Article de méthode

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

DOI :

10.3791/56750

⸱

6 janvier 2018

 ,  ,  , 
1Maine Medical Center Research Institute

Dans cet article

Résumé

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Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.

Résumé

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Cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) constituent une population de cellules utilisée couramment comme une représentation de cellules souches mésenchymateuses in vitro. Ils résident dans la cavité de la moelle osseuse aux côtés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui peut donner lieu à des globules rouges, progéniteurs immunitaires et les ostéoclastes. Ainsi, les extractions de populations de cellules des moelle osseuse des résultats dans un mélange très hétérogène de diverses populations de cellules, qui peuvent présenter des défis dans une conception expérimentale et confondre l’interprétation des données. Plusieurs d’isolement et des techniques de culture ont été développés dans les laboratoires afin d’obtenir des populations plus ou moins homogènes de BMSC et csh invitro. Nous présentons ici deux méthodes pour isoler BMSC et GPX des os longs souris : une méthode qui génère une population mixte de BMSC et csh et une méthode qui tente de séparer les populations de deux cellules basées sur le respect. Les deux méthodes offrent adapté aux cellules ostéogéniques et différenciation adipocytaire expérimente des essais ainsi que fonctionnels.

Introduction

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BMSC murine primaires est utilisées comme modèle in vitro de cellules souches mésenchymateuses depuis leur découverte dans le début des années 19801. En effet, les cultures de cellules adhérentes plastique vidées de la cavité de la moelle osseuse des os longs maintiennent la capacité à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes dans nombreuses études2,3, 4 , 5. Toutefois, la moelle osseuse est un tissu unique composé de plusieurs différentes populations cellulaires y compris, mais non limité à, BMSC, CSH, les cellules endothéliales et immunitaires. Ainsi, d’isolement et des techniques de culture peuvent produire des populations de cellules avec différente homogénéité. En utilisant ces techniques pour tester la potentiel de différenciation des cellules peut être difficile. Par exemple, lorsque l'on compare les cellules des souris avec des génotypes différents, commençant par une population de cellules mixtes limite l’interprétation des données. À l’inverse, obtention des populations homogènes de BMSC et csh peut être techniquement difficile et ne peut pas être aussi représentatif d’un modèle ex vivo .

Dans notre laboratoire, nous nous intéressons principalement à l’utilisation du BMSC en raison de leur potentiel à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes. Nous présentons ici les techniques d’isolement BMSC et GPX et de la culture utilisée pour évaluer l’osteoblastogenèse ou l’adipogenèse le in vitro, ainsi que des cultures de CSH se différencier en ostéoclastes. Une méthode utilise une population mixte de cellules de moelle osseuse (BMC) contenant BMSC et GPX directement adapté pour l’adipogenèse, osteoblastogenèse et osteoclastogenesis (appelé ca Total). Cette méthode est une représentation plus proche ex vivo de l’hétérogénéité trouvée parmi les cellules du microenvironnement de la moelle osseuse. Une autre méthode sépare adhérentes de cellules non adhérentes dans une tentative de culture plus « pur » des populations de BMSC et csh (appelé adhérent BMSC). La méthode plus tard autorise la culture cellulaire des expériences pour démarrer avec un nombre plus précis du BMSC ou GPX et réduit le potentiel des effets indirects complexes des autres populations de cellules qui restent dans la culture. Les deux méthodes ont été précédemment publiés et utilisés pour traiter différents recherche questions6,7,8,9.

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Protocole

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Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Institut de recherche Centre médical du Maine et d’institutionnels animalier.

1. collection de Tubes de préparation

  1. Rendre les milieux de culture BMSC en complétant un milieu Minimum essentiel α (α MEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de la pénicilline/streptomycine.
  2. Déposer 100 µL de milieux de culture BMSC en tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. 3 OS correspondront généralement à un tube unique afin de préparer en conséquence.
  3. Couper les extrémités de 200 pointes de pipette µL, assez pour qu’ils s’insèrent dans les tubes à centrifuger. Insérez les extrémités à l’intérieur des tubes et faire en sorte que les couvercles peuvent fermer avant de placer les tubes sur la glace.
    Remarque : Vous pouvez également tubes de microcentrifuge de 0,75 mL avec les extrémités coupées peuvent être insérés dans le tube de microtubes de 1,5 mL.

