L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.
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Article de méthode
Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal
Dans cet article
Résumé
Résumé
Contrairement aux ovaires de drosophile adultes, ovaires nymphales sont relativement difficiles d’accès et examiner en raison de leur petite taille, la translucidité et moulant au sein de la pupe. Le défi de disséquer les ovaires nymphales réside aussi dans leur emplacement physique au sein de la chrysalide : les ovaires sont entourées par des cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, et ces cellules adipeuses doivent être enlevés pour permettre une bonne anticorps. Pour surmonter ces défis, ce protocole utilise des pipettes Pasteur personnalisés afin d’extraire les cellules du tissu adipeux de l’abdomen pupal. En outre, une lamelle compartimentée est utilisée à la place d’un tube de microcentrifuge pendant le processus de coloration pour améliorer la visibilité de la pupe. Cependant, malgré ces et d’autres avantages des outils utilisés dans le présent protocole, l’exécution réussie de ces techniques peut nécessiter encore plusieurs jours de pratique en raison de la petite taille des ovaires nymphales. Les techniques décrites dans le présent protocole pourraient être appliquées à des expériences de cours moment où ovaires sont analysés à différents stades de développement de pupe.
Introduction
Recherche sur les cellules souches utilisant drosophile ovaires a largement augmenté depuis la première documentation d’une cellule souche niche1,2,3,4. Suit l’évolution des outils génétiques du traçage de lignage, drosophile ovaire dissections ont été couramment utilisées pour étudier des lignées de cellules souches et les voies qui régulent la maintenance des cellules souches, la prolifération et sort dans la niche de cellules souches de signalisation. Connaissance de ces voies de signalisation peut-être donner un aperçu des causes possibles des cancers qui proviennent des cellules souches aberrantes activité5,6,7. Il a récemment été démontré que les cellules souches somatiques dans l’ovaire de la drosophile , appelées cellules souches de follicule (FSC), ressemblent fortement aux mammifères les cellules souches intestinales dans de nombreux aspects de leur organisation8. Pour cette raison, les ovaires de drosophile sont un système modèle hautement utile pour étudier le comportement des cellules souches.
Alors que les ovaires larvaires et adultes offrent des indices de développement précoce de cellules souches et l’organisation de la finale des cellules souches dans la niche, respectivement, l’ovaire pupal est une structure intermédiaire, dans lequel les cellules germinales et les cellules somatiques réorganiser et d’établir leur identité 9 , 10. bien que plusieurs études ont examiné des aspects du développement des tissus dans l’ovaire pupal10,11,12,13, questions subsistent quant à la différenciation et l’organisation spatiale des types de cellules ovariennes au cours du développement de pupe. En particulier, la spécification du FSC se produit pendant cette période. Ce protocole décrit une méthode de dissection et coloration des pupes ovaires aux moments désirés — une technique qui peut être utilisée dans des expériences de cours temps qui analysent le développement de pupes ovarien en détail de du stade larvaire au stade adulte.
Pour expliquer la petite taille, translucidité et inaccessibilité de l’ovaire pupe dans l’abdomen de pupe, ce protocole utilise des outils tels qu’une pipette de Pasteur à pointe fine sur mesure pour enlever le tissu adipeux abdominal entrave l’accès d’anticorps à la ovaires. Une lamelle de claire, chambrée utilisée au cours de l’anticorps coloration offre une plus grande visibilité de la pupe et une plateforme plus douce balancement des ovaires sur un « Nutator ». Basé sur un protocole pour les dissections de larves ovaire de Maimon et Gilboa14, une concentration relativement élevée de Triton X-100 a été utilisée dans les premières étapes de la procédure de marquage pour maximiser l’accès perméabilisation et anticorps de membrane cellulaire à la cellules ovariennes.
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Protocole
1. EggLaying
- Mélanger environ dix hommes et quinze femelles adultes drosophile mouches du génotype désiré dans un flacon de nourriture normale de mouche riche additionné de levure. Pour éviter le surpeuplement de la fiole, permettent des femelles accouplées à pondre pour pas plus de 2 à 4 h14.
- Transférer les adultes à partir du flacon dans un flacon de nouveau en tapant sur le flacon d’ouverture contre un flacon différent avec de la nourriture volée. Laissez les oeufs deviennent des larves à température ambiante pendant 3 à 4 jours.
2. sélection des larves femelles
- À l’aide d’un pinceau humide de poils doux, faire un mouvement de roulement avec la brosse le long de la paroi du flacon pour transférer des larves de troisième stade errants dans le flacon à un verre bien rempli à ras bord 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lavez les débris de nourriture au large de la larve en transférant vers un autre bien remplis avec du PBS 1 x.
- Séparer les larves mâles et femelles avec une pincette. Identifier les larves mâles par une paire de testicules grands, rond et translucides, intégrée dans les corps gras sur le côté latéral du corps environ deux-tiers vers le bas de son extrémité antérieure15. Les larves femelles sont en moyenne plus gros, moins translucide que les hommes et ont des gonades plus petites qui sont plus difficiles à détecter.
