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Article de méthode

Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire

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DOI :

10.3791/56825

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17 mars 2018

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1Department of Biochemical Sciences, Sapienza University of Rome

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à évaluer l’effet des peptides sur la migration des cellules épithéliales bronchiques. Cette méthode permet l’obtention rapide et hautement reproductible des données quantitatives sur la vitesse de fermeture de migrations et de la blessure cellulaire.

Résumé

Le but de ce travail est de montrer une nouvelle méthode pour évaluer la capacité de certaines molécules immunomodulatrices, tels que des peptides antimicrobiens (ampères), pour stimuler la migration cellulaire. Ce qui est important, la migration cellulaire est un événement limitante au cours du processus de cicatrisation de rétablir l’intégrité et le fonctionnement normal des couches de tissus après une blessure. L’avantage de cette méthode sur l’analyse classique, qui est basé sur une rayure faite manuellement en une monocouche de cellules, est que l’utilisation de la culture de silicone spécial insère fournissant deux compartiments pour créer un champ de Pseudo-plaie acellulaire avec une largeur bien définie (500 μm ). En outre, en raison d’une plateforme d’analyse automatique d’image, il est possible d’obtenir rapidement des données quantitatives sur la vitesse de la plaie fermeture et la migration cellulaire. Plus précisément, l’effet des deux amplis de peau de grenouille sur la migration des cellules épithéliales bronchiques s’affichera. En outre, un prétraitement de ces cellules avec des inhibiteurs spécifiques vous renseignera sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent de tels événements.

Introduction

Il est largement connu que la cicatrisation des plaies chez les animaux est un processus fondamental de rétablir l’intégrité et le fonctionnement normal des couches de tissu après blessure1. Malgré les surfaces épithéliales exposés à l’environnement externe (par exemple, la peau, appareil respiratoire et digestif) forment une barrière protectrice des injures physiques et chimiques, la formation des plaies peut facilement se produire, surtout après une intervention chirurgicale ou infections microbiennes2. À titre d’exemple, la colonisation des tissus pulmonaires par la bactérie pathogène opportuniste, Pseudomonas aeruginosa, en particulier dans les personnes souffrant de fibrose kystique (FK), conduit aux dommages de l’épithélium des voies respiratoires avec une insuffisance respiratoire qui en résulte3, 4. La cicatrisation est un mécanisme de réparation complexes hôte pour restaurer l’architecture normale d’un tissu lésé5. Elle est caractérisée par une inflammation initiale, suivie d’une phase de régénération qui englobe l’épithélialisation, angiogenèse et transformant le tissu avec la production de collagène et cellulaire différenciation6,7,8 . Pour garantir l’intégrité épithéliale et de contrôler la prolifération microbienne, tous les organismes vivants produisent des molécules de défense, y compris les peptides antimicrobiens (ampères)9,10. La processus de cicatrisation est très difficile de simuler in vitro en raison de l’absence de débris cellulaires et des interactions complexes entre les différents types de cellules. Toutefois, la capacité in vitro d’un peptide d’accélérer la fermeture d’une Pseudo-plaie de en stimulant la migration des cellules épithéliales est révélateur de sa capacité à guérir un épithélium compromis. En effet, la migration cellulaire est un événement limitante dans la cicatrisation des plaies, et étudie les facteurs qui peuvent affecter la migration cellulaire contribuera à des thérapies de cibles pour améliorer la cicatrisation des plaies.

