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Article de méthode

Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro

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DOI :

10.3791/56924

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21 mars 2019

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1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

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Résumé

La cardiaque matrice extracellulaire (ECM) est un réseau complexe de molécules qui orchestrent des processus clés dans les tissus et organes tout en supportant un remodelage physiologique tout au long de la vie. Décellularisation normalisée de coeur foetal et adultes permet des études expérimentales comparatives des deux tissus dans un contexte 3D en capturant l’architecture native et propriétés biomécaniques.

Résumé

Les connaissances actuelles de la matrice extracellulaire (ECM)-communication cellulaire se traduit par études grand bidimensionnel (2D) in vitro culture où les composantes d’ECM sont présentés comme un revêtement de surface. Ces systèmes de culture constituent une simplification de la complexité du tissu ECM qui englobe la composition biochimique, structure et propriétés mécaniques. Pour mieux imiter la communication ECM-cellule mise en forme du microenvironnement cardiaque, nous avons développé un protocole qui permet la décellularisation du coeur entier foetale et tissu adulte ventricule gauche des explants simultanément pour des études comparatives. Le protocole combine l’utilisation d’un tampon hypotonique, un détergent de propriétés tensioactif anionique et le traitement de la DNase sans aucune exigence de compétences spécialisées ou de l’équipement. L’application de la stratégie de décellularisation même dans des échantillons de tissus provenant de sujets d’âge différents est une autre approche pour effectuer des études comparatives. Le présent protocole permet l’identification des différences structurelles uniques entre foetales et adultes ECM maille et biologique cellulaires réponses cardiaques. En outre, la présente méthodologie illustre une application plus large étant appliquée avec succès dans d’autres tissus et les espèces avec des ajustements mineurs, comme dans les biopsies intestins humains et les poumons de souris.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau dynamique de molécules qui régulent les processus cellulaires importants, à savoir sort-décision, prolifération et la différenciation de1,2. L’enquête des interactions cellule-ECM a été effectuée principalement dans deux dimensions (2D) dans les cultures in vitro recouvert de composantes d’ECM, qui constituent une simplification des propriétés natives de ECM dans vivo. Décellularisation génère acellulaire bioscaffolds ECM de style 3D qui conservent en grande partie l’architecture extracellulaire et la composition des tissus natifs et organes3,4. En plus de servir d’échafaudages bioactifs pour l’ingénierie tissulaire, decellularise biomatériaux 3D de ECM se présentent comme nouvelles plates-formes pour évaluer la biologie cellulaire-ECM qui répliquent l’environnement in vivo.

Évaluation du rôle différentiel des composants ECM de différents tissus, organes et l’âge profiteront avec l’utilisation de protocoles similaires de générer bioscaffolds native. Dans le coeur, nous avons développé un protocole polyvalent pour décellularisation des échantillons foetales et dérivés adulte, comme approche alternative pour effectuer des études comparatives du microenvironnement de l’orgue. En utilisant cette méthode, nous avons capturé le microenvironnement cardiaque natif et a montré que ECM foetale favorise des rendements plus élevés de repeuplement des cellules cardiaques5. Décellularisation fournie également une identification des résidents différences structurelles entre ECM foetale et adulte au niveau du sous-sol lamina et péricellulaire arrangement de maille de matrice et fibre composition5. Avant ce travail, une comparaison entre des tissus à différents stades ontogéniques utilisant la même approche de décellularisation signale seulement pour les reins de singe rhésus et coeurs rongeurs. En outre, un nombre limité d’études rapport de tissus ou d’organes foetaux décellularisation soi5,6,7. Ceci a été réalisé à l’aide de SDS comme un agent unique décellularisation ; Cependant, les concentrations distinctes de SDS étaient utilisées pour la décellularisation du tissu cardiaque foetale et adultes7,8. SDS est l’un des plus efficaces détergents ioniques pour le dédouanement du matériel cytoplasmique et nucléaire et largement utilisé dans la décellularisation de différents tissus et spécimens9,10. Des solutions contenant des concentrations élevées de SDS et longues périodes d’exposition ont été corrélées avec la dénaturation des protéines, la perte de glycosaminoglycanes (gag) et perturbation des fibrilles de collagène10,11et donc une équilibre entre la suppression de préservation et de la cellule ECM est nécessaire. Pour appliquer la même procédure au tissu cardiaque foetale et adulte, le protocole décrit ci-après est divisé en trois étapes successives : la lyse de la cellule par choc osmotique (tampon hypotonique) ; solubilisation des interactions lipides-protéines, ADN-protéine et protéine-protéine (0,2 % SDS) ; et enlèvement de matière nucléaire (traitement de DNase).

