Article de méthode

Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

DOI :

10.3791/56766

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12 juin 2018

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1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Dans cet article

Résumé

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Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.

Résumé

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Bien qu’adeno-associated virus (AAV) est largement reconnue comme un vecteur attractif pour la thérapie génique, il sert aussi comme virus modèle pour comprendre la biologie du virus. Dans le respect de ce dernier, la récente découverte d’une protéine AAV non structurelles, appelée protéines activatrices Assemblée (PAA), a jeté une lumière nouvelle sur les processus impliqués dans l’assemblage des protéines de capside virale VP dans une capside. Bien que de nombreux sérotypes d’AAV exigent PAA pour l’assemblage, nous avons récemment rapporté que AAV4, 5, et 11 y a des exceptions à cette règle. En outre, nous avons démontré que AAPs et assemblés capsides des sérotypes différents localiser aux différents compartiments subcellulaires. Cette hétérogénéité inattendue dans les propriétés biologiques et de rôles fonctionnels de l’AAPs parmi différent AAV sérotypes souligne que l’importance des études sur AAPs provenant de divers sérotypes. Ce manuscrit détaille un simple dot blot de dosage pour dosage AAV et son application afin d’évaluer la spécificité de la dépendance et sérotype PAA dans l’assemblage de la capside. Pour démontrer l’utilité de ce test de la tache de dot, nous partîmes pour caractériser l’assemblage de la capside et dépendance PAA de serpent AAV, un reptile non définie auparavant AAV, ainsi que AAV5 et AAV9, qui ont déjà démontré qu’être PAA-indépendants et dépendants du PAA sérotypes, respectivement. L’analyse a révélé que Snake AAV capside Assemblée exige PAA de serpent et qu’il ne peut être promue par AAPs de AAV5 et AAV9. L’analyse a également montré que, contrairement à beaucoup du sérotype souvent AAPs qui favorisent l’assemblage de la capside hétérologue par Croix-complémentation, serpent PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9. En outre, nous montrons que le choix de la nucléase affecte de manière significative la lecture de l’essai de tache de dot, et ainsi, choisir une enzyme optimale est essentielle pour une évaluation réussie de titres d’AAV.

Introduction

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Adeno-associated virus (AAV) est un virus à ADN petit, non enveloppés, simple brin avec un génome d’environ 4,7 kilobases (kb). Le génome de l’AAV contient des cadres de lecture ouvert (ORF) pour les gènes rep et cap . En 2010, une protéine non structuraux inconnue codée par un ORF décalés dans le cadre de + 1 gène de cap de l’AAV2 a été découvert par Sonntag et coll. et jugée jouent un rôle essentiel dans l’assemblage de AAV2 protéines de la capside VP monomère dans le viral 1de capside. Cette nouvelle protéine a été baptisée Assemblée-activating protein (PAA) le rôle qu’elle joue dans la promotion de capside Assemblée1.

L’ORFs PAA été bioinformatically identifié dans les génomes de tous les parvovirus dans le genre Dependoparvovirus, mais pas dans les génomes des virus de différents genres de la parvovirose famille1,2. Des études fonctionnelles de cette nouvelle protéine étaient initialement axées sur le PAA du prototype AAV2 (AAP2), qui a établi le rôle essentiel du AAP2 pour cibler les protéines VP démontées le nucléole pour leur accumulation et leur formation en entièrement assemblé des capsides1,3,4. L’incapacité des capsides AAV2 à assembler en l’absence d’expression de l’AAP a été indépendamment confirmé par plusieurs groupes, y compris la nôtre,1,2,3,4,5 . Des études ultérieures sur les sérotypes d’AAV 1, 8 et 9 corroborent le rôle crucial de l’AAPs dans Assemblée de capside, sous forme de protéines VP3 monomère de AAV1, 8, et 9 ont été incapables de former une capside entièrement Assemblée en l’absence de la co-expression de PAA2.

Récemment, grâce à des méthodes qui incluent l’utilisation quantitative dot blot essais, nous avons étudié la capacité des AAV1 à 12 VP3 monomères d’assembler dans des capsides en l’absence d’expression de la PAA et la capacité de AAP1 à 12 pour promouvoir l’Assemblée de VP3 monomères de sérotypes hétérologues. Cette étude a révélé que AAV4, 5 et 11 VP3 monomères peuvent se réunir sans PAA. En outre, il a été constaté que huit des douze sérotypes PAA nous avons examiné (c'est-à-diretous sauf AAP4, 5, 11 et 12) affiche une large capacité pour soutenir l’assemblage de la capside des capsides de sérotype AAV hétérologues, tout en AAP4, 5, 11 et 12 affiché un substantiellement capacité limitée à cet égard6. Ces quatre sérotypes sont phylogénétiquement éloignées des autres PAA sérotypes2,3. En outre, l’étude a révélé une hétérogénéité significative dans des localisations subcellulaires des différents AAPs6. En outre, l’étude a suggéré que l’association serrée PAA avec capsides assemblés et le nucléole, la marque distinctive d’AAV2 Assemblée de capside, ne peut nécessairement être étendue à d’autres sérotypes, y compris AAV5, 8 et 9, qui affichent des nucléole exclusion de capsides assemblé6. Ainsi, l’information obtenue grâce à l’étude d’un sérotype particulier PAA n’est pas applicable à tous les biologie du PAA. Telle nature curieux de biologie PAA souligne la nécessité d’enquêter sur le rôle et la fonction de chaque AAP de sérotypes d’AAV canoniques et non canoniques.