- Choisir contre les larves mâles pour recueillir les larves femelles. Recueillir au moins dix femelles du puits. Placez les larves femelles dans un autre bien rempli avec du PBS 1 x.
- Utilisation de forceps pour transférer les larves femelles doucement dans un nouveau flacon de lindustrie alimentaire des produits mouche additionné de levure.
- Placez le flacon avec les larves femelles dans un endroit sombre afin de faciliter le puparium16. Tout au long de la journée, surveiller les larves pour puparium. Comme chaque larve immobilise et se développe en un prepupa, entourez le prépupale contre le flacon et enregistrer le temps approximatif quand il forme tout d’abord dans un prepupa. Identifier les prénymphes par la saillie du stigmate antérieur et le calendrier du puparium formation17. Laissez les prénymphes de développer jusqu’au délai souhaité (mesurée en heures après la formation du puparium, CSA).
Remarque : Tous les animaux qui subissent une formation puparium dans un intervalle environ 10 h peuvent être considéré comme un prepupa. Le stade pupal commence environ 12 h après la formation du puparium après qu’une mue interne a eu lieu.
3. préparation des nymphes pour la coloration des anticorps
-
Former une pipette de verre mince pour être utilisé dans les étapes ultérieures de compensation sur le tissu adipeux pupal.
- Faire fondre le bout de verre d’une pipette Pasteur au-dessus d’un brûleur Bunsen. Comme le verre fond, utilisez pince pour tirer la pointe horizontalement, loin du reste de la pipette pour former une pointe plus fine.
- Après refroidissement, casser une petite portion de l’extrémité de la pipette pour former une ouverture circulaire soignée. Fixez une ampoule à l’autre extrémité de la pipette.
- Charger la pipette avec du PBS 1 x.
- Pour récolter les nymphes, qui sont collées à la paroi du flacon, appliquer une petite goutte d’eau le long de la zone de contact entre la pupe et la flacon. Attendre 1 à 2 min de la protéine de laisser la colle se dissolvent avant de soulever délicatement la nymphe sur le mur avec un pinceau humide. Transférer la nymphe à un verre bien remplie de solution 1 PBS x. Dédiez un puits unique par chrysalide pour éviter la surpopulation du puits.
- Tout en tenant l’extrémité postérieure de la nymphe avec une paire de pinces, déchirez soigneusement la portion antérieure de la pupe avec une autre paire jusqu'à ce que la tête de la nymphe est visible.
- Saisissez l’extrémité antérieure plus de la tête de nymphe avec une pince et tirer doucement la chrysalide hors de sa pupe.
Remarque : Une partie du tissu adipeux peut déborder au cours de ce processus. - Séparer et jeter la moitié antérieure de la nymphe de la moitié postérieure, jusqu'à ce que seulement le sac abdominal reste.
-
Extraire les cellules du tissu adipeux de la housse abdominale.
- Saisir le sac abdominal contre le fond du puits avec une pince d’une main tout en tenant la pipette de verre mince remplie de PBS 1 x dans une autre main.
- Viser l’embout de la pipette mince vers l’ouverture du sac et PBS 1 x pipet lentement dans l’abdomen pour évacuer les cellules du tissu adipeux entourant les ovaires nymphales.
Remarque : Les ovaires sont une paire de petites, translucides, striés et oblongues des structures qui devraient rester à l’intérieur du sac abdominal. - Laver que le tissu adipeux cellules jusqu'à ce qu’au moins deux-tiers du tissu adipeux est allé ou jusqu'à ce que les ovaires sont visibles près de l’ouverture du sac abdominal. Il est très important d’exécuter cette étape lentement pour ne pas laver les ovaires hors de l’abdomen par accident.
- Examiner le puits pour vérifier si les ovaires ont renversé lors du lavage de cellule de corps gras. Si les ovaires ne sont pas visibles à l’intérieur du puits, ils aurait dû rester dans l’abdomen. Si les ovaires sont sortis, placez une chrysalide nouvelle dans le puits et répétez cette étape.
- Transférer l’abdomen dans une chambre de lamelle clairement remplie de tampon de fixation (1 x PBS, paraformaldéhyde à 4 %) et placer le couvercle sur le dessus. Pour assurer un nombre suffisant d’ovaires résister à la coloration et le processus de montage, disséquer les ovaires plus que nécessaire.
ATTENTION : Le tampon de fixation contient paraformaldéhyde qui est toxique. Veuillez porter des protections appropriées telles que des gants, des lunettes de sécurité, etc..
4. immunohistochimie
- Tout au long du processus de coloration, utilisez pince pour pousser doucement vers le bas les ovaires flottants au fond du puits lamelle couvre-objet pour s’assurer que les ovaires soient complètement immergées dans la solution d’anticorps.
- Place des bandes de ruban adhésif double-face sur la surface plane d’une Nutator et placez ensuite la lamelle compartimentée sur la surface adhésive.
- Incuber les ovaires dans le tampon de fixation de l’étape 3,7 à température ambiante pendant 15 minutes.
- Rincer les ovaires trois fois dans du PBS 1 x 1 % X-100 Triton pour 5, 10 et 45 minutes (1 h au total), respectivement, pour permettre la perméabilisation approfondie.