2. récolte des os des souris

  1. Euthanasier les animaux à l’aide de CO2 suivi par dislocation cervicale et pulvériser avec l’éthanol à 70 %.
    Remarque : S’assurer que les animaux de même sexe et de préférence du même âge est utilisés. Nous utilisons systématiquement des animaux âgés de 7 à 8 semaines. Nous recommandons la mise en commun des cellules provenant d’au moins 3 animaux par groupes expérimentaux pour produire une population de cellules représentatifs et reproductibles mieux.
  2. Placez la souris euthanasiée sur le dos sur une planche de dissection. Forceps permet de créer une tente de peau sur l’abdomen. Faire une petite incision (environ 1 cm) à l’aide de ciseaux de dissection stériles. Peler la peau vers les membres et les pieds de la coupe afin d’exposer le bas-ventre et les jambes.
    1. Couper sous la cheville mixte pour enlever le pied. Découper le long de la crête iliaque, au niveau des hanches pour séparer la tête du fémur de l’os iliaque. Alors que la souris est toujours sur le dos, faites une incision au milieu de l’os iliaque pour séparer les deux OS iliaques.
  3. À l’aide de chiffons non pelucheux, retirer délicatement le muscle de la fémurs, tibias et OS iliaques.
    NOTE : Couper autant de tendons et les muscles de l’os comme le rend possible le nettoyage plus rapide et plus facile avec les lingettes pelucheux (p. ex., kimwipes). Soyez prudent en manipulant les os car ils ont tendance à casser facilement et leur fragilité ne peut-être être augmentée avec certains génotypes.
  4. Une fois que tous les échantillons ont été disséqués, les placer dans du PBS sur la glace et se déplacer à une hotte de culture stériles pour les étapes restantes de l’isolement.
    NOTE : Travail aseptiquement autant que possible permettra de réduire le risque de contamination dans les cultures.
  5. Faire des petites coupures (environ 1 à 2 mm) aux extrémités proximales et distales des os avant de les placer dans les extrémités sectionnées dans les tubes à centrifuger.
    Remarque : Vérifier que vous pour couper une quantité suffisante pour que la moelle osseuse peut être centrifugé Cependant, il faut pour éviter de couper trop comme populations de cellules ont tendance à varier selon la proximité dans l’espace de la moelle osseuse.
  6. Centrifuger à 10 000 x g pendant 15 s à température ambiante. S’assurer que toute la moelle est rincée et granulée au fond du tube 1,5 mL tandis que les os sont à l’intérieur les inserts (soit 200 µL pipette Astuce ou 0,75 mL tube microcentrifuge). Une fois que toute la moelle est rassemblée, enlever les inserts avec les os les tubes de prélèvement.
    Remarque : Si tous la moelle est vidée, les OS apparaît blancs. Cependant, si la moelle reste dans certains os, réessayez la coupe se termine et centrifuger.

3. Suspension cellulaire

  1. À l’aide d’une aiguille 25 G, tirez la cellule pastilles de haut en bas lentement pour briser les mottes et combiner tous les échantillons dans un tube conique unique de 15 mL. Ajouter 10 mL de milieu de Culture BMSC par 500 µL d’échantillons.
  2. Placer un filtre 70 µm au sommet d’un tube conique de 50 mL et passer la suspension cellulaire par ce filtre afin d’éliminer les fragments d’os possible.

4. électrodéposition et de la Culture de peuplements mixtes de cellules de moelle osseuse (ca Total)

Remarque : Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur avec 5 % de CO2.

  1. Calculer le nombre de cellules et leur plaque à 1,0 x 106 cellules/cm2 dans des milieux de culture. Permettre à 72 h de culture mixte pour les cellules d’attacher.
    Remarque : Nous recommandons de diluer la cellule suspension 20 x dans les milieux de culture et diluer à nouveau en bleu avant de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre trypan. Pour les souris C57Bl6/J mâles âgés de 7 semaines, nous cédons systématiquement un numéro de cellulaire d’environ 50 x 106 cellules mais âge, le sexe et la souche peuvent influer grandement sur nombre de cellules.
    Remarque : Une mélange population de cellules joigne au bas de la culture bien.
  2. Après 72 h, retirez le support et le remplacer par les supports neufs. Continuer de changer les médias tous les autres jours et recherchez de confluence. Lorsque les cellules atteignent la confluence de 80 à 100 %, ils sont prêts pour la différenciation.
    NOTE : Parce que cette culture est mélangée avec les BMSC et CSH, il peut être directement utilisé pour osteoblastogenèse, l’adipogenèse ainsi qu’osteoclastogenesis.

5. électrodéposition et de la Culture de la Population de Split de BMSC (BMSC adhérentes)

Remarque : Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur avec 5 % de CO2.

