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Article de méthode

Cinématique oculaire mesurée In Vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue

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DOI :

10.3791/56864

⸱

2 juin 2018

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1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment utiliser une in vitro isolé tortue préparation tête pour mesurer la cinématique des mouvements de leurs yeux. Après l’ablation du cerveau de la boîte crânienne, nerfs crâniens peut être stimulées par des courants de quantifier les rotations de le œil et les changements dans la taille de la pupille.

Résumé

Après que les animaux est euthanasiés, leurs tissus commencent à mourir. Tortues d’offrir un avantage en raison d’une plus longue durée de survie de leurs tissus, surtout comparé aux vertébrés à sang chaud. Pour cette raison, des expériences in vitro chez les tortues peuvent être effectuées pour des périodes prolongées de temps pour étudier les signaux neurones et le contrôle de leurs actions de la cible. En utilisant une préparation de tête isolée, nous avons mesuré la cinématique des mouvements oculaires chez les tortues, et leur modulation par des signaux électriques portés par les nerfs crâniens. Après que le cerveau a été supprimé sur le crâne, laissant les nerfs crâniens intact, la tête disséquée a été placée dans un cardan pour calibrer les mouvements des yeux. Électrodes de verre étaient attachés aux nerfs crâniens (oculomoteur, trochléen et abducens) et stimulés par des courants d’évoquer les mouvements des yeux. Nous avons suivi les mouvements des yeux avec une vidéo infrarouge suivi système et quantifiées rotations des yeux. Les impulsions de courant avec une gamme des amplitudes, des fréquences, et durées de train ont été utilisées pour observer les effets sur les réponses. Parce que la préparation est séparée par le cerveau, la voie efférente va cibles musculaires peut être examinée isolément pour étudier la signalisation neuronale en l’absence d’informations sensorielles centralement traitées.

Introduction

Justification de l’utilisation des tortues à oreilles rouges dans des expériences électrophysiologiques :

Tortues à oreilles rouges (Trachemys scripta elegans), sont considérés comme un des pires d’espèces envahissantes du monde1 et peut indiquer qu’un écosystème est en difficulté. Pourquoi les tortues à oreilles rouges sont parvenus est mal comprise, mais elle peut être en partie en raison de leur physiologie tolérante et la possession des tissus nerveux qui peut survivre dans des conditions hypoxiques2,3,4 . Leur utilisation pour l’expérimentation ne menace pas leurs numéros et avec des efforts minimes, préparations électrophysiologiques peuvent demeurer viables sur longues durées, tant que 18 heures5,6. L’avantage est semblable à l’avantage d’utiliser des animaux invertébrés tels que les écrevisses7, qui ont également la capacité de résister à faibles niveaux d’oxygène8.

Techniques de mesure des mouvements oculaires :

Approches pour mesurer les mouvements des yeux chez les animaux aux yeux frontal à l’aide de primates non humains ont été bien développé9. Le œil tourne en orbite autour de trois axes : horizontal, vertical et de torsion. La méthode de bobine magnétique de recherche est généralement considérée comme la plus fiable pour la mesure des rotations, mais est envahissante, exigeant des petites bobines pour être inséré dans les scleras des animaux10,11. Systèmes vidéo peuvent également mesurer des rotations et ont l’avantage d’être non invasive. Le développement de meilleures caméras ainsi que de traitement d’image innovants ont amélioré leurs fonctionnalités rendant les systèmes axés sur la vidéo une alternative intéressante à envisager le12,13,14.

Les techniques développées pour mesurer les mouvements des yeux en nonmammals ont été beaucoup moins importants. Mesures sont soit basse résolution ou décrivent quelques-unes des rotations15,16,17,18. Le manque de développement peut être partiellement attribué à la difficulté de nonmammals de formation pour suivre des cibles visuelles. Bien que les mouvements oculaires ont été bien documentés dans les oreilles rouges tortues19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, en raison de la contestation chez les animaux de la formation de suivre les objectifs, la cinématique précise de leurs mouvements oculaires est mal compris.

Tortues à oreilles rouges sont généralement considérés comme vertébrés aux yeux latéraux, mais parce qu’ils peuvent rentrer complètement leurs têtes dans leur coquille31, occlusion significative des champs visual latéraux de la carapace produit32. Le résultat est que leur ligne de mire visuelle est forcé vers l’avant, ce qui les rend se comportent plus comme des mammifères aux yeux frontal. Par conséquent, leur utilisation comme un modèle pour l’élaboration d’approches pour mesurer les mouvements des yeux offre également un point de vue évolutif unique.