Notre protocole présente plusieurs avantages : J’ai) la possibilité de décellularisation équivalente de l’âge des tissus cardiaques par l’application de la stratégie de décellularisation même ; II) pas d’exigences pour les méthodes spécialisées ou de l’équipement ; III) adaptation prête à d’autres tissus et les espèces qu’elle a été appliquée avec succès avec des modifications mineures dans la biopsie intestinale humaine12 et souris poumon13; et, surtout, iv) peut adresser des propriétés biomécaniques ECM tout en permettant à l’Assemblée des cultures de style 3D organotypique qu’imite mieux les caractéristiques moléculaires du microenvironnement tissus natifs.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par l’i3S Animal Ethics Committee et Direção de Geral Veterinária (DGAV) et le sont conformément à la Directive 2010/63/UE de la Parlement européen.

1. préparation des solutions décellularisation

Remarque : Tous les décellularisation solutions devraient être filtrées à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et conservées pendant un maximum de 3 mois, sauf indication contraire.

  1. Pour PBS 1 x : 8 g de NaCl, 1,01 g Na2HPO4 200 mg de KCl, de mélanger et de 200 mg de KH2PO4 900 ml d’eau désionisée (l’eau distillée). Ajuster le pH de la solution à 7,5 et le volume de la solution finale vers le haut à 1 L. filtre, autoclave et store la solution à température ambiante (RT).
  2. Pour tampon hypotonique (10 mM Tris, EDTA de 0,1 %) : dissoudre 1,21 g de TrisBASE et 1 g d’EDTA dans 900 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH de la solution à 7,8 avec NaOH/HCl et le volume de la solution finale à 1 L. filtre, stériliser à l’autoclave et stocker à température ambiante.
  3. Pour une solution de SDS de 0,2 % (0,2 % SDS, 10 mM Tris) : ajouter 0,6 g de TrisBASE et 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans 400 mL d’eau et remuez à 60 ° C jusqu'à dissolution complète de soluté. Laissez la solution refroidir au pH de la solution RT. Adjust à 7,8 et le volume de la solution finale à 500 mL. Stériliser les solution de filtration.
    Remarque : La solution SDS doit être préparée avant l’utilisation. Solution de filtration ne complète qu’après dissolution du SDS, sinon les particules insolubles SDS vont saturer le filtre, en changeant la concentration finale de SDS et par conséquent touchant l’efficacité décellularisation tissu.
  4. Pour le tampon de lavage hypotonique (10 mM Tris) : mélanger 1,21 g de TrisBASE dans 900 mL de DI de l’eau. Ajuster le pH de la solution à 7,8 et le volume final à 1 L. filtre, stériliser à l’autoclave et stocker à température ambiante.
  5. Pour le traitement de DNase (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase) : dissoudre 2,42 g de TrisBASE et 2 mL de 1 M du MgCl2 dans 900 mL d’eau de DI. Ajuster le pH à 7,8 et le volume de la solution finale à 1 L. filtre et stériliser la solution par autoclave. Stocker la solution à RT. ajouter DNase I (50 U/mL) avant de les utiliser.
  6. Pour la DNase I solution mère : préparer un tampon de DNase contenant 50 % de glycérol, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2et régler un volume de solution finale de 10 mL avec de l’eau distillée. Dans une hotte à flux laminaire, ajoutez la DNase I poudre vers le tampon de la DNase et mélanger doucement jusqu'à dissolution complète. Stériliser solution à travers 0,22 μm. Préparer des aliquotes de 1 mL et conserver à-20 ° C.