  1. Plaque de toutes les cellules prélevées les fémurs, tibias et OS iliaques d’une souris dans une boîte de Petri de 10 cm (55 cm2 de zone de culture).
    Remarque : Lorsque la mise en commun de souris C57BL/6J 2-3, nous plaque généralement cette population « total » de la moelle osseuse dans une fiole de2 150 cm.
  2. Après 48 h de culture mixte, retirez le support de culture (contenant le CSH non adhérents). Si osteoclastogenesis expériences sont à effectuer, définir cette population de cellules non adhérentes côté (voir section 7), sinon, aspirer et jeter ces cellules.
  3. Laver la plaque/ballon avec PBS soigneusement quant à ne pas déranger les cellules attachées.
  4. Retirer le PBS et soulever les cellules en ajoutant la trypsine 0,25 % et incuber à 37 ° C pendant 1-3 min. trempe la trypsine en ajoutant les milieux cellulaires à la suspension de cellules. À ce stade, BMSC, qui sont maintenant levées, peut être comptés (comme fait précédemment en étape 4.1) et plaqué pour de futures expériences.
  5. Calculer le nombre de cellules nécessaires pour le placage. Centrifuger le volume requis de suspension de cellules à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque : Les cellules sont plaquées généralement basé sur des expériences de point final. Par exemple, si la protéine/ARN doit être isolé nous plaque généralement à une densité plus élevée (~1.0-2.0 x 106 cellules/puits dans plaque 6 puits).
  6. Retirez le support et Resuspendre le culot dans le volume des milieux de culture nécessaire pour l’électrodéposition. Les cellules dans les milieux de culture selon les expériences de la plaque et laissez-les fixer pour quelques jours. Quand le BMSC atteindre confluence, procéder pour effectuer la différenciation.

6. différenciation des BMSC

  1. Ostéoblastes
    1. Faire médias de différenciation ostéoblastique en ajoutant 800 µL de 1 M β-glycérol phosphate dans du PBS et 200 µL d’acide ascorbique 0,5 M dans du PBS à 99 mL BMSC de milieux de culture (Voir l’étape 1.1 pour la composition des médias culture BMSC).
      1. Une fois les cultures BMSC (ca total de l’étape 4.3) ou adhérent BMSC de point 5.6 confluentes, eux se différencient en ostéoblastes en changeant les milieux de culture, aux médias de différenciation ostéoblastique.
    2. Remplacer les médias de différenciation tous les deux jours. Les cellules commencent à produire des nodules blancs de minéralisation. Les visualiser à le œil nu au fond du puits ; Ce processus peut se produire dans les prochains jours à 3 semaines.
      1. Afin d’évaluer les osteoblastogenèse, effectuer la coloration de la phosphatase alcaline ou Von Kossa coloration sur les puits comme décrit à l’article 8.
        Remarque : Changer les médias soigneusement en inclinant les plaques avec un léger angle afin d’éviter toute perturbation de la monocouche cellulaire.
  2. Adipocytes
    1. Rendre les adipocytes base médias en mélangeant 90 mL d’hyperglycémie moyenne d’Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10 mL de sérum de veau fœtal, 1 mL de pénicilline/streptomycine, 100 µL 20 mM Rosiglitazone et 100 µL de 2 mM de l’insuline. Le cas échéant, stocker ce média à 4 ° C pour la semaine au cours de l’expérience de différenciation.
    2. Faire des adipocytes induction médiatique en ajoutant 200 µL de 62,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 25 µL de 1 mM de dexaméthasone à 25 mL d’adipocytes Base Media.
    3. Une fois les cultures BMSC (ca total de l’étape 4.3) ou adhérent BMSC de point 5.6 confluentes, remplacez les médias médias induction adipocyte. Considérons ce jour 0 de différenciation.
    4. Après 48 h, retirez le support et actualiser la culture avec les médias d’induction adipocyte.
    5. Le jour 4, placez-vous dans media base adipocyte.
      Remarque : Les gouttelettes lipidiques peuvent commencent à apparaître dès 2 jours ou 4 jours.
    6. Au jour 7, observent que les cellules ont accumulé des gouttelettes lipidiques maximale et présentent un phénotype similaire à un adipocyte mature. La culture pas au-delà de ce point, car elle peut entraîner la mort/détachement de cellules.