Le protocole décrit dans cet ouvrage utilise une préparation in vitro isolés tête pour identifier la cinématique des mouvements oculaires dans les tortues à oreilles rouges. Cerveau est disséqués de crânes laissant les nerfs crâniens intact. Chefs sont placées dans un cardan pour calibrer les mouvements oculaires et évoquent des réponses par stimulation électrique des nerfs crâniens innervant les muscles oculaires. Des rotations par les yeux, les mesures sont faites par un système vidéo, en utilisant des algorithmes logiciels, qui trace la pupille sombre et les marquages de l’iris. L’établissement offre la possibilité de mesurer la cinématique des deux extra-oculaires (c'est-à-direles rotations horizontales, verticales et torsion)32 et intraoculaires (c.-à-d., variations de la pupille)33 mouvements.

Système de modèle pour l’analyse des voies nerveuses efférentes :

Plus généralement, l’approche offre la possibilité d’étudier les signaux neuronaux efférents comment générer des mouvements oculaires lorsque les muscles commencent leurs États détendue et en l’absence d’information sensorielle intégré traitée par le cerveau32, les enquêteurs 33. Par conséquent, la cinématique de le œil peut être examinée dans un système de modèle dans lequel elles sont traitées uniquement par la voie neuronale efférente, laissant le cerveau et synapsing sur les muscles.

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Protocole

Remarque : Les tortues tortue à oreilles rouges, hommes et femmes, ont été achetés auprès d’un fournisseur. Les tortues étaient logés dans une suite d’animaux chaude contenant deux cuves de 60 gallons équipés d’îles de brique pour bronzer sous des lampes infrarouges 250 W. L’environnement était entretenu selon un cycle lumière/obscurité de 14/10-h avec la température de l’eau à 22 ° C. Lumières ont été allumés à 06:00 et éteint à 20:00. Les réservoirs équipés de systèmes de filtrage ont été nettoyés toutes les semaines, et tortues ont été nourris ad libitum tous les deux jours. Les soins des oreilles rouges des tortues et tous les suivants procédures expérimentales décrites ici32,33 ont été approuvées par l’animalerie institutionnelle et utilisation Comité (IACUC) au Collège Lafayette.

1. installation de l’équipement

  1. Préparer une solution de Ringer tortue. Ajoutez le code suivant à l’eau distillée dans l’ordre suivant : chlorure de sodium 96,5 mM (58.44 g/mol), chlorure de potassium 2,6 mM (74,56 g/mol), le chlorure de magnésium 2,0 mM (203.31 g/mol), bicarbonate de sodium 31,5 mM (84,01 g/mol), dextrose 20,0 mM (180.16 g/mol), concentré l’acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 7.51 et chlorure de calcium (110.98 g/mol) 4. 0 mM (voir Table des matières). Mélanger la solution lors de l’ajout de chaque sel.
    ATTENTION : HCl concentré est dangereux (risques de peau, des yeux, inhalation et ingestion).
  2. Faire des trucs pour les électrodes d’aspiration de 5 cm de longueur capillaire en verre (voir Table des matières), par le feu-polissage aux différentes tailles de diamètres intérieurs afin de tenir compte des nerfs crâniens d’épaisseur variable.
    1. Utilisez un petit fichier à graver une ligne à travers un morceau de verre capillaire. Placez en papier de soie et briser en deux.
    2. Rouler lentement une des extrémités du verre capillaire dans la flamme d’un bec Bunsen. Vérifiez périodiquement si la pointe pour la taille, la finesse et symétrie à l’aide d’une dissection étendue et une lumière à fibre optique source (voir la Table des matières).
      Remarque : Pour les tortues avec des largeurs de tête entre 20 et 30 mm, diamètre intérieur d’ajustement optimal tailles typiquement varient de 0,4 à 0,8 mm pour le nerf oculomoteur (nIII), 0,3 à 0,6 mm pour le nerf trochléaire (nIV) et 0,2 à 0,4 mm pour le nerf abducens (INB).
  3. Nettoyez et organisez des pinces-gouges, une sonde de dissection non tranchante, microciseaux, fine pince, pince courbée et un manche de bistouri Swann-Morton avec lames (reportez-vous à la Table des matières) pour la dissection.
    Remarque : La stérilisation des instruments est facultative.