2. tissu récolte et cryoconservation

  1. Euthanasier adultes femelles gravides à 18 jours de gestation (E18 foetus) par l’intermédiaire de CO2 asphyxie. Faire une césarienne chez les femelles avec un ciseaux chirurgicaux et recueillir les cornes utérines portant les souris foetales à une boîte de pétri avec du PBS glacée 1 x à l’aide de deux pinces dentelées avec pointes courbées (une pince à chaque extrémité de la corne).
    1. Ouvrez les cornes utérines et le sac amniotique pour isoler les foetus. Transférer les foetus à nouveau pétri avec du PBS glacée 1 x à anesthésier les et décapiter avec un ciseau.
    2. Euthanasier les souris C57BL/6 mâles âgés de 7 à 8 semaines, à l’aide de CO2 asphyxie. Effectuer une incision sur chaque poitrine de souris et de recueillir le cœur.
    3. Brièvement rincer coeurs foetus et adultes avec glace froide 1 x PBS.
  2. Supprimer les oreillettes du coeur adulte à l’aide d’un scalpel. Effectuer une incision sur le ventricule droit et supprimez-la à l’aide de tout droit de petits ciseaux. Exposer la paroi interne du ventricule gauche en enlevant la cloison. Dans une nouvelle boîte de pétri, diviser le mur libre ventriculaire gauche en bandes longitudinales avec 2 mm d’épaisseur et retirer le muscle papillaire à l’aide d’un scalpel et pinces dentelées avec pointes courbées.
    1. D’accise les explants de petits tissus à l’aide d’un scalpel à l’aide d’une grille de 2 x 2 mm (description détaillée complémentaire Figure 15). Brièvement rincer les explants de tissu avec du PBS 1 x.
  3. Ajouter ~ 250 µL de la température de coupe optimale (OCT) composée de tubes de microcentrifuge d’autoclavés 1,5 mL. Transférer les coeurs ensemble foetale et des explants cardiaques adultes aux tubes avec 250 µL de OCT et congelez-les isopentane refroidi à la glace sèche et de conserver à-80 ° C (jusqu'à un maximum de 6 mois).
    Remarque : L’utilisation d’explants de tissu cardiaque cryoconservés pendant plus de 6 mois réduira considérablement l’efficacité de décellularisation, surtout dans les explants de tissu cardiaque adulte.

3. décellularisation tissu

NOTE : Décellularisation de tissu cardiaque est réalisée dans une plaque de culture de tissus de 24 puits auprès d’un échantillon par puits. 1 mL de chaque solution décellularisation est ajouté à chaque puits. Toutes les étapes de décellularisation devraient être effectuées avec agitation à 165 tr/min (shaker incubateur avec un orbital diamètre de 20 mm) et à 25 ° C, sauf indication contraire. Pour plus de détails, veuillez consulter le schéma sur la Figure 1 a. Amphotéricine B (fungizone,par exemple ) et la gentamicine sont fraîchement ajoutés à toutes les solutions de décellularisation avant de l’utiliser à une concentration finale de 2,5 μg/mL et de 0,01 µg/mL, respectivement. Afin de quantifier la quantité d’ADN conservée au sein des tissus decellularise, les besoins de masse échantillon à doser avant de commencer le protocole décellularisation. Le protocole de quantification de l’ADN est plus détaillée dans l’article 5.1.