Le rôle biologique du PAA en assemblage de la capside peut être évalué en déterminant que les titres de particule virale AAV emballé entièrement produit en rein embryonnaire humain (HEK) 293 cellules, la lignée de cellules plus couramment utilisés pour la production de vecteur d’AAV, avec ou sans protéine PAA expression. Les méthodes standards pour le dosage de l’AAV sont PCR quantitative (qPCR)-dosages selon7,8 et quantitative dot blot-basé assays9. Autres méthodes de quantification des particules virales AAV comme enzyme-linked immunosorbent assay10,11 ou de mesure de densité optique12 ne sont pas idéales pour les échantillons provenant de nombreux différents sérotypes d’AAV ou échantillons contaminés par des impuretés (lysats bruts ou milieux de culture), qui sont souvent les échantillons utilisés pour la recherche de l’AAV. Actuellement, qPCR est plus largement utilisé pour le dosage de l’AAV ; Toutefois, il est nécessaire de reconnaître d’éventuels avertissements du dosage qPCR-basé, comme le dosage peuvent entraîner des erreurs systémiques et titre importantes variations13,14. Les analyses basées sur la PCR sont affectés par un certain nombre de facteurs, comme la présence de covalence fermés barettes terminales dans les modèles de PCR qui inhibent l’amplification13potentiellement confondants. Même une personne expérimentée peut introduire le potentiel des facteurs confondants dans une base de qPCR dosage inconsciemment13. En revanche, quantitative dot blot dosages sont une technique classique de biologie moléculaire qui ne comporte pas d’amplification du génome et utilise de manière beaucoup plus simple avec un risque minimal d’erreurs par rapport aux analyses qPCR. La méthode est moins techniquement difficile ; par conséquent, les résultats de titrage sont raisonnablement reproductibles même par des personnes inexpérimentées.

Dans ce rapport, nous décrivons les détails méthodologiques d’un test de la tache point quantitatif régulièrement, nous utilisons pour le dosage de vecteur AAV et fournissent un exemple de Comment veut appliquer l’analyse pour étudier le rôle de l’Assemblée-promotion du PAE en commun sérotypes (AAV5 et AAV9) et une auparavant non caractérisé PAA du serpent AAV14. Dans la nature, AAV VP protéines et protéines de l’AAP sont exprimés en cis d’un seul gène (c'est-à-dire, VP-PAA cis-complémentation), tandis que dans l’essai décrit ici, protéines VP et AAP sont fournis en trans de deux plasmides distincts (c.-à-d., VP-PAA TRANS-complémentation). Étant donné que chaque protéine VP ou PAA de sérotypes différents peut être exprimée de chaque plasmide indépendant, il devient possible de tester les combinaisons de VP-PAA hétérologues pour l’assemblage de la capside (c.-à-d., VP-PAA Croix-complémentation). Brièvement, AAV VP3 de différents sérotypes est exprimée dans les cellules HEK 293 par transfection d’ADN plasmidique pour empaqueter un génome de vecteur d’AAV en présence ou en absence du sérotype apparenté du PAA, ou en présence d’un sérotype hétérologue du PAA. Production, milieux de culture et de lysats cellulaires sont soumis à un essai de tache de dot pour quantifier le génome viral dans la coquille de la capside. La première étape du test dot blot est de traiter des échantillons avec une nucléase pour supprimer contaminantes plasmide DNAs et non emballés AAV génomes dans les échantillons. Faute de quoi augmenterait les signaux de fond en particulier lorsque des échantillons non-purifiés sont dosés. Ceci est alors suivi d’un traitement de protéase à briser les capsides virales et libérer des génomes viraux nucléase-résistante dans exemples de solutions. Prochaines, virales de génomes sont dénaturés, effacés sur une membrane et hybridés avec une sonde d’ADN spécifiques d’un génome virale à la quantification. Dans l’analyse de l’exemple rapporté ici, nous démontrons que Snake AAV VP3 exige PAA de serpent pour l’assemblage de la capside et que Snake PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9 contrairement à beaucoup de l’AAPs dérivée de sérotypes PAA-dépendante qui peuvent aussi favoriser l’Assemblée de capsides sérotype hétérologue. Enfin, nous présentons une mise en garde importante à qPCR ou quantification de VAA axée sur la tache point essais que le choix de la nucléase affecte significativement les résultats de titrage.