2. anesthésie et l’euthanasie

  1. Place la tortue dans une glace seau pendant 60 min à cryoanesthetize il.
  2. Euthanasier la tortue par décapitation à l’aide d’une petite guillotine animale (voir la Table des matières).
    1. Dégager doucement les mâchoires de l’animale ouverte avec une petite spatule de pesage, afin qu’un crochet peut être inséré et se tourna pour se glisser sous la pointe de la mâchoire supérieure.
    2. Tirer avec une pression constante pour étendre la tête de l’animal par l’intermédiaire de la guillotine. Rapidement décapiter l’animal.
  3. Placez la tête de tortue dans un plat de dissection. Avoir assez tortue de Ringer pour irriguer les tissus. Oxygenize la solution avec 95/5 O2/co2 (voir la Table des matières).
  4. Maintenir le tissu à 4 ° C en plaçant la glace autour de l’extérieur du plat.

3. dissection

  1. Utilisent l’étendue de la dissection avec une source de lumière de fibre optique pour réaliser la dissection.
  2. Enlever la mâchoire inférieure. Placez une sonde dissection émoussée par la bouche afin de fournir une gestion plus facile de la tête. Couper l’articulation rejoignant l’OS dentaire au crâne avec un scalpel. Pinces-gouges permet de tirer sur la mâchoire inférieure du crâne. Pinces-gouges permet de retirer la peau et les muscles de leurs pièces jointes dans les régions dorsales et latérales du crâne.
  3. Supprimer la colonne vertébrale.
    1. Identifiez la colonne vertébrale à l’extrémité caudale du crâne. Courbure de la colonne vertébrale sur le ventre pour exposer la moelle épinière. Microciseaux permet de couper la moelle épinière. Pinces-gouges permet d’enlever la colonne vertébrale et autres tissus du crâne en tirant en direction caudale.
  4. Retirer le cerveau de la boîte crânienne après avoir coupé les nerfs crâniens.
    1. À partir de l’occipital, utiliser pinces-gouges pour couper deux incisions sur le crâne de dorsal. Faire des coupes superficielles pour éviter d’endommager le cerveau sous.
    2. Pinces-gouges permet de retirer soigneusement le crâne dorsal. Utilisez microcisseaux pour supprimer la meninx pour exposer le reste du cerveau. Retirez suffisamment meninx jusqu'à ce que les bulbes olfactifs, dans la cavité crânienne antérieure, peuvent être identifiés (voir la Figure 1 a). Continuer à irriguer le cerveau avec une solution de Ringer de tortue, si nécessaire.
    3. Pince courbée permet de tirer le cerveau direction caudale délicatement et de produire une tension légère sur les nerfs crâniens. Soigneusement couper et enlever les bulbes olfactifs et le cerveau avec une pince courbe.
    4. Utilisez microciseaux pour pousser doucement le mésencéphale vers la ligne médiane pour exposer les nerfs crâniens ; nIII, environ 0,6 mm, peut être vu en face de la SEG, et le diamètre du nIV sera légèrement inférieure à nIII. Couper nIII et nIV, où qu’ils attachent au mésencéphale (voir Figure 1 b). Répétez cette opération sur l’autre côté.
    5. Couper le nerf optique gauche et droit (nII) avec microciseaux. Puis inclinez le tronc cérébral d’un côté. Observer l’INB émergeant de la surface ventrale près du confluent de la protubérance et le bulbe rachidien (voir Figure 1) ; le diamètre de nVI est petit et environ 0,3 mm. couper aussi bien l’INB gauche et droite.
    6. Supprimer les parties restantes du tronc cérébral de la tortue avec microciseaux et pinces fines. Une fois le crâne vide, examiner le plancher de la cavité crânienne. Identifier les INB nIII et nIV.
  5. Supprimer les paupières supérieures et inférieures avec pince fine et microciseaux.