Ici, un test expérimental hautement reproductible repose sur des inserts de culture de silicone spécial pour évaluer la migration de cellules in vitro. Il repose sur la création d’un espace de μm (Pseudo-plaie) 500 sur une monocouche de cellules confluentes. Les cellules à la lisière du champ « blessé » artificielle vont commencer la migration vers la zone acellulaire, formant de nouveaux contacts de cellules. L’insert de la culture représente un nouvel outil pour les expériences de cicatrisation rapide. Deux réservoirs séparés par un mur de μm 500 sont fournis, et ils peuvent être placés correctement dans une assiette plat de 3 cm ou dans le puits d’une plaque de 12 puits. Remplir chaque compartiment de l’insert avec une suspension de cellules, permet aux cellules de se développer dans chaque zone désignée jusqu’au confluent, tandis que la suppression de l’insert engendrera un espace propre acellulaire d’environ 500 μm (la même largeur que le mur de séparation). Un milieu de culture cellulaire appropriée additionné d’un composé peut ensuite être ajouté dans le plat plaque/puits. Par la suite, les écarts peuvent être visualisées sous un microscope inversé, de préférence un équipé d’une caméra vidéo pour l’acquisition d’images à des intervalles de temps différents. Enfin, la mesure des changements dans la zone cellule couverte par le programme d’analyse des images automatisé sur Internet permettra la quantification de la vitesse de plaie fermeture et la migration cellulaire. Dans l’ensemble, cette méthode constitue une avancée en ce qui concerne le dosage classique, où une égratignure est faite manuellement par incision monocouches de cellules confluentes avec une aiguille stérile ou une pipette Astuce11. En effet, la dernière procédure peut détruire le fond en plastique du plat plaque/puits et le revêtement de surface, créant des rides. En outre, la zone « blessée » n’a pas une largeur bien définie sur toute la longueur de l’écart, car cela dépend fortement de la pression exercée par les chercheurs à la pointe de l’aiguille /. En outre, les délogent les cellules peuvent former des amas de cellules mortes et vivantes sur les bords de la rayure ; en outre, la diffusion des cellules vivantes dans la zone « blessé » peut interférer avec la vitesse de la migration cellulaire, générant des résultats non reproductibles,12.

En outre, grâce à une plateforme d’analyse image gratter, utilisateurs peuvent rapidement recevoir (en minutes) des données quantitatives sur le comportement migratoire des cellules sélectionnées sans la nécessité d’acquérir des logiciels supplémentaires. Cette plate-forme est capable d’analyser les images de microscopie de contraste de phase de faible (~ 5 X), moyen (~ 10 X) et grossissement élevé (~ 20 X). Après avoir téléchargé un fichier zip d’images (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format), l’analyse est automatiquement effectuée pour générer un fichier de synthèse qui montre le pourcentage de zones couvertes de cellule et de gratter les zones, ainsi que la vitesse de la cellule migration, à intervalles de temps distincts.

Dans ce travail, à l’aide d’un peau de grenouille AMP-dérivé, c'est-à-dire Esc(1-21) et son diastéréoisomère Esc(1-21) - 1C13et une lignée de cellules bronchiques exprimant la fonctionnelle CF transmembrane conductance regulator (CFTR)14,15, un exemple de migration cellulaire induite par le peptide en comparaison avec des échantillons (témoin) est fourni. Notez que l’épithélium des voies aériennes et CFTR jouent un rôle crucial dans le maintien de la fonction pulmonaire et plaie réparation16. En outre, au moyen d’inhibiteurs sélectifs (p. ex., AG1478)17 du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), preuve que la migration des cellules bronchiques induite par les peptides susmentionnées implique l’activation de l’EGFR12, 18 est signalée.

En résumé, l’objectif de cette procédure est de montrer comment l’utilisation de ces inserts de culture de silicone représente un test rapide et facile d’accès pour déterminer avec exactitude la migration des cellules adhérentes (par exemple, les cellules épithéliales bronchiques) et moléculaire mécanismes qui contrôlent ces événements.

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Protocole

1. préparation de la cellule

  1. Graines 2.5x106 cellules dans 10 mL de la médium essentiel Minimum (MEM) additionné de 2 mM de glutamine (MEMg), plus 10 % sérum fœtal (SVF), antibiotiques (0,1 mg/mL de pénicilline et de streptomycine) et la puromycine (0,5 µg/mL pour la sélection et l’entretien de la lignée cellulaire) dans une fiole de T75. Incuber le ballon à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2 jours. Avant de commencer l’expérience, vérifier la confluence des cellules sous un microscope inversé.
    Remarque : Les cellules utilisées pour l’expérience sont immortalisées des cellules épithéliales bronchiques humaines transduites avec un vecteur des gènes conférant une résistance à la puromycine. Ils expriment stablement une fonctionnelle CFTR14,15.
  2. Une fois que le confluent de la LiPo a atteint 90 à 100 %, aspirer le milieu de la fiole et jetez-le dans une bouteille pour eaux usées en vertu d’une classe de coffret de sécurité biologique II. Laver les cellules avec 6 mL de tampon phosphate salin sans calcium et magnésium (FMC-PBS). Doucement rock la fiole manuellement et jeter les FMC-PBS.
    Remarque : Veillez à ne pas y toucher la monocouche de cellules à l’aide de la pipette.
  3. Ajouter 10 mL de PBS-CMF et incuber la fiole à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 10 min.
  4. Aspirer le CMF-PBS et jetez-le. Ensuite, ajouter 2 mL de trypsine/EDTA au ballon.
  5. Balançant doucement le flacon, ce qui permet à la solution de complètement recouvrir les cellules et incuber la fiole à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 10 min jusqu'à ce que les cellules sont détachent visiblement sous un microscope.
    Remarque : À la fin de la période d’incubation, les cellules doivent faire arrondi et attachées à la surface en plastique. Si les cellules ne sont pas bien détachés, agitation manuelle peut être nécessaire.
  6. Ajouter 10 mL de MEMg majorée de 10 % FBS pour inactiver la trypsine et de recueillir les cellules en lavant le fond du flacon. Le volume de transfert dans un tube conique de 50 mL.
  7. Centrifuger le tube pendant 5 min à 80 x g.
  8. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 6 mL de MEMg majorée de 10 % FBS. Pipette à plusieurs reprises pour casser vers le haut tout amas.
  9. Retirez 10 µL de suspension cellulaire avec une micropipette et injecter le volume sous le couvercle en verre préalablement mis sur une chambre Burker ou Neubauer.
  10. Compter le nombre de cellules.