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Protocole

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NOTE : Les recettes pour les solutions et tampons nécessaires à ce protocole sont fournis dans le tableau 1. Le protocole décrit ci-dessous est pour l’essai de tache de point de croix-complémentation VP-PAA étudier les rôles des protéines dans l’assemblage de la capside du PAA. La méthode pour le dosage de tache point quantitatif plus générique pour le titrage de vecteur AAV purifiée est expliquée dans la section Résultats de représentant .

1. construction de VP3, PAA et Rep AAV2 exprimant des plasmides

  1. Construction du CMVp-AAVx-VP3 (x = sérotypes)
    1. PCR-amplifier l’ORF de VP3 (1,6 Ko) tout en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité et la paire d’amorces suivant : VP3 avance, CTAA-RE1-CACC-N25 (les 25 premiers nucléotides de l’ORF VP3) ; VP3 inverse, TCTT-RE2-N25 (les 25 derniers nucléotides de l’ORF VP3).
      NOTE : RE1 et RE2 sont des sites pour les enzymes de restriction (REs) pour le clonage. CTAA et TCTT sont le terminal 5' et 3' tétranucléotides ajoutées pour faciliter la digestion de l’enzyme de restriction près de l’extrémité de l’ADN double brin. CACC est une séquence consensus de Kozak.
    2. Cloner les amplicons RE-digested entre les correspondants RE sites d’un vecteur d’expression chez les mammifères qui utilise le cytomégalovirus humain (CMV-IE) immédiatement-début enhancer-promoteur pour expression de haut niveau.
      Remarque : Pour le clonage moléculaire, digérer 5 µg de l’ADN de plasmide d’épine dorsale avec une restriction enzyme(s) à une concentration de 4 U/µg d’ADN pendant 1 h à une température optimale. Pour les fragments PCR, augmenter les unités d’enzymes utilisées (p. ex., 10 U/µg du produit PCR ORF VP3 1,6 Ko) et un temps d’incubation plus longs (par exemple, 4 h) due à une augmentation du nombre de sites de reconnaissance enzyme de restriction par unité de longueur. Informations utiles en enzymes de biologie moléculaire et les procédures de clonage dont la transformation bactérienne se trouvent ailleurs15,16,17.
  2. Construction du CMVp-drapeau-AAPx (x = sérotypes)
    1. PCR-amplifier l’ensemble AAP ORF (0,6 kb) à l’exception du premier acide aminé en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité et la paire d’amorces suivant : PAA avance, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (les 25 nucléotides de la 4ème nucléotide dans le PAA ORF) ; PAA inverse, TCTT-RE2-N25 (les 25 derniers nucléotides de l’AAP ORF).
      Remarque : GACTACAAGGACGACGATGACAAA codes une étiquette de drapeau, qui a été montrée pour avoir aucun effets négatifs4,5 , mais peut être omise si inutile.
    2. Cloner les amplicons RE-digested entre les sites correspondants d’un vecteur d’expression chez les mammifères avec le CMV-IE enhancer-promoteur15,16,17.
  3. Construction de pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg du plasmide pAAV-RC2 (7,3 Ko) avec 20 unités de chaque de Xho I et Xcm j’ai et purifier l’ADN à l’aide d’une trousse commerciale de purification ADN ou par extraction au phénol-chloroforme.
      NOTE : Enlèvement du 1,8 Ko Xho I-Xcm, que j’ai des fragments du 7,3 Ko pAAV-RC2 plasmide provoque une perte d’expression des protéines de capside VP tout en préservant l’expression de la protéine.
    2. Émoussé, l’ADN se termine avec 6 unités de T4 ADN polymérase, agarose gel-purifier le fragment d’ADN de 5,5 kb et les ligaturer le fragment purifié à l’aide de 50 à 100 ng d’ADN et 400 unités de T4 DNA ligase selon recommandation15 les directives du fabricant.
    3. Suivez la procédure standard de transformation bactérienne référencée à l’étape 1.1.2 Note.
  4. Vérifiez que le plasmide construit par enzyme de restriction digestion et séquençage15,18.
  5. Effectuer le plasmide minipreps ou maxipreps à l’aide de kits disponibles dans le commerce pour obtenir une quantité suffisante d’ADN plasmidique pour les expériences de production AAV en aval.