4. étalonnage des mouvements oculaires

  1. Utiliser une table rigide (voir Table des matières) pour appuyer la mise en place d’autres instruments et le cardan. Placez la tête de tortue dans le mandrin de cardan afin que la surface dorsale de la tête est parallèle à l’horizon en utilisant un niveau à bulle petit au repos à travers le crâne. À peu près un des yeux positionner au centre de rotations horizontale et verticale de la cardan.
  2. Placer la caméra infrarouge, munie d’une lumière infrarouge diode électroluminescente (del), qui fait partie de le œil sur vidéo, système de suivi (voir Table des matières), à une distance d’environ 12 cm de le œil de la tortue.
    1. Angle 45 degrés au-dessus de la ligne de mire de le œil de la caméra. La LED doit être à la position de 11:00 en regardant la caméra. Centrez la LED sur l’axe optique de le œil. La caméra sera légèrement hors axe (tel que vu par le dessus de le œil).
    2. Ajuster la distance de la caméra de l’oeil pour que la vue caméra est remplie au maximum par le globe oculaire. Veiller à ce que les coins des yeux (canthi) sont sur les bords de l’affichage horizontal.
  3. Connectez la caméra à le œil sur vidéo, système pour traiter les données de suivi. Diviser le signal à un graveur de DVD pour capturer la vidéo brute. Concentrer la caméra pour obtenir une image claire de le œil. Faites attention à l’amende-position de le œil au centre de la vue de la caméra en utilisant les trois degrés de l’ajustement linéaire (x, y, z) fourni avec le cardan.
  4. Détecter la pupille sombre en définissant le seuil et le contraste de façon appropriée en utilisant le programme fourni avec l’oeil sur vidéo, système de suivi.
    1. À l’aide de la souris, cliquez sur le menu « Vidéo » et sous « Mode » sélectionnez « Haute précision » pour capturer des images à une fréquence d’échantillonnage de 30 Hz (résolution de 640 pixels x 480 lignes). Également rubrique « Vidéo », sélectionnez « Dark élève » pour « Élève Type » et « Ellipse (rotation ellipse) » pour la « Méthode de Segmentation élève ».
    2. Dans la fenêtre « EyeCamera », cliquez sur l’icône « Élève recherche zone réglage » (petit rectangle vertical avec un point au centre). Utilisez la souris pour traîner un rectangle qui limite une zone autour de la pupille. Éviter les zones sombres qui pourraient être confondus avec l’élève.
    3. Dans la fenêtre « Commandes », confirment que les cases correspondantes pour « Image Auto » et « seuil autoverrouillage suivi » sont cochées. Cliquez sur « Auto-seuil » à optimiser la densité de la numérisation, qui montrera que les points verts sur la pupille sombre.
  5. Calibrer l’écran vidéo de l’oeil sur vidéo, programme de suivi pour les rotations de la cardan 12,5 ° (+/-) autour de son axe horizontal et 10 ° (+/-) autour de son axe vertical.
    1. Dans la fenêtre « Commandes », cliquez sur « Affichage ». Cochez les cases « Regard » et « Stim » pour « Point de Gaze », « Région de Calib » et « Grille de géométrie ». Après avoir vérifié les cases qui figurent sous « Grille de géométrie », une fenêtre pop-up et dire, « la géométrie d’écran de stimulation doit être mesurée avant de pouvoir afficher la grille de la géométrie. Vous souhaitez le faire maintenant ? » Sélectionnez « Y » pour yes.
    2. À l’aide de la souris, cliquez sur le menu « Fenêtres » et sélectionnez « Stimulus ». La fenêtre « Stimulus » ouvrira montrant un franchissement de la ligne horizontale et verticale au centre de l’écran. Mesurer les longueurs des lignes au mm le plus proche. Appuyez sur « Echap » du clavier pour fermer la fenêtre « Stimulus ».
    3. À l’aide de la souris, cliquez sur le menu « Stimulation » et sélectionnez « Configuration de géométrie ». Les longueurs des lignes qui ont été mesurées à l’entrée. Ajuster la distance de visualisation afin que la degrés/ligne égale à 25 ° pour la ligne horizontale et 20 ° pour la ligne verticale. Cliquez sur le bouton « Store » et fermez la fenêtre.
    4. Dans la fenêtre « EyeSpace », sélectionnez le nombre de calibration « Point de données » à « 9 ». Avec les yeux de la tortue positionné au centre, cliquez sur le centre de données, point et cliquez sur le bouton « Re-présenter ».
      Remarque : La fenêtre « Stimulus » s’ouvre et « Get Ready » apparaîtra au centre de l’écran. Une boîte apparaît à l’emplacement central et puis disparaissent. Sur sa disparition, on fermera la fenêtre « Stimulus ». La position centrale devrait maintenant être étalonnée.
    5. Répétez l’opération en tournant le cardan droite/gauche, +12,5 ° /-12,50 ° et haut/bas + 10 ° /-10 ° à étalonner les autres points de données.
  6. Pour calibrer la rotation torsion, utilisez le modèle raccord algorithme fourni avec le œil axée sur la vidéo, programme de suivi. L’algorithme définit une position zéro basée sur les marques de l’iris et calcule l’angle de rotation lorsque les repères deviennent décalage entre le centroïde de la pupille.
    1. En utilisant le pointeur de la souris, cliquez sur le menu « Fenêtres » et sélectionnez « Torsion ». Cliquez sur le bouton « Démarrer » dans la fenêtre « Torsion ». Dans la fenêtre « EyeCamera », un arc s’affiche sur l’image de le œil.
    2. Réglez le rayon, l’angle et la longueur de l’arc en utilisant les curseurs à un endroit où les inscriptions irrégulières sont présentes dans l’iris. Cochez les cases « Graphiques en temps réel » et « Auto-Set après ajustement ». Si nécessaire, ajuster la luminosité et de contraste dans la fenêtre de commandes et la re-seuil la pupille sombre (voir étape 4). Cliquez sur le bouton « Définir le modèle ».
  7. Placez une règle dans le plan focal de l’élève et enregistrer la largeur de la vue caméra full. La valeur est utilisée ultérieurement pour déterminer la largeur réelle de l’élève.

