Cinématique oculaire mesurée In Vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue

Résumé

Ce protocole décrit comment utiliser une in vitro isolé tortue préparation tête pour mesurer la cinématique des mouvements de leurs yeux. Après l’ablation du cerveau de la boîte crânienne, nerfs crâniens peut être stimulées par des courants de quantifier les rotations de le œil et les changements dans la taille de la pupille.

Résumé

Après que les animaux est euthanasiés, leurs tissus commencent à mourir. Tortues d’offrir un avantage en raison d’une plus longue durée de survie de leurs tissus, surtout comparé aux vertébrés à sang chaud. Pour cette raison, des expériences in vitro chez les tortues peuvent être effectuées pour des périodes prolongées de temps pour étudier les signaux neurones et le contrôle de leurs actions de la cible. En utilisant une préparation de tête isolée, nous avons mesuré la cinématique des mouvements oculaires chez les tortues, et leur modulation par des signaux électriques portés par les nerfs crâniens. Après que le cerveau a été supprimé sur le crâne, laissant les nerfs crâniens intact, la tête disséquée a été placée dans un cardan pour calibrer les mouvements des yeux. Électrodes de verre étaient attachés aux nerfs crâniens (oculomoteur, trochléen et abducens) et stimulés par des courants d’évoquer les mouvements des yeux. Nous avons suivi les mouvements des yeux avec une vidéo infrarouge suivi système et quantifiées rotations des yeux. Les impulsions de courant avec une gamme des amplitudes, des fréquences, et durées de train ont été utilisées pour observer les effets sur les réponses. Parce que la préparation est séparée par le cerveau, la voie efférente va cibles musculaires peut être examinée isolément pour étudier la signalisation neuronale en l’absence d’informations sensorielles centralement traitées.

Introduction

Justification de l’utilisation des tortues à oreilles rouges dans des expériences électrophysiologiques :

Tortues à oreilles rouges (Trachemys scripta elegans), sont considérés comme un des pires d’espèces envahissantes du monde¹ et peut indiquer qu’un écosystème est en difficulté. Pourquoi les tortues à oreilles rouges sont parvenus est mal comprise, mais elle peut être en partie en raison de leur physiologie tolérante et la possession des tissus nerveux qui peut survivre dans des conditions hypoxiques^2,3,4 . Leur uti....

Protocole

Remarque : Les tortues tortue à oreilles rouges, hommes et femmes, ont été achetés auprès d’un fournisseur. Les tortues étaient logés dans une suite d’animaux chaude contenant deux cuves de 60 gallons équipés d’îles de brique pour bronzer sous des lampes infrarouges 250 W. L’environnement était entretenu selon un cycle lumière/obscurité de 14/10-h avec la température de l’eau à 22 ° C. Lumières ont été allumés à 06:00 et éteint à 20:00. Les réservoirs équipés de systèmes de filtrage ont été nettoyés toutes les semaines, et tortues ont été nourris ad libitum tous les deux jours. Les soins des oreilles rouges des tortues et tous les suivants procédures expérime....

Résultats

La figure 1 illustre les alambics d’images tirées d’une vidéo décrivant la dissection. Images fournissent des endroits typiquement des nerfs avant la Coupe du cerveau.

Figure 1 : Stills d’images capturées à partir de la vidéo de la dissection pour montrer les emplacements du nerf optique (nII), nerf oculomote.......

Discussion

Étapes essentielles :

Les étapes critiques au sein de ce protocole sont les suivants : 1) la dissection et le soin apporté à maintenir la viabilité des nerfs sectionnées ; 2) la correspondance des tailles par les électrodes d’aspiration aux nerfs crâniens à répondre de manière cohérente ; et 3) le placement de la tête dans le cardan d’étalonnage adéquat des rotations de le œil.