  1. JOUR 1
    1. Prélèvement d’échantillons de tissus du congélateur à-80 ° C. Laisser les 1,5 mL tubes de microcentrifuge RT jusqu'à OCT devient partiellement fondu. Transférer le bloc de tissu cardiaque de l’OPO encore congelé dans une boîte de pétri avec du PBS 1 x.
    2. Une fois l’OPO fait fondre, mettre le tissu cardiaque sur une nouvelle boîte de pétri avec du PBS 1 x. Échantillons de lavage 1 x PBS et à 60 tr/min avec un shaker pendant 10-15 min. répéter au moins deux fois.
    3. Ajouter 1 mL de tampon hypotonique de travail / puits d’une plaque de culture de tissus de 24 puits stériles. Transfert d’un seul échantillon par puits avec l’aide de pinces.
    4. Déplacer la plaque 24 puits vitroplants avec les échantillons à un agitateur incubateur à 25 ° C et commencer l’incubation de 18 h avec tampon hypotonique.
  2. JOUR 2
    1. Préparer la solution de SDS de 0,2 %, tel que décrit à la section 1.3.
    2. Aspirer le tampon hypotonique et laver les échantillons avec du PBS 1 x pour les temps de 1 h. Répétez 3.
      NOTE : PAUSE POINT : tissu sous décellularisation peut être conservé dans du PBS 1 x à 4 ° C pendant 18 h dans des conditions statiques.
    3. Enlever le PBS 1 x, ajouter 1 mL de solution de SDS fraîchement préparée (point 1.3) chaque puits et incuber les échantillons pendant 24 h.
      NOTE : L’incubation SDS Post (CHECK POINT), s’assurer que les échantillons présentent une apparence translucide ou blanc. À cette étape, SDD traités échantillons sont trempés dans l’ADN, montrant une consistance gélatineuse. Retirez la solution SDS lentement pour éviter l’adhérence d’échantillon de la pipette.
  3. JOUR 3
    1. Laver les échantillons avec le tampon de lavage hypotonique (1 mL / puits) pendant 20 min. Répétez 3 fois.
      NOTE : À cette étape, il est normal d’observer une diminution de la taille de l’échantillon en raison de l’élimination des débris cellulaires. POINT de PAUSE : Tissu sous décellularisation peut être conservé dans le tampon de lavage hypotonique à 4 ° C pendant 18 h dans des conditions statiques.
    2. Ajouter 1 mL de solution de traitement de DNase chaque puits et incuber les échantillons pendant 3 h à 37 ° C.
    3. Aspirer la solution de traitement de la DNase et laver les échantillons avec du PBS 1 x (1 mL / puits) pendant 20 min. Répétez 3 fois. Effectuer un lavage final avec du PBS 1 x (1 mL / puits) du jour au lendemain à RT et secouant à 60 tr/min.
    4. (Check point) Après le traitement de la DNase, veiller à ce que les échantillons decellularise ont perdu la consistance gélatineuse.
      Remarque : Après le traitement de la DNase, enlever et ajouter 1 x PBS doucement puisque les échantillons peuvent être facilement pris au piège et attachés à l’embout de la pipette.

4. évaluation de tissu decellularise cellule enlèvement

  1. Fixer les échantillons dans une plaque de culture de tissus de 24 puits, 1 échantillon par puits, en ajoutant 1 mL de tampon neutre de fraîchement 10 % de formol avec 0,03 % éosine aqueuse pour 2,5 à 3 h à température ambiante.
    Remarque : L’éosine est ajouté au fixateur à tacher le tissu decellularise et pour faciliter la visualisation d’échantillon lors de coupes et de coloration histologique. L’addition de l’eosine que n’interfère avec les colorants histologiques ni avec les techniques d’immunofluorescence. Par ailleurs, la fixation peut être effectuée pendant la nuit à 4 ° C.
  2. Enlever la solution de fixateur et ajouter 1 mL de PBS 1 x à laver l’échantillon.
  3. Encapsuler le bioscaffolds fixe en gel traitement histologie, utiliser un moule de spécimen de vinyle jetables selon les instructions du fabricant.
  4. Retirer le gel de l’histologie avec l’échantillon intégré de la moule et le transfert de Cassettes de traitement/Embedding biopsie avec couvercle.
    NOTE : Une alternative au tissu incorporation en histologie et gel de traitement est de traiter chaque échantillon en deux biopsie éponges avec petits pores. Les échantillons doivent être localisés au centre des éponges de biopsie pour activer la détection. À noter, certains échantillons peuvent être difficiles à localiser à l’aide de cette approche.
  5. Traiter les échantillons pour paraffine incorporation par le biais des incubations successives (30 min par solution) dans la série de concentrations d’alcool (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %), solution d’hydrocarbure aliphatique isoparaffiniques (2 stations de l’incubation) et de la paraffine (incubation 2 les stations) à 56 ° C.
  6. Monter les échantillons dans un bloc de paraffine.
  7. Couper les 3 sections de paraffine μm d’épaisseur sur un microtome et recueillir les sections sur les lames de microscope vitre.
  8. Sections de paraffine sèche durant la nuit à 37 ° C.
    NOTE : Sections de paraffine (PAUSE POINT) sont stockées à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  9. Pour vérifier l’efficacité du protocole, effectuer l’éosine et éosine (H & E) et Trichrome de Masson (MT) de coloration des sections échantillon decellularise et aux sections de tissu non manipulé conformément aux instructions du fabricant.
    Remarque : H & E de taches de coloration cellulaire noyaux bleu/violet, cytoplasme rose/rouge foncé et rose pâle de collagène et MT taches noir de noyaux, de cytoplasme rouge et de collagène et de mucine bleu. Décellularisation efficace est atteint quand une rose clair poreux (H & E, MT) et réseau de couleur bleue (MT) est observé, en l’absence d’une coloration nucléaire.