5. positionnement des électrodes d’aspiration sur le nerf crânien pour évoquer les mouvements oculaires

  1. Placer soigneusement une électrode de référence de broche dans le tissu conjonctif ou muscle restant sur la tête.
  2. Placer l’électrode d’aspiration (voir Table des matières) sur le nerf crânien à l’aide d’un micromanipulateur et dissection étendue monté sur une perche. Une source de lumière de fibre optique permet d’afficher et de guider la mise en place.
    1. Correspondre à la taille d’un nerf à un bout de verre capillaire. Essais et erreurs est nécessaire pour obtenir un meilleur ajustement autour du diamètre d’un nerf (Voir l’étape 1.2 pour les recommandations de taille). Placer l’embout de verre sur l’électrode d’aspiration. Remplir l’électrode d’aspiration avec une solution de Ringer et régler le volume dans la seringue à environ la moitié de sa capacité.
    2. Déplacer délicatement le bout de verre de l’électrode en utilisant le micromanipulateur à un emplacement situé au-dessus de la coupe-fin du nerf sélectionné. Veiller à ce qu’une solution de Ringer remplit le crâne et la pointe est inférieure à sa surface. Si nécessaire, utilisez glaise à modeler pour endiguer les endroits où une solution de Ringer est une fuite hors de la boîte crânienne.
    3. Tirez sur le piston de la seringue.
      Remarque : Le vide entraînera le nerf dans l’extrémité de la pointe capillaire. Un bon ajustement est indiqué par le nerf restant dans la pointe avec peu ou pas vide supplémentaire appliqué.

