Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.
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Article de méthode
Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau
Dans cet article
Résumé
Résumé
Imagerie de calcium (Ca2 +) est un outil puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle de Ca2 + signaux intracellulaires dans les dendrites neuronales. Ca2 + fluctuations peuvent se produire à travers une variété de membrane et mécanismes intracellulaires et jouent un rôle crucial dans l’induction de la plasticité synaptique et la régulation de l’excitabilité dendritique. La capacité d’enregistrer différents types de signaux de Ca2 + en ramifications dendritiques est donc précieuse pour des groupes d’étudier comment dendrites intègrent l’information. L’avènement de la microscopie biphotonique a fait ces études beaucoup plus facile en résolvant les problèmes inhérents à l’imagerie dans les tissus vivants, tels que la diffusion de la lumière et le photovieillissement. En outre, grâce à la combinaison de techniques électrophysiologiques classiques avec deux photons Ca2 + imagerie, il est possible d’étudier Ca2 + fluctuations locales dans les dendrites neuronales en parallèle avec les enregistrements de l’activité synaptique Soma. Nous décrivons ici comment utiliser cette méthode pour étudier la dynamique des locaux Ca2 + transitoires (chats) dans les dendrites des interneurones inhibiteurs GABAergiques. La méthode peut être également appliquée à l’étude dendritiques Ca2 + signalisation dans différents types de neurones dans des tranches de cerveau aiguë.
Introduction
La contribution d’un neurone à l’activité du réseau est en grande partie déterminée par la nature dynamique des entrées synaptiques qu’il reçoit. Traditionnellement, la principale méthode de caractérisation de l’activité synaptique dans les neurones s’est fondé sur les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière somatique des courants postsynaptiques évoqués par stimulation électrique des axones de passage. Toutefois, la seule activité des synapses situées dans la partie proximale est véridiquement signalée dans ce cas1. En outre, afin d’évaluer les mécanismes spécifiques à synapse, enregistrements de paires de neurones et de dendrites....
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Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées selon les orientations de bien-être de l’Animal Protection Comité de Université Laval et le Conseil canadien de protection des animaux.
1. préliminaire préparation (facultatif : préparer 1 jour à l’avance)
- Préparer trois types de solution liquide céphalorachidien artificiel (FSCA) (Normal, saccharose et Solutions de récupération, 1 L ; voir tableau 1). Ajuster l’osmolalité des solutions à 300 ± 10 mOsm25 et refroidir le FSCA-Sucrose jusqu'à un point près du point de congélation (0-4 ° C).
Remarque : L’utilisation d’une solution de découpe de faibl....
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Résultats
En utilisant le protocole présenté ici, nous avons obtenu des chats évoquées par injection de courant somatique et par la stimulation électrique dans les dendrites des interneurones oriens/alveus dans la région CA1 de l’hippocampe. Après patcher un neurone, identifié selon sa forme et sa position, nous avons acquis linescans travers une dendrite proximale en plusieurs points au vu des distances depuis le soma (Figure 1 a). Nous avons observé une diminution de.......
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Discussion
La méthode présentée ici montre comment la combinaison de deux photons Ca2 + imagerie et électrophysiologie patch clamp peut être utilisée pour l’étude dendritiques Ca2 + la signalisation dans les dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë. Cette méthode permet le suivi des deux locaux Ca2 + élévations évoquées par AP électrique de stimulation ou backpropagating segments dendritiques et somatique réponse de la cellule. Ce qui rend un excellent outil pour étudier comment les d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Conseil des instituts de recherche en santé, Sciences naturelles et en génie (subvention à la découverte du CRSNG) et la Fondation Savoy. OC a été soutenu par une bourse de doctorat du CRSNG.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Souche animale : Souris CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 chlorhydrate | Abcam | ab120337 | |
| Chlorure de calcium ; | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose ; | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Chlorure de magnésium ; | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sulfate de magnésium heptahydraté | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldéhyde en poudre, 95 % | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Chlorure de potassium ; | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Gluconate de potassium | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Azoture de sodium ; | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Bicarbonate de sodium ; | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Chlorure de sodium ; | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Saccharose ; | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 ; | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Base Trizma ; | Chlorhydrate de trizma Sigma-Aldrich | T1503 | |
| ; | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Phosphate de sodium dibasique dihydraté | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Phosphate de sodium monobasique monohydraté ; | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytine | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) ; | Abcam | ab120042 | |
Adénosine triphosphate (ATP)-Tris | Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 | ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocréatine di(tris) salt | Sigma-Aldrich | P1937 | |
Alexa-546 conjugué à la streptavidine | ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Capillaires en verre borosilicaté | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Capillaires en verre borosilicaté | Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Extracteur de micropipettes flamboyantes/brunes | Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Microscope multiphotonique confocal | Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti :Laser multiphotonique saphir ; | Logiciel d’acquisition | ||
| Leica Microsystems | |||
Contrôleur de température TC-324B | Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B | Amplifier Molecular Devices | ||
Digidata 1440A | Digitizer Molecular Devices | ||
Confocal Traducteur | Siskiyou | ||
Micromanipulateur | Siskiyou | ||
pClamp Logiciel d’acquisition de données | Dispositifs moléculaires | ||
A365 Isolateur de stimulus à courant constant | World Precision Instruments | ||
Vibraplane Table | optique Kinetic Systems |
Références
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997). ....
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Réimpressions et autorisations
