Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

John M. Powers; Xiao Lan Chang; Zhen Song; Hiroyuki Nakai

doi:10.3791/56766

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Article de méthode

Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

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DOI :

10.3791/56766

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12 juin 2018

John M. Powers¹ , Xiao Lan Chang¹ , Zhen Song¹ , Hiroyuki Nakai¹^,²

¹Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, ²Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.

Résumé

Bien qu’adeno-associated virus (AAV) est largement reconnue comme un vecteur attractif pour la thérapie génique, il sert aussi comme virus modèle pour comprendre la biologie du virus. Dans le respect de ce dernier, la récente découverte d’une protéine AAV non structurelles, appelée protéines activatrices Assemblée (PAA), a jeté une lumière nouvelle sur les processus impliqués dans l’assemblage des protéines de capside virale VP dans une capside. Bien que de nombreux sérotypes d’AAV exigent PAA pour l’assemblage, nous avons récemment rapporté que AAV4, 5, et 11 y a des exceptions à cette règle. En outre, nous avons démontré que AAPs et assemblés capsides des sérotypes différents localiser aux différents compartiments subcellulaires. Cette hétérogénéité inattendue dans les propriétés biologiques et de rôles fonctionnels de l’AAPs parmi différent AAV sérotypes souligne que l’importance des études sur AAPs provenant de divers sérotypes. Ce manuscrit détaille un simple dot blot de dosage pour dosage AAV et son application afin d’évaluer la spécificité de la dépendance et sérotype PAA dans l’assemblage de la capside. Pour démontrer l’utilité de ce test de la tache de dot, nous partîmes pour caractériser l’assemblage de la capside et dépendance PAA de serpent AAV, un reptile non définie auparavant AAV, ainsi que AAV5 et AAV9, qui ont déjà démontré qu’être PAA-indépendants et dépendants du PAA sérotypes, respectivement. L’analyse a révélé que Snake AAV capside Assemblée exige PAA de serpent et qu’il ne peut être promue par AAPs de AAV5 et AAV9. L’analyse a également montré que, contrairement à beaucoup du sérotype souvent AAPs qui favorisent l’assemblage de la capside hétérologue par Croix-complémentation, serpent PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9. En outre, nous montrons que le choix de la nucléase affecte de manière significative la lecture de l’essai de tache de dot, et ainsi, choisir une enzyme optimale est essentielle pour une évaluation réussie de titres d’AAV.

Introduction

Adeno-associated virus (AAV) est un virus à ADN petit, non enveloppés, simple brin avec un génome d’environ 4,7 kilobases (kb). Le génome de l’AAV contient des cadres de lecture ouvert (ORF) pour les gènes rep et cap . En 2010, une protéine non structuraux inconnue codée par un ORF décalés dans le cadre de + 1 gène de cap de l’AAV2 a été découvert par Sonntag et coll. et jugée jouent un rôle essentiel dans l’assemblage de AAV2 protéines de la capside VP monomère dans le viral ¹de capside. Cette nouvelle protéine a été baptisée Assemblée-activating protein (PAA) le rôle qu’elle joue dans la promotion de capsid....