- Bloquer les ovaires dans 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 pendant 30 min.
- Incuber les ovaires du jour au lendemain en 600 µL d’anticorps primaire de choix dilué à la concentration appropriée dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 à 4 ° C.
- Rincer les ovaires trois fois pendant 5 min dans du PBS 1 x 0,5 % X-100 Triton.
- Incuber les ovaires pendant 2 h dans 600 µL d’anticorps secondaire de choix diluée à la concentration appropriée dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 à température ambiante.
- Rincer les ovaires deux fois pendant 5 min dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 et une fois pendant 5 min dans du PBS 1 x.
5. dissection et ovaires pupes de montage
- Placez une petite goutte de PBS 1 x sur une lame de microscope. Utilisation de forceps pour transférer le sac abdominal de la lamelle compartimentée à un verre bien rempli de PBS 1 x. Dédiez un puits unique par chrysalide pour éviter la surpopulation du puits.
- Déchirer le sac abdominal et n’importe quel corps gras restantes avec une pince.
Remarque : Les ovaires, qui soient caractérisent par des structures petites, translucides, striés et oblongues, devraient être visibles à l’intérieur du puits. Les ovaires sont souvent étroitement entourés par le tissu adipeux, il est donc important de s’assurer que tous les corps gras est complètement déchiré dehors. - Transférer les ovaires du puits dans la goutte de 1 x PBS sur le microscope slide en saisissant le Centre des ovaires entre les extrémités de la pince. Il est très important d’utiliser une prise ferme sans serrer les ovaires afin de ne pas de perdre ou de les détruire au cours du transfert. Ajouter quelques gouttes de PBS 1 x à la diapositive lorsque la solution s’assèche au fil du temps.
- Une fois que tous les ovaires ont été disséqués et transférés à la lame de microscope, ajouter 40 µL de milieu de montage sur une lamelle de 22 x 22 mm et place la lamelle doucement sur les ovaires. Laisser la lame sécher pendant la nuit avant l’imagerie.
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Résultats
L’exécution réussie de cette procédure devrait se traduire par anticorps clair coloration qui révèle la structure et l’organisation cellulaire d’un ovaire de pupes de drosophile . Immunohistochemistry décrite dans le présent protocole peut être utilisé pour identifier les types de cellule couramment teintés ovaires larvaires et adultes. Les cellules de la tige de pupe dérivé essaim cellules18 (contour blanc par Fasciclin III) sont indiquées à la
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Discussion
L’étape la plus critique et difficile du présent protocole nécessite la préparation des pupes ovaires avant la fixation. Pour s’assurer que les ovaires, petits et enterrées par les cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, sont suffisamment colorées avec les anticorps, il est important de larme non seulement une grande ouverture dans le sac abdominale avec une pince, mais aussi extraire les cellules de corps gras qui obstruent les ovaires de l’anticorps. L’exécution réussie de cette étape exige l’applicati...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (GM079351 RO1 à D.K.). Nous remercions Dorothea Godt pour ses conseils utiles sur des dissections ovaire pupal basé sur son protocole original. Nous remercions également Amy Reilein pour son aide et les commentaires sur le manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Pinces, biologie | Outils scientifiques fins | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Verre de protection chambré | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Microscope de dissection | Nikon | SMZ-10A | |
| Microscope confocal | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Logiciel d’analyse | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Dépression Plaques de verre | Pyrex | 7220-85 | |
| Pipette Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Ampoule de pipette Pasteur | Divers fournisseurs Bec | ||
| Bunsen Divers | fournisseurs | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm lamelles de recouvrement en verre N° 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Ruban adhésif double face | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Pinceau fin #0, #3-#5 Divers | fournisseurs | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contient p20, p200, p1000 pipettes |
| 16 % de paraformaldéhyde | Microscopie électronique Sciences | 15710 | Diluer à 4 % de paraformaldéhyde dans 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Diluer à 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Diluer à 10 % de sérum de chèvre normal dans PBST avec une concentration |
| de 0,5 % de TritonAnticorps primaires (dans le protocole : 7G10 anti-Fasciclin III dilué 1:250, anti-phosphohistone de lapin H3 dilué 1:1000) | Divers fournisseurs (dans le protocole : Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilué dans du PBST avec une concentration de 0,5 % de triton | |
| Anticorps secondaires (dans le protocole : Alexa-546, sérum anti-lapin conjugué au FITC) | Divers fournisseurs (dans le protocole : Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Diluer dans du PBST avec une concentration de 0,5 % de triton | |
| Flacons anti-mouches | Denville Scientific | V9406 | |
| Boules de coton, pour flacons larges | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Levure, boulangers séchés Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Nourriture pour mouches | Produit en laboratoire | Mélange d’eau, de levure de bière, de semoule de maïs, de mélasse, d’agar, d’EtOH, de pénicilline, de 4-hydrobenzoate de méthyle et d’acide propionique | |
| Mouches mâles et femelles Drosophila (génotype utilisé dans le protocole : yw ; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Centre de stock de drosophile de |
Références
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Réimpressions et autorisations