7. différenciation des CSH en ostéoclastes

  1. Faire médias différenciation ostéoclastique en ajoutant 50 µL de 25 µg/mL de récepteur activateur de NFKB Ligand (RANKL) et 15 µL de 25 µg/mL de macrophage Colony Stimulating Factor (mCSF) à 25 mL de milieu de Culture BMSC.
  2. Une fois que le ca total (de l’étape 4.3) ou les cellules non adhérentes (de l’étape 5.2) sont attachés au puits, milieux de culture peut être commuté aux médias de différenciation ostéoclastique. Reconstituer les médias de différenciation tous les deux jours.
  3. Respecter les cultures des ostéoclastes chaque jour sous un microscope à grossissement de 10 X. Observer que les ostéoclastes fusionnent et forment des cellules multinucléées, généralement autour du jour 5-7 de différenciation.

8. coloration

  1. Ostéoblastes
    NOTE : La coloration de la Phosphatase alcaline (PA), nous avons souvent utiliser une coloration d’AP de l’ensemble (voir Table des matières) conformément aux lignes directrices.
    1. Effectuer AP coloration en suivant les instructions du fabricant de kit.
      1. Aspirer les médias et rincer les cellules avec du PBS. Fixer les cellules avec 4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 12 min à température ambiante.
      2. Entre-temps, faire la solution de l’AP à l’aide des réactifs de l’AP kit de coloration en ajoutant 500 µL Nitrite de Sodium 500 µL de solution alcaline-FRV et mélanger délicatement ; laisser reposer pendant 2 min. Ajouter 22,5 mL dH2O et 500 µL Naphthol AS-BI alcaline. Mélanger doucement.
        ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
      3. Une fois que les cellules sont fixées, rincer avec du PBS et ajouter la solution AP dans chaque cupule (1 à 2 mL par puits). Couvrir de papier d’aluminium et laisser tache pendant 30 min à température ambiante, abrie de la lumière. Aspirer la solution, rincer à l’eau distillée et laissez sécher la plaque.
    2. Acquisition d’images de colonies teintés à l’aide d’une caméra afin d’observer les cellules positives de la phosphatase alcaline.
    3. Vous pouvez également exécuter Von Kossa au lieu de la coloration de la phosphatase alcaline. Pour cela, laver les puits avec de l’eau distillée comme n’importe quel autres PBS précipitera avec nitrate d’argent.
      1. Fixer les cellules avec 4 % PFA dans du PBS pendant 12 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez suffisamment 5 % de solution de nitrate d’argent pour couvrir le puits et l’exposer à une forte lumière pendant 1 h à température ambiante.
    4. Enlever la solution de nitrate d’argent et rincer chaque puits avec de l’eau distillée. Ajouter la solution de thiosulfate de sodium 5 % pour les cellules et laisser reposer pendant 3 min.
    5. Aspirer le thiosulfate de sodium et laver à l’eau distillée. Laisser la plaque sécher et observer le gisement minéral teinté brun foncé/noir avec l’oeil nu.
  2. Adipocytes
    1. Pour la coloration de l’huile rouge O (ORO), fixer les cellules à l’aide de 10 % formol tamponné de neutre pendant 1 h à température ambiante.
    2. Pendant ce temps, faire la Solution Stock de ORO en dissolvant 0,035 g dans 10 mL d’isopropanol. Cela est suffisant pour une plaque 6 puits. Mélanger et passer la solution à l’aide d’un papier filtre (pore taille 11 µm).
    3. Faire la Solution diluée de ORO en diluant avec 9 mL de solution mère de ORO 6 ml d’eau distillée. Laisser la solution sur un rocker jusqu’au prêt à l’emploi.
    4. Préparer l’isopropanol de 60 % dans l’eau distillée (assez pour couvrir chacun faire bien).
    5. Une fois que les cellules sont fixées, retirer la fixateur et laver une fois à l’eau distillée. Remplacez l’eau par la solution d’isopropanol 60 % pendant 1 min.
      NOTE : Ajouter du liquide lentement pendant le basculement de la plaque ; adipocytes déloger très facilement.
    6. Retirez l’isopropanol et ajouter assez de Solution de travail ORO pour couvrir toutes les cellules. Incuber pendant 15 minutes sur un rocker basse vitesse à la température ambiante. Enlever ORO et laver deux fois avec de l’eau distillée.
      Remarque : À ce stade, gouttelettes lipidiques ORO teinté peuvent être visualisées au microscope.
    7. Afin de quantifier l’ORO, décolorer l’ORO en ajoutant 1 mL d’isopropanol 100 % à chaque puits et en balançant doucement pendant 10 min.
    8. Pendant ce temps, préparer une série de dilution pour créer une courbe standard basée sur les normes suivantes de 8 à l’aide de la Solution diluée de ORO (2 100 µg/mL) et l’isopropanol comme diluant : 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 et 0 µg/mL.
    9. 200 µL des normes et des échantillons destained en géométrie sur une plaque de charge et de lire l’absorbance à 490 nm.
      1. Déterminer la concentration de ORO pour chaque échantillon basé sur la courbe d’étalonnage.
        Remarque : Nous recommandons la normalisation de la concentration de ORO à nombre de cellules. Le nombre de cellules peut être quantifié en cristal violet de coloration ou de la quantité d’ADN.
  3. Ostéoclastes
    Remarque : Lorsque vous êtes prêt, nous suggérons de coloration des ostéoclastes pour kit de Tartrate-résistantes Acid Phosphatase (TRAP) en utilisant la coloration du piège (voir Table des matières).
    1. Pour piège à coloration, fixer les cellules pendant 30 min à température ambiante avec le glutaraldéhyde à 2,5 % dans du PBS. Pendant ce temps, faire la solution de piège en mélangeant 50 µL de la Solution de Base rapide grenats, 50 µL de Nitrite de Sodium, 4,55 mL d’eau distillée, 50 µL de Napthol AS-Biphosphate, 200 µL de solution d’acétate et 100 µL de solution de Tartrate.
    2. Aspirer au large de fixateur et rincer les cellules avec du PBS à deux fois avant d’ajouter la solution piège pendant 1 h à 37 ° C.
    3. Laver à l’eau distillée avant le dépouillement des ostéoclastes sous un microscope (grossissement 10 X). Les cellules de piège+ apparaissent pourpres avec 3 ou plusieurs noyaux.

