Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

Krista M. Armbruster; Timothy C. Meredith

doi:10.3791/56842

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Article de méthode

Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

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DOI :

10.3791/56842

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21 mai 2018

Krista M. Armbruster¹ , Timothy C. Meredith¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

Dans cet article

Résumé

L’enrichissement des lipoprotéines bactériennes à l’aide d’une phase de surfactant non ionique, méthode de partitionnement est décrite pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou d’autres applications. D’autres mesures sont détaillées pour préparer des N-terminal lipopeptides tryptique pour la caractérisation structurale par spectrométrie de masse.

Résumé

Les lipoprotéines sont des constituants importants de l’enveloppe de la cellule bactérienne et puissants activateurs de la réponse immunitaire innée chez la mammifères. Malgré leur importance à la fois la physiologie cellulaire et immunologie, il reste encore beaucoup à découvrir sur les lipoprotéines nouveaux formulaires, comment ils sont synthétisés et l’effet des différentes formes sur l’immunité de l’hôte. Pour permettre des études approfondies sur les lipoprotéines, ce protocole décrit une méthode pour l’enrichissement de lipoprotéines bactériennes et préparation de N-terminal lipopeptides tryptique pour la détermination de structure par laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS). Poursuivant sur une phase de Triton X-114 établie partitionnement méthode pour extraction de lipoprotéines et l’enrichissement de la membrane de la cellule bactérienne, le protocole prévoit des mesures supplémentaires pour éliminer les contaminants non-lipoprotéines, augmentant le rendement de la lipoprotéine et pureté. Étant donné que les lipoprotéines sont couramment utilisés dans les essais de récepteurs Toll-like (TLR), il est essentiel d’abord caractériser la structure de N-terminal par MALDI-TOF Mme Herein, on présente une méthode pour isoler des peptides hydrophobes concentrés enrichis en N-terminal lipopeptides adaptés à l’analyse directe par MALDI-TOF MS/MS. lipoprotéines qui ont été séparés par électrophorèse Sodium dodécyl Sulfate Poly-Acrylamide (SDS-PAGE) sont transférées à une membrane de nitrocellulose, digérés in situ avec la trypsine, séquentiellement lavé pour enlever des peptides tryptiques polaires et finalement élué avec du chloroforme-méthanol. Lorsqu’il est couplé avec MS des peptides trypsinisés plus polaires de solutions de lavage, cette méthode fournit la capacité à identifier la lipoprotéine et caractériser son extrémité N-terminale dans une expérience simple. Formation d’un adduit sodium intentionnelle peut également être utilisée comme un outil pour promouvoir plusieurs spectres de fragmentation structurellement informative. En fin de compte, enrichissement des lipoprotéines et détermination de leurs structures de N-terminal permettra des études plus approfondies sur cette classe omniprésente des protéines bactériennes.

Introduction

Lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par une conservée cystéine des lipides modifiés de N-terminal qui ancre le domaine protéine globulaire à la surface de la membrane cellulaire. Ils sont universellement distribués chez les bactéries, qui constituent 2 à 5 % de tous les gènes cellulaires au sein d’un génome typique¹. Assemblée de complexes protéiques et dans le maintien de cellules enveloppe intégrité structurale², lipoprotéines jouent un rôle crucial dans une grande variété de processus cellulaires, notamment l’absorption des éléments nutritifs, transduction du signal. Chez les bactéries pathogènes, lipoprotéi....