Méthodes basées sur la microscopie pour l’évaluation de la Migration de cellules épithéliales lors In Vitro la cicatrisation des plaies

Summary

Ce manuscrit décrit comment incision-comme des lésions sur des monocouches de cellules épithéliales cultivées idéalement modèle embobiné guérison in vitro, permettant pour l’imagerie confocale ou microscopie à balayage de laser, et qui peuvent fournir de haute qualité données quantitatives et qualitatives pour l’étude de comportement de la cellule tant les mécanismes impliqués dans la migration.

Abstract

La migration cellulaire est un aspect obligatoire pour la cicatrisation des plaies. Création artificielle plaies sur des modèles animaux de recherche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, tandis que potentiellement manque de précision. In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une plate-forme appropriée pour des recherches sur le comportement migratoire de cellule dans la cicatrisation des plaies et l’impact des traitements sur ces cellules. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée dans des conditions non-confluent ; Toutefois, cette approche ne peut pas ressembler à conditions de cicatrisation naturelle. Perturbant l’intégrité de l’épithélium par des moyens mécaniques, génère un modèle réaliste, mais peut faire obstacle à l’application des techniques moléculaires. En conséquence, les techniques de microscopie basée sont optimales pour l’étude de la migration de cellules épithéliales in vitro. Nous détaillons ici deux méthodes spécifiques, le dosage zéro blessure artificiel et le dosage avant migration artificielle, qui peut obtenir des données quantitatives et qualitatives, respectivement, sur les performances migratoires des cellules épithéliales.

Introduction

La migration cellulaire est nécessaire pour la cicatrisation des plaies, car elle est responsable de la fermeture définitive de l’écart épithélial et de la restauration de la surface perturbée¹. Effectuant des blessures artificielles dans des modèles animaux permet la réplication de ce processus complexe en proches des conditions physiologiques². Toutefois, cette approche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, qui potentiellement manquent de précision pour l’étude des processus distincts, étant donné la nature complexe du processus de cicatrisation.

In vitro

Protocol

1. artificiel plaie gratter dosage pour des études quantitatives

1. Préparation de monocouches de cellules
   1. Travaillant dans des conditions stériles, des graines et la croissance des cellules épithéliales Mv1Lu ou HaCaT dans des flacons de culture utilisant le milieu additionné de sérum. Actualiser le support une fois toutes les 24-48 h. Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, détacher les cellules en utilisant une méthode appropriée, c'est-à-dire, la trypsinisation⁹.
      Remarque : Mv1Lu et HaCaT des lignées de cellules épithéliales sont cultivées à l’aide de milieu de culture EMEM et DEMEM....

Results

Plaie artificiel Scratch test pour des études quantitatives : évaluer le facteur de croissance épidermique (EGF) Promotion de la Migration :

EGF est un inducteur bien connu de la prolifération de cellules épithéliales et de migration et donc un témoin positif de quantification de la promotion de la migration. Les monocouches de cellules Mv1Lu et HaCaT ont été utilisées dans les essais de zéro blessure et photos avant le traitement .......

Discussion

Sur la peau ou les muqueuses perturbation, fonction de barrière est restaurée par les actions de nombreux types de cellules, y compris les fibroblastes ou les cellules épithéliales et immunitaires. Conjointement, ces cellules subissent un complexe processus impliquant l’apoptose, prolifération, différenciation et surtout, des fibroblastes et epithelial cell migration, qui est le mécanisme ultime responsable de la restauration du tissu perturbé et le fermeture de l’écart épithéliale superficielle¹<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)	Biowest, Nuaillé ;, France	L0102-500	Supplément facultatif de 10 % FBS
Eagles' s Minimum Essential Medium (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Facultatif 10 % FBS supplément
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E	Utiliser à 2 mM
Fetal Bovin Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Diluer au besoin
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis	P9155
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Diluer à 1x
plaques de culture à 24 puits	BD FALCON//SARSTED	734-0020
Plaques de culture à 6 puits	SARSTEDT	83-3920
Facteur de croissance épidermique (EGF)Sigma-Aldrich	, St Louis, MO, USA	E9644	Utilisé 10 ng/mL
Verre de couverture rond	MENZEL-GLÄ ; SER	MENZCB00120RA020	FAIBLE PROFONDEUR DE CHAMP
Lame de rasoir renforcée n° 743	Martor (à travers VWR)	MARO743.50
200 µ ; l pointes de pipette d’aérosol stériles	VWR	732-0541
20 & micro ; l pointes de pipette aérosol stériles	VWR	732-0528
Appareil photo numérique couplé microscope à contraste de phase	Motic Espagne	Caméra Moticam 2300 3,0 M Pixel USB 2.0 ; Motic Optic AE31
Microscope confocal	ZEISS Microimaging, Allemagne	LSM 510 META
10 cm Antenne de culture	BD FALCON	353003
Rabbit Anticorps polyclonal anti c-Jun	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Utilisé 1:100
Anti-rabbit IgG (chèvre polyclonale) AF 488	Invitrogen	A11008	Utilisé 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Utilisé 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloïdine (dans le méthanol) (rouge)	Invitrogen	A12381	Usagé 1:100
Albumine sérique bovine	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Lait écrémé	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, États-Unis	Version 1.50i
Zen LSM 510 Logiciel de traitement d’image	ZEISS Microimaging, Allemagne	Version 5.0 SP 1.1