2. cellule semis dans la Culture insère

  1. Dans chaque puits d’une plaque de 12 puits, transférer l’insert de culture avec des pinces stériles (Figure 1). Pince à épiler permet d’appuyer sur les bords des plaquettes afin de les fixer à la surface de la plaque.
    NOTE : Inserts ont un collant dessous qui permet l’adhérence.

figure-protocol-1
Figure 1 : Représentation schématique des inserts de culture de la silicone, correctement mis en puits d’une plaque de 12 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Bien diluer la suspension cellulaire dans MEMg majorée de 10 % FBS. Remplir chaque compartiment de la cassette avec 70 µL de la suspension de cellules (environ 3.5x104 cellules/chambre).
    Remarque : La densité des cellules appliqués dans chaque compartiment dépend du type de cellules. Il est recommandé d’utiliser une densité cellulaire qui conduit à compléter la confluence sous 24h.
  2. Sous le microscope, vérifiez que les cellules ne fuient pas compartiments de l’insert et incuber la plaque de 12 puits pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO2.

3. Pseudo-plaie dosage de guérison

  1. Après incubation, visualiser les cellules au microscope inversé afin de vérifier que les monocouches de cellules confluentes ont été formés.
  2. Remettre en suspension les composés d’essai (par ex. SAP) dans 1 mL de MEMg.
    NOTE : Préparer des dilutions d’amplis fraîches à partir de la solution stock à-20 ° C.
  3. Retirez délicatement les inserts par pinces stériles. Veillez à ne pas briser les monocouches de cellules. Transférer les inserts sur du papier absorbant.
    Remarque : Pour réutiliser les mêmes insertions, eux à la stériliser dans l’éthanol à 70 % pendant au moins 3 h. Il est recommandé de les jeter par la suite.
  4. Pour supprimer les cellules non adhérentes, ajouter 1 mL de MEMg / bien à l’aide d’une micropipette. Fermez la plaque et secouez-le doucement.
    Remarque : N’ajoutez pas de support directement sur le dessus de monocouches de cellules pour éviter leur rupture.
  5. Aspirer le milieu et remplacez-la par 1 mL de MEMg / puits. Fermez la plaque et visualiser les écarts acellulaire (créés par les inserts) au microscope inversé à un grossissement X 4, équipé d’une caméra vidéo. Acquisition d’images au temps zéro (T0) et les enregistrer dans un format .jpg.
  6. Retirez le support des puits, lavez-les avec 1 mL de PBS et jetez-le.
  7. Ajouter les composés d’essai (préparés au point 3.2) dans les puits. Pour les échantillons témoins non traités, ajouter 1 mL de MEMg. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2.
  8. Après 15, 20 et 24 h de traitement, observer la migration des cellules au microscope au grossissement de X 4 et acquisition d’images.
    Remarque : Au cours de cette étape, essayer de capturer des images dans les mêmes domaines quant à T0. Le choix des intervalles de temps au cours de laquelle les images sont capturées dépend de la vitesse de migration des cellules.
  9. Pour étudier l’effet de certains inhibiteurs sélectifs, c'est-à-dire AG1478, sur la migration cellulaire, aspirer le milieu de chaque compartiment de l’insert avant de retirer les plaquettes.
    1. Lavez chaque compartiment avec MEMg frais et remplissez-le avec 70 µL de MEMg additionné de AG1478.
    2. Après 30 min d’incubation à 37 ° C et 5 % de CO2, procédez comme décrit du point 3.3.
      Remarque : Au cours de l’étape de lavage et le prétraitement des monocouches de cellules avec les inhibiteurs spécifiques, être attention à ne pas enlever les inserts.