2. production d’AAV dans HEK 293 cellules par Transfection d’ADN plasmidique (analyse de la Croix-complémentation)

  1. La culture de cellules HEK 293 dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM)-taux de glycémie élevé (4,5 g/L) additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % la pénicilline et streptomycine Mix et 1 mM de L-glutamine, dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
    NOTE : Les titres de VAA s’écarte sensiblement selon la provenance des cellules HEK 293.
    ATTENTION : Bien que AAV peut être traitée au niveau de biosécurité 1 confinement (BSL1), confinement BSL2 est recommandé pour le travail de cellules HEK 293.
  2. Jour -1 (24 h avant la transfection), plaque de 6 – 7 x 105 HEK 293 cellules/puits dans 2 mL du milieu complet décrit à l’étape 2.1 dans une plaque (s) 6 puits. Ce qui généralement atteint environ 90 % confluence le lendemain.
  3. Jour 0 : Transfection
    1. Préparation pour la transfection d’ADN
      1. Assurez-vous que les cellules ont atteint confluence de ~ 90 %.
      2. DMEM supplémenté avec 1 % pénicilline & Mix de streptomycine et 1 mM de L-glutamine, mais sans les 10 % d’échauffement FBS (c'est-à-diresans sérum moyen) dans un bain-marie à 37 ° C.
      3. Laisser la solution polyéthylènimine (PEI) à température ambiante.
    2. Préparation du mélange de l’ADN de plasmide
      1. Mélanger les plasmides en 96 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans CaCl2 ou MgCl2 tubes de microcentrifuge de stériles de 1,5 mL comme indiqué dans le tableau 2. Le montant total de l’ADN est de 2 µg/puits.
        Remarque : Les volumes de la solution d’ADN de plasmide peuvent être négligées si ils sont nominales. Réglage du volume est recommandé si le volume total des solutions ADN plasmidique est ≥ 10 µL.
    3. Transfection de PEI
      1. Ajouter 4 µL de solution de PEI (1 mg/mL) à la composition de l’ADN de plasmide-PBS (préparée comme indiqué ci-dessus). Le volume final est environ 100 µL (5 % du volume de milieu de culture). Vortex les tubes brièvement et incuber le mélange de l’ADN : PEI pendant 15 min à température ambiante.
      2. En attendant l’incubation de 15 min compléter, remplacer le milieu de culture avec un milieu sans sérum préchauffée décrit à l’étape 2.3.1.2.
      3. Une fois le 15 min d’incubation de l’ADN : mélange de PEI est achevé, brièvement tourner les tubes avec une micro-centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond des tubes et ajouter le mélange de l’ADN : PEI goutte au milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture de cellules HEK 293. Doucement agiter les plaques et les ramener à un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
      4. Maintenir les cellules dans ce milieu de transfection jusqu'à la récolte au jour 5 (aucun changement médiatique n’est nécessaire).
  4. Le jour 1 et jour 2, observer des cellules transfectées avec les plasmides CMVp-GFP sous le microscope inversé par fluorescence pour évaluer l’efficacité de transfection.
    Remarque : pour la microscopie de fluorescence, voici un 10 X / 0.25 objectif ouverture numérique en combinaison avec un oculaire de 10 × a été utilisé, et filtre passe-bande de 450 à 490 nm excitation et filtre d’émission de 515 à 565 nm passe-bande travaillaient. La condition ci-dessus donne normalement plus d’efficacité de transfection de 70 %. Les cellules peuvent présenter des changements morphologiques (p. ex. cellules sont devenues minces) en raison de l’État sans sérum.
  5. Jours 3 à 5, continuer à la culture des cellules transfectées dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
  6. Le jour 5, recueillir les cellules et le milieu contenant du virus dans les tubes coniques en polypropylène 15 mL par pipetage de haut en bas ou en grattant avec un grattoir de cellules.
  7. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. dot Blot Assay pour le dosage de l’AAV

