la solution de travail de la trypsine.
0,5 % Trypsine-EDTA, sans rouge de phénol (10X)GIBCO15400-054Réactif pour détacher les kératinocytes (solution mère, à diluer).
Sérum de bovin donneur, origine Nouvelle-ZélandeGIBCO16030-074Sérum pour culture cellulaire de souris suisse 3T3-J2 (couche nourricière).
Jambon s F12 mediaGIBCO21765Milieu pour kératinocytes.
Sérum fœtal bovinLonzaDE14-801FSérum pour milieu de culture cellulaire HeLa.
Sérum de veau fœtal, qualifié, Australie OrigineGIBCO10099-141Sérum pour milieu de culture primaire de kératinocytes humains.
Insuline du pancréas bovinSigma-AldrichI5500Réactifs pour la croissance des kératinocytes.
AdénineVWR1152-25Réactifs pour la croissance des kératinocytes.
HydrocortisoneVWR3867-1Réactifs pour la croissance des kératinocytes.
Toxine cholérique de Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Réactifs pour la croissance des kératinocytes.
TriiodothyronineSigma-AldrichT5516Réactifs pour la croissance des kératinocytes.
EGFhumain Austral BiologicalGF-010-9Réactifs pour la croissance des kératinocytes.
Anticorps anti-feeder monoclonal APC conjugué de sourisMiltenyi Biotech130-096-099Pour marquer la couche nourricière.
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Kit de purification d’ARN.
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051Kit de transcriptase inverse.
Mélange de désoxynucléotides, 10 mM (dNTP)Réactif Sigma-AldrichD7295pour PCR semi-quantitative.
Réactif d’eau distillée sans DNase/RNase UltraPurepour la PCR semi-quantitative et pour la qRT-PCR.
GoTaq G2 Démarrage à chaud PolymérasePromegaM740BTaq polymérase.
Agarose, pour la biologie moléculaireSigma-AldrichA9539Réactif pour l’électrophorèse sur gel d’agarose.
Tampon TBE UltraPure, 10XInvitrogen15581028Réactif pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, à diluer (1X) dans ddH2O.
Bromure d’éthidiumSigma-AldrichE1510Réactif pour l’électrophorèse sur gel d’agarose.
DoxycyclineSigma-AldrichD-9891médicament pour induire l’expression de la transposase dans les cellules HeLa et dans les kératinocytes
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix comprenant des amorces et une sonde.
Tube à centrifuger en polypropylène haute clarté de 15 ml, fond conique, avec bouchon à vis à joint en dôme, tubes 352096stériles Falcon Corningpour la collecte de cellules et la préparation de dilution de vecteurs.
Boîte de culture cellulaire traitée TC de 150 mm avec grille de 20 mm,Falcon Corningstérile 353025Boîte de culture cellulaire pour la production virale.
Plaque de culture cellulaire multipuits à fond plat traitée TC, à 6 puits transparents, avec couvercle, emballée individuellement,Falcon Corning353046Plaque de culture cellulaire stérile pour HeLa et la transduction primaire des kératinocytes humains.
Tubes à centrifuger Safe-Lock, volume 1,5 mLEppendorf0030 120.086Tubes pour la préparation par dilution.
Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, volume 2 mLEppendorf0030 120.094Tubes pour la préparation de dilution.
Tubes PCR de 0,2 ml avec bouchons plats, RNase, DNase, ADN et tubes sans inhibiteur de PCRpour PCR semi-quantitative.
Plaque de réaction optique rapide à 96 puits MicroAmp avec code-barres, 4346906 biosystème appliqué de 0,1 mlà 96 puits pour qRT-PCR.
Tube en polystyrène à fond rond de 5 ml, sans capuchonBD Falcon352052Tubes pour l’acquisition par cytométrie en flux.
Pipettes sérologiques jetables, polystyrène, emballées individuellement, stériles (différents volumes)(toutes)-Pipettes pour les applications de culture tissulaire stérile.
Embouts filtrants, stériles et sans RNase, DNase, ADN et pyrogène (différents volumes)(tout)-Embouts filtrants pour les applications de culture de tissus stériles et de biologie moléculaire.
pH-mètre(tout)-Équipementpour la mesure du pH HBS 2X.
PCR Thermocycleur(tout)-Équipementpour PCR semi-quantitative.
Équipement d’électrophorèse sur gel d’agarose(tout)-Équipementpour l’électrophorèse sur gel d’agarose de PCR semi-quantitative.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2Cytomètre BD-Flow.
7900HT Système de PCR rapide en temps réelApplied Biosystem7900HTÉquipement pour qRT-PCR.
Centrifugeuses de paillasse pour un traitement efficace des échantillons dans les applications de culture cellulaire, réfrigérées, avec godets à microplaques.(toute)-Centrifugeuse pour le traitement de la culture cellulaire et la spinoculation.
Ultracentrifugeuse Optima L-90K équipée d’un rotor SW32TIBeckmanCoulter-Ultracentrifugepour la production de particules lentivirales.
Équipement pour les laboratoires de culture cellulaire et de biologie moléculaire (par exemple, hotte à flux laminaire de classe II conçue pour le travail avec des matériaux BSL2, incubateur de culture cellulaire, réfrigérateurs et congélateurs (+4 ° ; C, -20 ° ; C, -80 ° ; C), micropipettes et aide à la pipette).
Blouses de protection, gants, protection faciale conformes aux règles et règlements de l’Institut, en particulier pour la production et la transduction de particules lentivirales.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712(2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344(2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771(2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Transcriptional RegulationGene Of InterestHyperactive TransposaseTet ON SystemPrimary KeratinocytesFlow CytometryReal Time PCRDoxycycline Induction

Articles connexes