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Résultats

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Aperçu des Cultures cellulaires
Les techniques de deux culture permettent l’évaluation de la différenciation sur une population mixte de BMC composé BMSC et csh (ca Total, Figure 1 a) ou d’une population de BMSC se sépare du CSH (BMSC Adherent, Figure 1 b). 48 h après que les cellules de la moelle sont isolés et plaqués (Figure 1), ils attachent au fond de la plaque de culture en ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, deux méthodes de culture de BMSC sont présentées avec leurs avantages et leurs limites. Isoler les cellules provenant de la moelle osseuse est un processus relativement sans effort. Cependant, il peut être difficile en raison de l’environnement cellulaire diverse de la cavité de moelle d’obtenir une population de cellules représentante des cellules souches mésenchymateuses ou progéniteurs ostéoclastiques.

Cultivant l’intégralité du contenu de la moelle osseuse fournit une rep...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs divulguer qu’ils n’ont aucun conflit financier d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01 AR061164-01 a 1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
200&mu ; L pointes de pipette  ;Rainin17014401
1,5 mL tubes à centrifugerUSA Scientific1615-5500
15 mL tube conique  ;VWR89039-668
Tube conique de 50 mLVWR89039-660
Saline tamponnée au phosphate (PBS)  ;Sigma-Aldrich21-040-CM
ÉthanolFisher Science04-355-451
Outils
70 &mu ; m filtersBD Falcon352350
0.25 % trypsineGibco25200
KimwipeVWR82003-820
Paraformaldéhyde (PFA)Microscopie électronique Science15710
Kit de phosphatase alcalineSigma-Aldrich86R
Nitrate d’argentSigma-AldrichS6506
Thiosulfate de sodiumSigma-AldrichS7026
Huile Rouge OSigma-AldrichO0625
IsopropanolSigma-Aldrich190764
10 % Neutre Tamponné FormolSigma-AldrichF5554-4L
Filtre Whatman Grade 1Sigma-AldrichZ274852
Kit de phosphatase acide résistante au tartrateSigma-Aldrich387A
GlutaraldéhydeElectron16220
MEM&alpha ;Gibco12571
Sérum de veau fœtalVWR97068-085
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140-122
&beta ;-phosphate de glycérolSigma-AldrichG9891
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA4544
DMEM High Glucose  ;Sigma-AldrichD5796
RosiglitazoneCayman Chemical717410
InsulineSigma-AldrichI6634
IBMXSigma-AldrichI5879
DexaméthasoneSigma-AldrichD4902
RANKLPeprotech310-01
mCSFPeprotech315-02
Axio Observer microscope à onduleurZeiss
de dissection

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
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Mots-clés

Isolement cellulaireCulture cellulaireDiff renciation ost og niqueDiff renciation adipog niqueCellules souches h matopo tiquesFraction vasculaire stromaleDiff renciation cellulaireDiff renciation des ost oclastes

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