  1. Récupération des particules virales
    1. Rapidement dégeler les tuyaux gelés dans un bain-marie à 37 ° C. Vortex les tubes vigoureusement pendant 1 min maximiser la récupération de l’AAV dans les cellules.
    2. Les débris de cellules de granule par centrifugation à 3 700 x g à 4 ° C pendant 10 min. Prendre 200 µL de surnageant de chaque éprouvette et transférez-le dans un tube de microcentrifuge étiquetées avec un bouchon à vis sur le dot blot assay.
      NOTE : Partie aliquote le surnageant restant dans microcentrifugeuse tubes et stockez-les congelé à-80 ° C pour une utilisation future. Ici, tubes de microcentrifuge polypropylène attaché avec bouchons à vis et un joint torique ont été utilisés. Étanche est nécessaire pour prévenir les déversements de AAV et phénol-chloroforme.
  2. Traitement avec l’endonucléase de Serratia marcescens
    1. Préparer des réactifs A de Mix et Mix B (tableau 3). Ajouter 10 µL du mélange A et 10 µL du mélange B dans chaque tube. Vortex les tubes pendant 5 s, brièvement tourner les tubes pour recueillir le liquide au fond des tubes et incuber les tubes à 37 ° C au moins pendant 1 heure.
      NOTE : Mélange A contient NaOH et optimise le pH pour le traitement avec l’endonucléase de S. marcescens . Mix B suppléments de magnésium. Concentration de S. marcescens endonucléase stocks enzyme commercialement disponibles peut-être varier. Le volume de S. marcescens endonucléase doit être ajusté en conséquence pour faire 200 U/mL après avoir ajouté le mélange A et B de le Mix dans des tubes à l’étape 3.2.1.
      NOTE : Un temps d’incubation plus longs, vers le haut à 4 h, peut diminuer les signaux de fond.
    2. À la fin de l’incubation, brièvement tourner les tubes avec une centrifugeuse de paillasse pour recueillir la condensation et la solution par le haut et les côtés des tubes.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons peuvent être conservés congelés à-20 ° C ou à-80 ° C.
  3. Traitement de la protéinase K
    1. Préparer le mélange C réactif (tableau 3). Ajouter 180 µL du mélange C dans chaque tube. Vortex les tubes pendant 5 s, brièvement tourner les tubes et les incuber les tubes à 55 ° C pendant 1 h.
      Remarque : L’EDTA dans le réactif C Mix chélates ions magnésium libre et inactive S. marcescens endonucléase.
    2. À la fin de l’incubation, permettent des échantillons à température ambiante et actionner brièvement les tubes avec une centrifugeuse de paillasse pour recueillir la condensation et la solution par le haut et les côtés des tubes.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons peuvent être conservés congelés à-20 ° C ou à-80 ° C. Pour reprendre le protocole, incuber les tubes à 55 ° C pendant 5 à 10 min de dissoudre les cristaux de SDS contenues dans la mémoire tampon complètement.
  4. Précipitation d’extraction et d’éthanol de phénol-chloroforme
    1. Ajouter 200 µL de phénol-chloroforme dans les échantillons et les vortex eux pendant 1 min. tournent les échantillons dans un microcentrifuge à ≥ 16, 100 x g pendant ≥ 5 min à température ambiante.
      ATTENTION : Phénol-chloroforme devrait être manipulé sous une hotte chimique avec l’équipement de protection individuelle approprié (EPI ; c'est-à-dire, gants en nitrile, lunettes de protection ou un écran facial et blouse à manches longues).
    2. Transfert de 320 µL de la phase aqueuse (160 µL deux fois avec une pipette de P200) dans un nouveau tube de microcentrifuge standard (80 % du volume de fluide aqueux).
      Remarque : Il est primordial de prendre le même volume de solution aqueuse entre échantillons, sinon le test perd précision quantitative.
    3. Préparer le réactif de Mix D (tableau 3). Ajouter 833 µL du mélange D dans chaque tube. Vortex les tubes pendant 5 s et incuber les tubes à-80 ° C pendant 20 min.
      NOTE : Mix D est un mélange d’éthanol, acétate de sodium et glycogène pour la précipitation d’éthanol commode de l’ADN. Échantillons peuvent être conservés à-80 ° C à cette étape et le protocole peut être repris plus tard.
    4. Centrifuger les échantillons d’un microcentrifuge à ≥ 16 100 x g à 4 ° C pendant 15 min. égoutter surnageant et éponger une fois sur une serviette en papier propre. Mettre environ 500 µL d’éthanol à 70 % dans chaque tube, vortex les tubes pendant 5 s et centrifuger les tubes avec un microcentrifuge de benchtop à ≥ 16, 100 g de x à 4 ° C pendant ≥ 5 min.
    5. Décanter le liquide surnageant et éponger une fois sur un essuie-tout propre. Granulés secs à 65 ° C ; pellets peuvent être séchés complètement.
      Remarque : Ne pas utiliser une pipette pour enlever l’excès d’éthanol qui reste après avoir éponger les tubes. Pellets peuvent également être séchés à température ambiante pendant la nuit. Le protocole peut être suspendu ici et séchées ADN granulés peuvent être stockés à température ambiante pendant plusieurs jours avec le tube couvercle fermé.
  5. Remise en suspension de l’ADN viral dans un tampon TE