6. la stimulation des nerfs crâniens et l’analyse des mouvements oculaires

  1. Utiliser un stimulateur de nerf/muscle généraliste avec un dispositif d’isolement actuel (voir Table des matières) pour stimuler le nerf crânien par l’intermédiaire de l’électrode d’aspiration.
    1. Connecter l’électrode d’aspiration pour le dispositif d’isolement actuel à l’aide d’un câble. Connectez le fil de l’électrode de référence de broches pour la connexion à la terre de l’appareil de l’isolement.
    2. Sélectionnez l’onglet Paramètres des courants à l’aide des cadrans et met en marche l’appareil stimulateur et l’isolement. Utilisez une gamme de courants de 1 à 100 µA, avec une fréquence de 10 à 400 que Hz. utilisation 1 - ou 2-ms des impulsions trains durent 100, 500 ou 1 000 ms.
  2. Enregistrer le minutage des stimulations.
    NOTE : Impulsions Transistor-transistor-logique (TTL) sont synchronisées avec les livraisons des courants de stimulateur et de communiquer en temps réel via un câble aux canaux d’entrée de l’oeil sur vidéo, système de suivi. Un module logiciel fourni avec le œil axée sur la vidéo suivi programme contrôles la communication.
    1. Pour visualiser le calendrier des applications actuelles et leur influence sur les mouvements des yeux, cliquez sur le menu « PenPlots ». Sélectionnez « Position de regard de X », « Y contempler la Position », « Torsion » et « Élève Width » de montrer en temps réel des données brutes parcelles pour X et Y des yeux postes, torsion et la largeur de l’élève. Également sélectionner « Secondes & marqueurs » dans le menu « PenPlots » de montrer une parcelle de chronométrage avec les marques de graduation, qui apparaissent à intervalles de 1 s.
      NOTE : Une lettre majuscule « T » paraîtra marque le début de l’impulsion TTL, qui se produisent simultanément à l’application actuelle.
    2. Pour stocker les données de mouvements oculaires, évoquées par les courants, cliquez sur le menu « Fichier » et sélectionnez « Nouveau fichier de données » sous « Données ». Saisir un nom de fichier, puis appuyez sur « Enter ». Enregistrement des données peuvent être suspendues et puis redémarrée à l’aide de la combinaison de touches, les touches « Ctrl » + « p ». Quand une session expérimentale est terminée, sélectionnez « Fichier de données étroite » hors menu « Fichier » sous « Données ».
    3. Afin de garder une trace de type de courants appliqués, cliquez sur le menu « Fenêtres » et sélectionnez « Data Pad ». La fenêtre « Clavier/DataMarker » s’affiche. Cliquez sur une lettre ou un numéro pour identifier les paramètres des stimulations actuelles étant livrées au nerf.
      NOTE : par exemple, « X » pouvait supporter pour 10 µA. en cliquant sur « X » stocke son entrée dans le fichier de données en temps réel pour l’analyse post hoc . Il apparaît également sur le « PenPlot » pour les « Secondes & marqueurs » pour l’observation en cours.
  3. Analyser les données issues du système de traqueur oculaire.
    1. Ouvrez le fichier de données enregistrées, qui est au format texte délimité, dans un programme de feuille de diffusion de choix pour organiser les données et effectuer des analyses statistiques.
      1. Convertir les valeurs de largeur élève stockées dans le fichier à tailles réelles en mm.
      2. Convertir les valeurs de X et Y des yeux postes et torsions aux unités de mesure et utilisent des conventions pour décrire les mouvements des yeux ; par conséquent, les indications positives de rotations : intorsion, altitude et adduction ; et négatifs des directions des rotations : extorsion, la dépression et l’enlèvement.
    2. Copiez les informations d’en-tête sur une nouvelle feuille de calcul. Ceci inclura les valeurs pour la taille de l’écran (largeur et hauteur) et la distance de visualisation. Huit colonnes de données recueillies à une fréquence de 30 Hz suivra sous les informations d’en-tête.
    3. Revenir à la feuille de calcul contenant les données brutes. Faire une « trouvaille » pour « X » dans la dernière colonne intitulée « Marqueur » pour localiser où la stimulation a été appliquée avec 10 µA. incidence de trouver des « T », marquant le début de la stimulation actuelle. Copier les 15 lignes (0,5 s) de données survenant avant le « T » et 90 images après « T » (3.0 s) ; soitau total 3,5 s. Collez les données dans la nouvelle feuille de calcul ci-dessous les informations d’en-tête.
    4. Insérer une colonne vide après « PupilWidth ». Dans la colonne vide, convertir la dimension calibrée en mm :
      Diamètre de la pupille horizontale = « PupilWidth » × la dimension de la largeur de vue caméra
    5. Insérer 2 colonnes vides une fois « X_Gaze » et « Y_Gaze ». Normaliser les postes aux dimensions de l’écran de visualisation : coordonnées (0, 0), en haut à gauche de l’écran, s’étendant à (1, 1) en bas à droite. Dans la première colonne vierge, traduire à un système de coordonnées ayant des positions (0, 0) au centre de l’écran. Inclure la conversion aux dimensions de l’écran en mm :
      X = (largeur × 0,5) – (« X_Gaze » × largeur) ; Y = (0,5 × hauteur) – (« Y_Gaze » × hauteur)
      Remarque : La séquence d’ouverture est pour le œil gauche. La séquence devra être inversé pour le œil droit afin de suivre la convention de la négativité pour l’enlèvement et la positivité pour adduction.
    6. Dans les colonnes de seconde, utilisez fonctions trigonométriques pour convertir en angle (°) de rotation :
      rotation horizontale = arctan (Xà distance /viewing) ; rotation verticale = arctan (Y/viewing distance)
    7. Torsion est déjà indiquée en unités de degrés, mais pour se conformer à la convention de positivité pour intorsion, si la mesure se fait sur le œil gauche, multiplier par -1. Pour le œil droit, aucune multiplication n’est nécessaire. Le programme des codes des aiguilles comme positif.
    8. Tracer le diamètre de la pupille et les rotations en fonction du temps.

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Résultats

La figure 1 illustre les alambics d’images tirées d’une vidéo décrivant la dissection. Images fournissent des endroits typiquement des nerfs avant la Coupe du cerveau.

figure-results-1
Figure 1 : Stills d’images capturées à partir de la vidéo de la dissection pour montrer les emplacements du nerf optique (nII), nerf oculomote...