4. image Analysis

  1. À la fin de l’expérience, sélectionnez les images des échantillons plus représentatifs des différents groupes expérimentaux et créer un fichier zip contenant des images simples à T0, T15, T20 et T24 h.
    NOTE : Images individuelles sont prises à des intervalles de temps sélectionné pour tous les échantillons. Exécutez réanalysés pour chaque expérience, ce qui est répété au moins trois fois. À la fin, pour tous les groupes, un minimum de 3 images (« a », « b », « c », etc., découlant de chaque expérience indépendante) à chaque point dans le temps, sont analysés.
  2. Téléchargez le fichier zip dans le logiciel d’analyse image qui fournit automatiquement par e-mail un fichier récapitulatif de feuille de calcul contenant les données expérimentales des zones couvertes de cellule et scratch (en pourcentage) aux points de temps choisi.
    Remarque : La reconnaissance de l’avant-garde et la zone d’écart repose en grande partie sur la méthode de détection de bord (visant à identifier les points où la luminosité de l’image change brusquement).
  3. Enregistrer les données et à leur rassemblement. Normaliser toutes les données à l’égard de la valeur moyenne au temps zéro. Calculer la valeur moyenne des données normalisées de toutes les répétitions à chaque point dans le temps et l’écart type (SEM). En utilisant deux voies analyse de variance (ANOVA), effectuer une analyse statistique avec un logiciel de statistiques appropriées. Différences entre les groupes traités peptide et les groupes de contrôle à différents intervalles de temps sont considérés comme statistiquement significatif pour un p< 0,05.
  4. Tracer les données obtenues dans un graphique sous forme d’histogramme, qui montre le pourcentage de surface cellulaire recouverte de tous les échantillons des groupes par rapport à l’intervalle de temps sélectionné.

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Résultats

Ce protocole a été utilisé pour déterminer l’effet des Esc(1-21) et Esc(1-21) - 1C en termes d’activité de migration cellulaire induite par des cellules épithéliales bronchiques exprimant le CFTR fonctionnel de cicatrisation. Dans ce test, les inserts de culture ont été placés dans le puits d’une plaque de 12 puits, et chaque compartiment a été ensemencé avec 35 000 cellules en MEMg additionné de 10 % FBS. Les cellules ont atteint confluence complet dans les 24 h. par la suite, un écart d...

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Discussion

La migration cellulaire est un processus essentiel à de nombreuses manifestations physiologiques et pathologiques, y compris la guérison des plaies, le développement embryonnaire et métastases cancéreuses. La procédure de base pour étudier la migration cellulaire in vitro comprend : (i) la création d’une monocouche de cellules, (ii) la production d’une Pseudo-plaie dans la couche confluente de cellules, (iii) la capture d’images à différents intervalles de temps jusqu'à ce que la plaie de suture est atteint et (...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Ce travail a été financé par l’Université la Sapienza de Rome et la Fondation de recherche mucoviscidose italienne (projet FFC #11/2014 adopté par les délégations de la FFC de Pavie, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny et la sienne). Partie de ce travail a également été défendue par FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.

Nous sommes reconnaissants à m. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italie) pour fournir les cellules épithéliales bronchiques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Support essentiel minimum (MEM)  ;EurocloneECB2071LWarm en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
GlutamineEurocloneECB3000D
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS)EurocloneECS0180DH  ;
Pénicilline et streptomycineEurocloneECB3001D
PuromycineSigma-AldrichP8833
Trypsine/EDTA 1X en PBSEurocloneECB3052DChauffer à température ambiante avant utilisation
DPBS sans calcium ni magnésium (CMF-PBS)Sigma-AldrichD8537
DPBS avec calcium et magnésium (PBS)Sigma-AldrichD8662
Ibidi Culture-Insert 2 puitsIbidi  ;80209
Wimasis Analyse d’imagesIbidi  ;30002
Logiciel PRISM  ;GraphPadversion 6.0

Références

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