    1. Dissoudre les granules d’ADN dans 120 µL de chaque de tampon TE en secouant chaque tube pendant 30 min à 1 h à température ambiante.
  6. Tache de dot
    1. Élaboration de normes d’ADN plasmidique
      1. Diluer l’AAV vecteur génome ADN plasmidique à 10 ng/µL dans l’eau ou de tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Prendre 25 µL de cette dilution et digest avec une enzyme de restriction appropriée pendant 1 h à linéariser le plasmide ADN, dans un volume réactionnel de 50 µL.
        NOTE : Nous faisons un jeu une copie de la digestion (voir étape 3.6.4.1). L’enzyme appropriée devrait être celui qui coupe l’ADN de plasmide hors de la région de liaison sonde dot blot. Pour plus de commodité, l’ADN de plasmide dilué peut être aliquotés (25 µL/tube) et stockés congelés à-20 ° C pour une utilisation future. Digérer l’ADN de plasmide tandis que les tubes sont en secouant dans l’étape 3.5.1. Ne digèrent pas trop le plasmide ADN standard.
      2. Ajouter 450 µL d’eau ou TE dans le tube contenant le plasmide digéré ADN standard et bien mélanger. Transférer 70 µL de ce mélange dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL avec 1 330 µL d’eau ou de TE faire un plasmide dilué standard (25 pg/µL).
      3. Suivre le tableau 4 pour créer une série de dilutions en série double (600 µL/tube). Bien mélanger les dilutions au Vortex pendant 5 s.
    2. Dénaturation des normes et des échantillons d’ADN virales
      1. Ajouter 600 µL de 2 x Solution alcaline à chaque dilution standard. Mélangez bien au Vortex pendant 5 à 10 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
      2. Ajouter 120 µL de 2 x Solution alcaline dans chaque échantillon d’ADN viral. Mélangez bien au Vortex pendant 5 à 10 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    3. Paramétrage de l’appareil de dot blot
      1. À l’aide de ciseaux, couper une membrane buvard (p. ex., zeta-sonde) à la bonne taille pour le nombre d’échantillons et étalons. Faire tremper la membrane avec de l’eau pendant 10 min avant de le placer sur un appareil de dot blot. Couvrir les puits non utilisés sur l’appareil de la membrane.
        NOTE : Gérer la membrane avec la pince à épiler propre. Pour couvrir le puits vides, la feuille de protection contre la lumière bleue qui vient avec la membrane peut être utilisée. Ne pas laisser la membrane sécher avant contraignant les échantillons et étalons. Pour plus de détails sur le montage et l’utilisation de l’appareil, veuillez vous référer au manuel utilisateur19.
      2. Ajouter de l’eau dans les puits dont les échantillons seront chargés. Arroser de vide et tirer à travers les puits pour vérifier les erreurs et refaites le test lors de la fixation. Resserrez les vis tout en appliquant une dépression pour assurer la fermeture étanche.
        NOTE : Étanchéité incomplète peut entraîner des fuites d’échantillon entre les puits.
      3. Une fois que l’eau est complètement passée à travers, libérer le vide complètement (c'est-à-dire, le collecteur d’aspiration devrait être ouvert à la pression atmosphérique).
    4. Chargement des normes et des échantillons à l’appareil à dot blot
      1. Appliquez 400 µL de chaque plasmide dilué ADN standard dans chaque puits et exécuter les quatre voies de dilutions standards. Utiliser deux aliquotes distinctes du standard digest et charger chacun en deux exemplaires. Appliquer 200 µL/puits de chaque échantillon d’ADN viral.
        Remarque : En utilisant le reste ~ 40 µL d’échantillons dénaturés, échantillons dilués peuvent être préparés (par exemple, un facteur 10 échantillons dilués avec de 20 µL de l’échantillon plus de 180 µL de Solution alcaline 1 x) et effacés si nécessaire.
      2. Appliquer doux vide pour passer les solutions d’ADN dans le puits.
        NOTE : Vide pression devra être ajustée en ouvrant partiellement un robinet à trois voies afin que la pression de vide est appliquée à la dot blot appareil ainsi que l’atmosphère (c'est-à-dire, avec les bras de robinet placé à un angle d’environ 45 ° où il fait un bruit d’aspiration plus fort).
      3. Une fois que tous les puits ont vidé, libérer le vide en ajustant la vanne trois voies. Ajouter 400 µL de Solution alcaline 1 x dans chaque cupule contenant les échantillons et étalons. Attendre 5 min avant de ré-appliquer le vide pour vider les puits.
      4. Ré-appliquer le vide de la même manière (voir étape 3.6.4.2).
      5. Démonter l’appareil point de tache sous vide, retirer la membrane et rincez-la avec 2 x SSC. Placer la membrane sur un essuie-tout propre avec le côté d’ADN lié vers le haut pour enlever l’excès 2 x SSC.
      6. UV-crosslink le buvardages ADN à la membrane avec une RETICULATION UV appropriée ; la membrane est maintenant prête pour l’hybridation.
        NOTE : Membranes humides peuvent être utilisés pour la réticulation UV. Le séché, UV-réticulé membranes peuvent être stockés à température ambiante. On trouvera de plus amples informations dans la Table des matières.
  7. Hybridation et lavage
    1. Réchauffer le tampon d’hybridation dans un bain d’eau de 65 ° C.