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Discussion

Étapes essentielles :

Les étapes critiques au sein de ce protocole sont les suivants : 1) la dissection et le soin apporté à maintenir la viabilité des nerfs sectionnées ; 2) la correspondance des tailles par les électrodes d’aspiration aux nerfs crâniens à répondre de manière cohérente ; et 3) le placement de la tête dans le cardan d’étalonnage adéquat des rotations de le œil.

Dépannage :

La dissection peut être difficile, mais après avoir fin...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Mme Paulette McKenna et Lisa Pezzino dans cette étude pour les services de secrétariat et M. Phil Auerbach pour le support technique. Les auteurs remercient également les Drs Michael Ariel et Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) pour nous introduire à la préparation de tête en vitro isolé. Prise en charge de cette collaboration a été financé par le département de biologie (Robert S. Chase Fund), le Comité de la recherche universitaire et du programme de neurosciences au Lafayette College. Enfin, cette oeuvre est dédiée à M. Phil Auerbach, qui est décédé le 28 septembre 2016 ; Il a retiré du service en microscopie électronique à balayage et a reconnu l’utilité de son étape 5 axes pour une utilisation dans le présent protocole. Son amitié et l’ingéniosité nous manquera grandement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tortues à oreilles rougesKons ScientificTrachemys scripta elegansGrande taille (longueur de la carapace 15-20 cm)
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich Co. LLC.S5886
Chlorure de potassiumSigma-Aldrich Co. LLC.P5405
Choure de magnésiumSigma-Aldrich Co., LLC.M7304
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich Co. LLC.S5761
DextroseSigma-Aldrich Co. LLC.C5767
Acide chlorhydrique concentréSigma-Aldrich Co., LLC.H7020
Chlorure de calciumSigma-Aldrich Co. LLC.C7902
pH-mètreOaktonpH 6+
Électrode de stimulation par aspirationA-M Systems573000Électrode d’aspiration bipolaire. Notez que 573000 a été remplacé par 573050.
Verre capillaireA-M systems626000Verre capillaire borosilicaté à barillet unique sans microfilament, longueur 10 cm, diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,50 mm
Électrode de stimulation par aspiration alternativeA-M Systems573050Électrode d’aspiration bipolaire. Nécessite un verre capillaire de plus grand diamètre : 627000, diamètre extérieur 1,2 mm, diamètre intérieur 0,68 mm
StéréoscopeLiecaGZ7Plage de grossissement, 10x &ndash ; 70x
Source lumineuse à fibre optiqueAmscopeHL250-A150W Microscope à fibre optique illuminateur caisson lumineux
RongeursCarolina Biological Supply Company625654en acier inoxydable, ressort droit, 5,25"
Sonde de dissection émousséeCarolina Biological Supply Company627405sonde du centre commercial Huber, sonde à double extrémité et chercheur,
microscissionCarolina Biological Supply Company623555ciseaux de microdissection Iris, acier inoxydable, lames de 0,5 », pince fine de 4,75 » de long
Sigma-Aldrich Co. LLC.F6521Pince de bijoutier, dumont n° 5, alliage d’inox, 4,25 "
Pince incurvéeSigma-Aldrich Co. LLC.Z168696Pointe moyenne, pince incurvée, acier inoxydable,
manche de scalpelSigma-Aldrich Co. LLC.S2896Manches de scalpel, n° 3, acier inoxydable
Lame de scalpelSigma-Aldrich Co. LLC.S2771Lames de scalpel, n° 11, acier
GuillotineHarvard Apparatus73-1918Guillotine Kleine type 7575
SpatulaSigmaZ648299Micro cuillère et spatule set de pesée. Utiliser une petite spatule : 5,9" long x 0,07 po Diamètre de la poignée avec extrémité carrée : 0,17" x 1,3 po Long, autre extrémité ronde : 0,17 po x 1,27 po
Long HookAutozone98069SureBilt hook and pick set. Utilisez le broyeur pour émousser les pointes pointues de l’hameçon afin d’éviter de blesser la bouche des animaux.
95/5 % O2/CO2Airgas, Inc.X02OX95C20031025 % de dioxyde de carbone équilibre oxygène certifié mélange gazeux standard, bouteille de taille 200, CGA-296