5. évaluation de l’enlèvement de matière nucléaire tissu decellularise

Remarque : La quantification de la teneur en ADN sur tissu decellularise doit être exécutée en comparaison avec le tissu non manipulé respectif.

  1. Avant décellularisation, peser un tube de microtubes de 1,5 mL sur une échelle numérique de haute précision. Transférer le tissu cardiaque dans le tube, enlever la quantité supplémentaire de PBS 1 x et peser le tube avec les échantillons. Calculer le poids des échantillons :
    Poids de l’échantillon = poids tube avec échantillons – poids vide tube
  2. Decellularize les échantillons tel que décrit à l’étape 3.
  3. Après décellularisation, prélever les tissus decellularise dans un tube de microcentrifuge.
    1. En raison de la faible encombrement et la masse des échantillons cardiaques individuels et des caractéristiques de la trousse, poule decellularise tissus chaque condition d’échantillon (rythme cardiaque fœtal : 5 coeurs entiers ; adultes explants de LV : 15 explants). Effectuez la même procédure avec le tissu non manipulé.
      NOTE : (PAUSE POINT) les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à ce que l’extraction d’ADN et la quantification sont effectuées.
  4. Couper le non manipulé et decellularise tissus petits explants avec l’aide d’un scalpel dans une boîte de Petri propre.
    Remarque : Utiliser un bistouri individuel et la boîte de pétri pour chaque échantillon. Rupture mécanique des échantillons avec un scalpel facilite leur digestion enzymatique postérieure et extraction ultérieure de l’ADN.
  5. Pour l’extraction de l’ADN, utilisez une méthode d’extraction de l’ADN-colonne basée selon les instructions du fabricant.
    1. Recueillez les échantillons mécaniquement dissociés de la boîte de pétri avec le tampon de digestion maître (tampon de la digestion et la protéinase K) selon les instructions du fabricant à l’aide d’un embout large orifice de la pipette.
      NOTE : Lyse tissulaire à la digestion de la protéinase K est plus rapide dans les échantillons de decellularise. Pour traiter les échantillons distincts en même temps, conserver les échantillons lysés sur glace, jusqu'à ce que tous les échantillons sont lysées pour minimiser la dégradation. Lyse complète d’échantillons s’effectue entre 4 à 6 h.
    2. Aller de l’avant avec le protocole selon les instructions du fabricant.
    3. Pour augmenter les rendements de l’ADN extrait d’échantillons de tissus decellularise et non decellularise, éluer l’ADN sur les 25-50 μL et 100 μL de tampon d’élution, respectivement. Recueillir l’ADN éluée et charger la spin-colonne. Incuber pendant 1 min à RT. centrifuger les échantillons selon les instructions du fabricant.
      NOTE : (PAUSE POINT) l’ADN extrait d’échantillons peut être conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  6. Quantifier l’ADN extrait d’échantillons avec un kit de détection fluorescente dsDNA suivant les instructions du fabricant.
  7. Normaliser le contenu en ADN comme nanogrammes d’ADN par milligramme de poids humide de l’échantillon initial (avant décellularisation).