    2. Enzymatiquement étiqueter une sonde d’ADN avec32P dCTP radioactif α - et de le purifier à l’aide de kits disponibles dans le commerce selon la recommandation du manufacturier.
      Remarque : Nous utilisons une sonde de 0,5 à 2,0 kb dans la longueur d’une région d’enhancer-promoteur ou une séquence codant pour des protéines dans le génome viral. Bien que ce protocole utilise 32sondes radioactives marquées P pour la détection du signal, non radioactif par chimiluminescence ou fluorescents sondes peuvent également être utilisés (veuillez vous reporter à la section « Discussion »).
    3. Placer la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté d’ADN lié vers le haut, rinçage de la membrane avec 5 mL préchauffé tampon d’hybridation et jetez la mémoire tampon. Puis ajouter 10 mL de tampon d’hybridation préchauffée et placer le flacon dans un four à hybridation rotatif réglé à 65 ° C. Agiter pendant ≥ 5 min.
    4. Chaleur-20 µL de 10 mg/mL cisaillé hareng ou solution d’ADN de sperme de saumon et la sonde marquée par un P de 32(≥ 107 cpm) pendant 5 min à dénaturer en plaçant les tubes sur un ensemble de bloc de chaleur à 100 ° C. Snap-chill sur glace pendant ≥ 2 min, spin brièvement, puis garder sur la glace jusqu'à l’utilisation.
      ATTENTION : Pour des sondes d’ADN radioactifs, tubes de 1,5 mL avec bouchon à vis et le joint torique doivent être utilisés.
    5. Ajouter rapidement l’ADN dénaturé de sperme et la sonde radioactive vers le tampon de l’hybridation dans l’hybridation flacon et agiter vigoureusement la bouteille pendant 10 s pour mélanger. Remettre la bouteille dans le four de 65 ° C et laisser incuber la bouteille avec rotation à 65 ° C pendant ≥ 4 h.
    6. Une fois que l’hybridation est terminée, arrêter la rotation, enlever la bouteille de l’hybridation et puis versez la solution sonde radioactive dans un tube conique de 50 mL avec un capuchon de joint étanche. Stockez la sonde dans un récipient placé dans un réfrigérateur désigné pour les matières radioactives.
      Remarque : Utilisé un tampon d’hybridation avec une sonde qui est stockée à 4 ° C peut être ré-utilisé au moins 5 fois en plaçant le tube conique de 50 mL avec un capuchon de joint étanche qui contient un tampon d’hybridation dans un bain-marie à 100 ° C pendant 5 min.
    7. Nettoyer la membrane avec le tampon de lavage chauffé à 65 ° C. Ajouter 20 à 30 mL de tampon de lavage dans le flacon de l’hybridation et faire tourner pendant 5 min. répéter ce laver 2 fois plus.
      NOTE : Mesurer la radioactivité des solutions de lavage et inscrivez-la si requis par l’Institut local.
    8. Lors du lavage de la membrane, placez un écran sur une gomme à effacer image pendant 5 min-images au phosphore.
    9. Après le troisième lavage, enlever la membrane de la bouteille d’hybridation, enlever l’excès de tampon sur la membrane avec du papier absorbant et placer la membrane dans un support de papier en plastique transparent. Vérifier les signaux radioactifs sur la membrane à l’aide d’un compteur Geiger. Exposez l’écran d’imagerie de phosphore sont effacées à la membrane pendant 10 min à la nuit selon l’intensité du signal.
    10. Balayage de l’écran en utilisant une image de phosphore, système de balayage et d’obtenir les données sur l’intensité du signal de chaque point.
  8. Analyse des données
    1. Dessiner une courbe d’étalonnage à l’aide de la feuille de calcul et de données logiciels d’analyse (par exemple, Excel).
      NOTE : Régression linéaire Log-log a été utilisée pour dessiner une courbe d’étalonnage.
    2. Déterminer l’équivalent nanogramme (ng-eq) pour chacun des échantillons ADN virales par interpolation. Le ng-eq est le montant du plasmide ADN utilisée pour dessiner une courbe d’étalonnage qui équivaut au nombre de molécules d’ADN virales. Lorsque la longueur de l’ADN de plasmide est 8 000 bp, 1 ng-eq de l’ADN viral AAV monocaténaire correspond à 2,275 x 108 particules.
      Remarque : Le ng-eq peut être converti en nombre de particules virales par les équations suivantes :
      Équation pour le calcul des particules AAV simple brin ; quantification de l’ADN ; Formule de génétique moléculaire.
      Équation pour calculer les particules AAV double brin à l’aide de la longueur du plasmide ; Formule scientifique.
      Le nombre de particules AAV est conventionnellement exprimé en « vg » (vecteur génomes) ou « PRA » (particules j’ai résistant à la DNase).
    3. Calculer les concentrations d’AAV de produits de départ. Parce que l’ADN viral buvardages représente 66,7 % Formule de calcul du pourcentage : (320/400 × 200/240 × 100 %) pour l’analyse des données. de l’ADN viral dans les matières de départ, 1 ng-eq correspond à 1,7 x 109 particules/mL équation mathématique, formule de calcul, division de rapport, multiplication, notation scientifique .
      Remarque : Cette correction n’est pas nécessaire si tous les ADN virale contenue dans le produit de départ sont effacé sur une membrane sans perte (voir Figure 1).