Dépannage :

La dissection peut être difficile, mais après avoir fin.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tortues à oreilles rouges	Kons Scientific	Trachemys scripta elegans	Grande taille (longueur de la carapace 15-20 cm)
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S5886
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	P5405
Choure de magnésium	Sigma-Aldrich Co., LLC.	M7304
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S5761
Dextrose	Sigma-Aldrich Co. LLC.	C5767
Acide chlorhydrique concentré	Sigma-Aldrich Co., LLC.	H7020
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	C7902
pH-mètre	Oakton	pH 6+
Électrode de stimulation par aspiration	A-M Systems	573000	Électrode d’aspiration bipolaire. Notez que 573000 a été remplacé par 573050.
Verre capillaire	A-M systems	626000	Verre capillaire borosilicaté à barillet unique sans microfilament, longueur 10 cm, diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,50 mm
Électrode de stimulation par aspiration alternative	A-M Systems	573050	Électrode d’aspiration bipolaire. Nécessite un verre capillaire de plus grand diamètre : 627000, diamètre extérieur 1,2 mm, diamètre intérieur 0,68 mm
Stéréoscope	Lieca	GZ7	Plage de grossissement, 10x &ndash ; 70x
Source lumineuse à fibre optique	Amscope	HL250-A	150W Microscope à fibre optique illuminateur caisson lumineux
Rongeurs	Carolina Biological Supply Company	625654	en acier inoxydable, ressort droit, 5,25"
Sonde de dissection émoussée	Carolina Biological Supply Company	627405	sonde du centre commercial Huber, sonde à double extrémité et chercheur,
microscission	Carolina Biological Supply Company	623555	ciseaux de microdissection Iris, acier inoxydable, lames de 0,5 », pince fine de 4,75 » de long
	Sigma-Aldrich Co. LLC.	F6521	Pince de bijoutier, dumont n° 5, alliage d’inox, 4,25 "
Pince incurvée	Sigma-Aldrich Co. LLC.	Z168696	Pointe moyenne, pince incurvée, acier inoxydable,
manche de scalpel	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S2896	Manches de scalpel, n° 3, acier inoxydable
Lame de scalpel	Sigma-Aldrich Co. LLC.	S2771	Lames de scalpel, n° 11, acier
Guillotine	Harvard Apparatus	73-1918	Guillotine Kleine type 7575
Spatula	Sigma	Z648299	Micro cuillère et spatule set de pesée. Utiliser une petite spatule : 5,9" long x 0,07 po Diamètre de la poignée avec extrémité carrée : 0,17" x 1,3 po Long, autre extrémité ronde : 0,17 po x 1,27 po
Long Hook	Autozone	98069	SureBilt hook and pick set. Utilisez le broyeur pour émousser les pointes pointues de l’hameçon afin d’éviter de blesser la bouche des animaux.
95/5 % O2/CO2	Airgas, Inc.	X02OX95C2003102	5 % de dioxyde de carbone équilibre oxygène certifié mélange gazeux standard, bouteille de taille 200, CGA-296
Régulateur	Airgas, Inc.	Y11244D296-AG	Régulateur de cylindre analytique mono-étagé en laiton 0-100 psi CGA-296 avec sortie d’aiguille. Utilisez une valve de tuyau d’air réglable en laiton pour passer de 3/8 », de diamètre intérieur, un tube d’air en vinyle connecté au régulateur à un diamètre intérieur de 3/16 », un raccord d’air allant à une pipette en pierre à air ou en verre pasteur
Valve de tuyau d’air réglable	Doctors Foster and Smith	CD-12061	Valve en laiton
Table rigide	Inconnu	Inconnu Porte	autoclave posée sur une table solide. Neuf balles de tennis de 5 po de diamètre isolent les vibrations de la surface supérieure de la table.
Balle de tennis 5"	Petco Animal Supplies, Inc.	712868	balle de tennis Petco Jumbo Pet : les balles sont découpées et maintenues dans un cadre intégré sur la partie inférieure de la porte de l’autoclave.