6. cellule decellularized échafaudages ensemencement

Remarque : Toutes les solutions et les réactifs doivent être stériles et l’ensemble de la procédure exécutée dans des conditions stériles.

  1. Préparer 1 x DPBS avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1 % P/S (pénicilline, 100 U.I. ; streptomycine 100 µg/mL).
  2. Enlever la solution de PBS 1 x à la dernière étape de lavage décellularisation (étape 3.3.3) et ajouter 500 μL / puits du 1 x SPD/2,5 μg/mL d’amphotéricine B/1% P/S solution fraîchement préparée. Conserver les échantillons à 4 ° C de 1 à 7 jours.
    Remarque : Le stockage des échantillons à 4 ° C est important de maintenir la stérilité.
  3. Ajouter P/S vers la cellule basale médias (sans FBS et suppléments) à une concentration finale de 1 %.
  4. Aspirer 1 x SPD/2,5 μg/mL de solution B/1% P/S amphotéricine des échantillons decellularise. Ajouter 500 μL / puits de la cellule basale media/1% P/S et laisser les échantillons à équilibrer pendant 1 h à 37 ° C, ou à 4 ° C pendant plus de 1 h.
  5. Fractionner les cellules d’intérêt et de préparer des petites parties aliquotes de cellules à la densité de la cellule souhaitée.
    Remarque : L’ensemencement de tissu decellularise doit être exécuté sous un microscope stéréoscopique et dans des conditions stériles. Milieux de culture cellulaire doit contenir 1 % P/S.
  6. Distribuer 3-4 μL de SPD au centre d’un puits d’une plaque de 96 puits. Utilisez des pinces fines et droites, transférer les échafaudages decellularise à la baisse du SPD, supprimer le SPD supplémentaire par aspiration et s’assurer que l’échantillon n’est pas plié ou froissé. Qu’elle soit sèche sur les bords d’adhérer à la surface du bien.
    NOTE : Échafaudages détachés ont une efficacité moindre semie.
  7. Ajouter des cellules à l’échafaud en pipettant également, la solution unicellulaires lentement contre les bords du puits.
    NOTE : par exemple, cardiomyocytes de rats néonatals sont ensemencées avec une densité de 7 500 cellules/mm2 et souris immortalisée Lin− Sca-1+ cardiaque des cellules progénitrices (iCPCSca-1) à une densité de 60-1 500 cellules/mm2. Ajuster la densité des cellules selon le raisonnement expérimental.
  8. Ajouter SPD dans les puits voisins pour éviter l’évaporation rapide de médias.
  9. 24 heures après l’ensemencement de cellule, si le type de cellule utilisé ont adhéré aux culture de tissus de plaques en polystyrène (EPTC), passez bioscaffolds dans un nouveau puits. Dans le cas contraire, remplacer le moyen pour enlever les cellules non adhérentes.
  10. Changer soigneusement les médias selon les exigences spécifiques du type cellulaire.

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Résultats

L’efficacité de décellularisation devrait être évaluée par le biais de trois techniques principales : observation macroscopique, histologie et quantification de l’ADN. L’aspect macroscopique du traitement post-SDS échantillons agit indirectement sur l’efficacité de l’enlèvement de la cellule. Après incubation de SDS, échantillons doivent apparaître comme translucides à blanchâtre (Figure 1). Foetal (E18) decellularise tissus sont caractérisent par une structu...