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Résultats

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Un résultat représentatif des taches point quantitatif pour le dosage des stocks de vecteur AAV purifiées produites à grande échelle est illustré à la Figure 1. Avec cet essai de tache de dot, le titre d’un stock de vecteur bicaténaire AAV2G9-CMV-GFP a été déterminé. Le vecteur a été purifié par deux séries de chlorure de césium (CsCl), gradient de densité ultracentrifugation suivie de dialyse comme décrit précédemment20. En général, p...

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Discussion

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Dans ce rapport, l’utilité des quantitatifs dot blot dosages pour étudier AAPs AAV et leur rôle dans l’assemblage de la capside est décrite. Connaissances acquises grâce à ces études peuvent fournir un aperçu détaillé les différences innées dans le processus de montage de capside AAV et le rôle fonctionnel de l’AAPs entre sérotypes différents. À cet égard, le point de croix-complémentation AAV VP3-PAA blot assay a révélé que Snake AAV VP3 affiche une dépendance stricte sur la co-expression de ses apparenté PAA pour l’ass...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xiao Xiao à l’University of North Carolina at Chapel Hill nous remercions de nous avoir fourni le plasmide pEMBL-CMV-GFP. Nous remercions Christopher Cheng et Samuel J. Huang pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par Service de santé publique accorde (NIH R01 NS088399 et EY232113 T32).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BenzonaseMilliporeSigma1016970001Désigné sous le nom de Serratia marcescen endonucléase dans le texte principal.
DNase IRoche4716728001appelée DNase I Enzyme A dans le texte principal.
DNase IInvitrogen18047019appelée DNase I Enzyme B dans le texte principal.
DNase INew England BiolabsM0303LAppelée DNase I Enzyme C dans le texte principal.
1,5 mL Joint torique Bouchon à vis Tubes à microcentrifugerCorning430909
Tubes à microcentrifuger 1,5 mL ThermoFisher Scientific05-408-129
15 mL Tube conique en polypropylèneCorning352097
3 m Acétate de sodiumTeknovaS0298
50 mL Tube conique en polypropylèneCorning430291
Cellules AAV-293 Agilent240073lignée cellulaire HEK-293 optimisée pour l’emballage des virions AAV.
AccuGENE 0,5 M Solution EDTALonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0Lonza51238
AccuGENE 10 % SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Bio-Dot ApparatusBio-Rad1706545
Albumine sérique bovineMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
ChloroformMilliporeSigma372978
Kit d’extraction d’ADNWako Pure Chemical Industries295-50201Ceci est utilisé pour les taches quantitatives sur le virus purifié. Nous n’utilisons qu’un demi-volume de tous les réactifs à chaque étape recommandés pour le schéma de protocole 2 dans le manuel fourni par le fabricant.
Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)-glycémie élevée (4,5 g/L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Fetal Bovin SerumVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095Appelé Polysaccharose 400.
Microscope à fluorescenceZeissAxiovert 40 CFL
GlycogèneRoche10901393001
Hareng Sperme ADNInvitrogen15634-017
Tubes d’hybridationThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Life SciencesImageQuant TL
L-glutamine 200 mMLonza17-605E
Chlorure de magnésium hexahydratéMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
Mini colonnes d’ADN à spin rapideMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Pénicilline/Streptomycine 10K/10KLonza17-602E
Saline tamponnée au phosphateLonza17-516F
Cassette d’exposition à l’imagerie phosphorescenteGE Healthcare Life Sciencesdivers
Écran d’imagerie phosphorescenteGE Healthcare Life SciencesDivers
Plasmide Maxi KitQIAGEN12162
Platinum Pfx ADN polyméraseInvitrogen
PolyéthyléniePolysciencesInc 23966-2
PolyvinylpyrrolidoneMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Kit d’étiquetage d’amorce aléatoireAgilent Technologies300385
Amorce AAP Forward (N25 nucléotides du 4ème nucléotide de l’ORF AAP, RE1 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer Primer
AAP Reverse (N25 est les 25 derniers nucléotides de l’ORF AAP, RE2 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Amorce VP3 Forward (N25 les 25 premiers nucléotides de l’ORF VP3, RE1 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 est les 25 derniers nucléotides de l’ORF AAP, RE2 est un site d’enzyme de restriction pour le clonage) : TCTT-RE2-N25MilliporeSigma,Custom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
RestrictionEnzymes New England BiolabsDivers
Saumon Sperme ADNInvitrogen15632011
Pipettes sérologiquesThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Chlorure de sodiumThermo Fisher ScientificS271-10
Citrate de sodium tribasique dihydratéMilliporeSigmaC8532
T4 ADN polyméraseNew England BiolabsM0203L
ThermocycleurEppendorf6321000515
6 puitsCorning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Saturated PhenolInvitrogen15513-047
Réticulant UVSpectrolineXLE-1000Le mode de réticulation optimal est utilisé, fournissant une dose d’énergie UV de 120 mJ/cm2.
Membrane Zeta-ProbeBio-Rad162-0165
11708013Plaque traitée à353046

Références

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