RégulateurAirgas, Inc.Y11244D296-AGRégulateur de cylindre analytique mono-étagé en laiton 0-100 psi CGA-296 avec sortie d’aiguille. Utilisez une valve de tuyau d’air réglable en laiton pour passer de 3/8 », de diamètre intérieur, un tube d’air en vinyle connecté au régulateur à un diamètre intérieur de 3/16 », un raccord d’air allant à une pipette en pierre à air ou en verre pasteur
Valve de tuyau d’air réglableDoctors Foster and SmithCD-12061Valve en laiton
Table rigideInconnuInconnu Porteautoclave posée sur une table solide. Neuf balles de tennis de 5 po de diamètre isolent les vibrations de la surface supérieure de la table.
Balle de tennis 5"Petco Animal Supplies, Inc.712868balle de tennis Petco Jumbo Pet : les balles sont découpées et maintenues dans un cadre intégré sur la partie inférieure de la porte de l’autoclave.
Table alternative d’isolation des vibrationsNewport CorporationINT1-36-6-NSystème rigide de contrôle des vibrations, intégrité 1 : Dimensions de surface, 3' x 6'Gimbal
ISI, International Scientific Instruments, Inc.Platine de SUPER III-A Scanning EMPlatine eucentrique à 5 axes : mouvements linéaires X, Y et Z, ± ; Précision de 20 mm, 0,1 mm ; Rotations, verticales, ± ; 10° ;, et horizontal, ± ; 12,5 ° ° ° , avec 1,25 ° ° précision. Remarque : de l’instrument de mise hors service.
Mandrin pour cardanInconnuLemandrin d’un vieux microtome de fabrication inconnue a été usiné pour s’adapter à l’arbre du porte-échantillon de l’étage de balayage EM
cardan alternatifThorLabs, Inc.GN2/M avec MBT602/MGoniomètre à deux axes (GN2/M) monté sur une platine à 3 axes avec ajusteurs à vis moletées (MBT602/M) : concevoir un mandrin pour maintenir la tête de tortue avec l’œil à 12,7 mm au-dessus de la surface supérieure du goniomètre (distance au point de rotation)
Système de suivi oculaire basé sur la vidéoArrington Research, Inc.ViewPoint EyeTracker, PC-60Méthode de suivi : Vidéo infrarouge par pupille sombre ; Appareil photo noir et blanc (article BC02) : 30 Hz, 640 x 480 ; Configuration requise : Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10 ; Portée visuelle : Horizontale +/- 44° ;; vertical +/- 20° ;; Précision ~0.5° ;; Résolution spatiale ~0.15° ;; Résolution de la taille de la pupille ~0,03 mm ; Données oculaires : X, Y, position du regard, hauteur et largeur de la pupille, torsion, temps delta, temps total et régions d’intérêt (ROI) ; Communication en temps réel (article 0022) : sortie analogique à 4 canaux avec huit canaux d’entrée TTL pour marquer les codes dans le fichier
de données Base magnétique multipositionHarbor Freight ToolsPittsburg, article #5645Le support magnétique atteint jusqu’à 12" et produit 45 lb de traction magnétique. Permet de positionner la caméra. Usinez des trous de vissez à l’extrémité de la tige pour monter les caméras.
MicromanipulateurKopf900Manipulation 5 axes pour le montage de l’électrode d’aspiration : X, Y, Z course linéaire, 2 axes de rotation Lunette de
dissection sur rampeLiecaGZ6Plage de grossissement, 6,7x &ndash ; 40x
Stimulateur nerveux/musculaireAstro-Med Grass TelefactorGrass S88Stimulateur de tension à double impulsion : deux canaux de sortie qui peuvent être exploités indépendamment ou synchronisés pour générer des impulsions à tension constante non isolées (10 mv à 150 V). Les impulsions peuvent être uniques (10 &mu ; s à 10 sec), répétitifs (0,01 Hz à 1 KHz) et trains (1 ms à 10 s) et synchronisés avec les entrées et sorties TTL. Envoyez des sorties TTL via les canaux de sortie d’un connecteur DB25 vers les canaux d’entrée TTL du ViewPoint EyeTracker. Remarque : Astro-Med Grass Telefactor n’est plus en affaires.
Dispositif d’isolation de courantAstro-Med Grass TelefactorPSIU6Unité d’isolation de stimulus de courant : permet de fournir en toute sécurité des courants constants par le S88 à la préparation. Le PSIU6 se connecte par un câble BNC à l’un des canaux de sortie du S88. Les commutateurs multiplicateurs sur le PSIU6 permettent au S88 de générer un large éventail d’amplitudes de courant allant de 0,1 à micro ; A à 15 mA.
Stimulateur nerf/musculaire alternatif avec isolationA-M Systems2100Stimulateur d’impulsions isolé : L’unité dispose d’un isolateur intégré pour produire des courants constants.
ciseaux de 6 » 4" .

Références

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