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Discussion

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau très dynamique et complex de glycoprotéines fibreuses et adhésifs, composé d’un réservoir de nombreux peptides bioactifs et emprisonné des facteurs de croissance. Comme le modulateur majeur de l’adhésion cellulaire, la dynamique du cytosquelette, motilité/migration, prolifération, différenciation et l’apoptose, ECM régule activement comportement et la fonction cellulaire. Sachant que le comportement cellulaire diffère dans les cultures 2D et 3D, y ont été déployés pour élabo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants à tous les membres du laboratoire de Pinto--Ó pour une discussion critique pertinente. Ce travail a été soutenu par MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) au titre du projet « CARDIOSTEM-ingénierie des tissus cardiaques et thérapies à base de cellules souches pour des applications cardiovasculaires » (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. est récipiendaire d’une bourse de la CFPI [SFRH/BD/88780/2012] et M.J.O. est un camarade de la CFPI (FCT-détective 2012).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
paillasse incubé
Fluorimètre--Équipement disponible
Balance numérique--Équipement disponible
Microscope inversé--Équipement disponible
Incubateur de culture cellulaire-Équipement disponible
Réfrigérateur (4º ; C)--Équipementdisponible
Congélateur profond (-80º ; C)--Équipement disponible
Microtome--Équipementdisponible
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Ciseaux - 2.5mm CuttingEdge Fine Science Tools5000-08Recommandé
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11254-20Recommandé
Pince Dumont 7Outils de science fine11272-30
Ciseaux de dissection recommandés, droits--Outildisponible
Pinces, dentelées, courbes--Outil disponible
Materials
24 plaques de puits, emballées individuellementVWR29442-044-
Plaques à 96 puits, emballées individuellementVWR71000-078-Steriflip-GV
, 0,22µ ; m, PVDF, Millipore radio-stériliséSE1M179M6-Eppendorff
--Matérieldisponible
15 mL Tubes FalconFisher Scientific430791-50
mL Tubes FalconFisher Scientific
430829-Four-Four-Compartment Biopsy Processor/Embedding Cassettes avec couvercleMicroscopie électronique Science70075-B-
Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscopeThermo Fisher Scientific22-037-246-
Cryoconservation des tissus
Shandon Cryomatrix résine d’enrobageThermo Scientific
6769006-2-METHYLBUTANE ANHYDRUS 99+ % (isopentane)Sigma-Aldrich277258-1L-Glace
sèche- --
Décellularisation
NaClBDH Prolabo27810.364-Na
2HPO4Sigma-AldrichS-31264-KH
sub>2PO4Sigma-AldrichP5379-100g-KCl
Sigma-AldrichP8041-1KG-TrisBASE
Sigma-AldrichT6066-500G-Dodécylsulfate
sodiumSigma-AldrichL-4390-MgCl
2MERCK1.05833.1000-DNAse
IAplliChemA3778,0050-Gentamicine
Gibco15710-049-
FungizoneGibco BRL15290-026-Eau
déminéralisée (eau DI)---
Histologie
10 % de formol neutre tamponProlabo361387P-Eosin
Y AQUEOUSSurgipath01592EPeut être remplacée par de l’éosine alcoolique
Richard-Allan Scientific HistoGel Gel de traitement de l’échantillonThermo Fisher ScientificHG-4000-012-Éthanol
alcool éthilique 99,5 % anydrousAga4,006,02,02,00-Eau
déminéralisée (eau DI)---
Clear Rite 3Richard-Allan Scientific6915-Shandon
HistoplastThermo Fisher ScientificRAS.6774006-
forts
PureLink Mini Kit d’ADN génomiqueThermo Fisher Scientific
K182001-Quant-iT PicoGreen  ; Kit d’ADNdbInvitrogenP11496-
Cell culture
DPBSVWR
Solution 100XLabclinicsL0022-100-Fungizone
Gibco BRL15290-026-Milieux
de culture cellulaire de la cellule d’intérêt---
Agitateur de <> Agitateur orbital IKA :3510001 recommandé<de 45000-434-Pénicilline-Streptomycine

Références

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
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Erratum


Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 4/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Mots-clés

D cellularisation du tissu cardiaquetissu cardiaque f talventricule gauche adultetraitement au tampon hypotoniquem thode de d cellularisation au SDSprotocole de traitement la DNasepr paration de fragments de tissuprocessus d inclusion en paraffineanalyse de coupes histologiquesensemencement de matrices cellulaires
Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro
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