Table alternative d’isolation des vibrations	Newport Corporation	INT1-36-6-N	Système rigide de contrôle des vibrations, intégrité 1 : Dimensions de surface, 3' x 6'Gimbal
	ISI, International Scientific Instruments, Inc.	Platine de SUPER III-A Scanning EM	Platine eucentrique à 5 axes : mouvements linéaires X, Y et Z, ± ; Précision de 20 mm, 0,1 mm ; Rotations, verticales, ± ; 10° ;, et horizontal, ± ; 12,5 ° ° ° , avec 1,25 ° ° précision. Remarque : de l’instrument de mise hors service.
Mandrin pour cardan	Inconnu	Le	mandrin d’un vieux microtome de fabrication inconnue a été usiné pour s’adapter à l’arbre du porte-échantillon de l’étage de balayage EM
cardan alternatif	ThorLabs, Inc.	GN2/M avec MBT602/M	Goniomètre à deux axes (GN2/M) monté sur une platine à 3 axes avec ajusteurs à vis moletées (MBT602/M) : concevoir un mandrin pour maintenir la tête de tortue avec l’œil à 12,7 mm au-dessus de la surface supérieure du goniomètre (distance au point de rotation)
Système de suivi oculaire basé sur la vidéo	Arrington Research, Inc.	ViewPoint EyeTracker, PC-60	Méthode de suivi : Vidéo infrarouge par pupille sombre ; Appareil photo noir et blanc (article BC02) : 30 Hz, 640 x 480 ; Configuration requise : Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10 ; Portée visuelle : Horizontale +/- 44° ;; vertical +/- 20° ;; Précision ~0.5° ;; Résolution spatiale ~0.15° ;; Résolution de la taille de la pupille ~0,03 mm ; Données oculaires : X, Y, position du regard, hauteur et largeur de la pupille, torsion, temps delta, temps total et régions d’intérêt (ROI) ; Communication en temps réel (article 0022) : sortie analogique à 4 canaux avec huit canaux d’entrée TTL pour marquer les codes dans le fichier
de données Base magnétique multiposition	Harbor Freight Tools	Pittsburg, article #5645	Le support magnétique atteint jusqu’à 12" et produit 45 lb de traction magnétique. Permet de positionner la caméra. Usinez des trous de vissez à l’extrémité de la tige pour monter les caméras.
Micromanipulateur	Kopf	900	Manipulation 5 axes pour le montage de l’électrode d’aspiration : X, Y, Z course linéaire, 2 axes de rotation Lunette de
dissection sur rampe	Lieca	GZ6	Plage de grossissement, 6,7x &ndash ; 40x
Stimulateur nerveux/musculaire	Astro-Med Grass Telefactor	Grass S88	Stimulateur de tension à double impulsion : deux canaux de sortie qui peuvent être exploités indépendamment ou synchronisés pour générer des impulsions à tension constante non isolées (10 mv à 150 V). Les impulsions peuvent être uniques (10 &mu ; s à 10 sec), répétitifs (0,01 Hz à 1 KHz) et trains (1 ms à 10 s) et synchronisés avec les entrées et sorties TTL. Envoyez des sorties TTL via les canaux de sortie d’un connecteur DB25 vers les canaux d’entrée TTL du ViewPoint EyeTracker. Remarque : Astro-Med Grass Telefactor n’est plus en affaires.
Dispositif d’isolation de courant	Astro-Med Grass Telefactor	PSIU6	Unité d’isolation de stimulus de courant : permet de fournir en toute sécurité des courants constants par le S88 à la préparation. Le PSIU6 se connecte par un câble BNC à l’un des canaux de sortie du S88. Les commutateurs multiplicateurs sur le PSIU6 permettent au S88 de générer un large éventail d’amplitudes de courant allant de 0,1 à micro ; A à 15 mA.
Stimulateur nerf/musculaire alternatif avec isolation	A-M Systems	2100	Stimulateur d’impulsions isolé : L’unité dispose d’un isolateur intégré pour produire des courants constants.

ciseaux de 6 » 4" .