Un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome pour définir la Communication médiée par les vésicules extracellulaire entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses

Résumé

Injection directe de vésicules extracellulaires dérivées du cancer (EVs) conduit à la reprogrammation de la moelle osseuse supportant la progression tumorale ; Cependant, les cellules médient cet effet n’est pas claire. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier les interactions de EV médiée par les cellules souches tumeur mésenchymateuse (MSC) in vivo, révélant un rôle crucial pour MSCs EV-éduqués à la métastase.

Résumé

Dans le microenvironnement tumoral, résidents ou recrutés cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent à la progression maligne dans plusieurs types de cancer. Sous l’influence de signaux environnementaux spécifiques, ces cellules souches adultes peuvent libérer des médiateurs paracrines conduisant à la croissance accélérée tumorale et les métastases. Définir la diaphonie entre la tumeur et MSCs est primordiales pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression du cancer et d’identifier de nouvelles cibles d’intervention thérapeutique.

Les cellules cancéreuses produisent des quantités élevées de vésicules extracellulaires (EVs), qui peuvent affecter profondément le comportement des cellules cibles dans le microenvironnement tumoral ou sur des sites éloignés. EVs tumeur joindre biomolécules fonctionnelle, notamment inflammatoires ARN et des protéines (onco), qui peuvent sensibiliser les cellules stromales afin d’améliorer le comportement métastatique des cellules cancéreuses ou de participer à la formation préalable métastatique niche. Dans cet article, nous décrivons le développement d’un modèle de souris cancer précliniques qui permet l’évaluation précise de la diaphonie EV-négociée entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses. Tout d’abord, nous décrivons la purification et la caractérisation de la tumeur-sécrétée SVE et l’évaluation de l’internalisation de l’EV de MSCs. Nous alors de faire usage d’un multiplex immunodosage axée sur la perle pour évaluer l’altération du profil expression de cytokines MSC induite par le cancer du SVE. Enfin, nous illustrer la génération d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome qui récapitule l’interaction de la tumeur-MSC et montrer l’apport des MSCs EV-éduqués à la formation de la croissance et la métastase des tumeurs.

Notre modèle offre la possibilité de définir comment le cancer EVs façonnent un environnement supportant les tumeurs et d’évaluer si le blocus de la EV-mediated communication entre la tumeur et MSCs empêche la progression du cancer.

Introduction

Le microenvironnement tumoral participe activement à la plupart, sinon tous, aspects de la progression de tumorigenèse et cancer du sein, y compris la formation de métastases et le développement de la résistance à la thérapeutique¹. Cela souligne la nécessité pour les modèles de souris de cancer orthotopique préclinique permettant la dissection des interactions tumeur-stroma complexes qui se produisent dans le créneau de la tumeur.

Parmi les nombreux composants cellulaires du microenvironnement tumoral, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent fortement à la progression du cancer dans plusieurs types d....

Protocole

Les tissus adipeux humains pour isoler des cellules souches mésenchymateuses ont été obtenus auprès du service de chirurgie plastique de l’hôpital de Tergooi (Hilversum, Pays-Bas) après l’approbation par le Comité institutionnel d’éthique et consentement éclairé écrits. MSCs adipeuses GFP-positifs ont été obtenus du Department of Medical et chirurgical des Sciences pour enfants et adultes (Université de Modène et Reggio Emilia).

Des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la loi néerlandaise sur l’expérimentation animale, et le protocole a été approuvé par le Comité sur l’expérimentation animale du VU University medical ....

Résultats

Dans cette étude, nous avons exploré la capacité des EVs ostéosarcome-sécrété à éduquer MSCs vers un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro. Nous montrons que les cellules d’ostéosarcome libèrent exosome comme EVs qui sont internalisés par MSCs. Nous avons mesuré la modification du profil de l’expression des cytokines MSC induite par le cancer EVs et évalué l’effet des MSCs EV instruits sur la croissance tumorale et de la formation de métastases. La représentation générale de la c.......

Discussion

Vésicules extracellulaires sécrétée à la tumeur (EVs) peuvent influer sur la physiologie des cellules mésenchymateuses les et éloignés pour générer un environnement propice à la tumeur. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome qui permet la dissection des interactions entre cellules tumorales induite par l’EV et les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) in vivo. Nous montrons que l’injection systémique de tumeur humaine MSCs EV-éduqués dans des souris porteuses de .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipment
Ultra Centrifugeuse	Beckman	Optima L-90K
Rotor SW32Ti	Beckman	369650	Désigné dans le manuscrit sous le nom de rotor à godets ultra-oscillants
Microscope électronique à transmission	Zeiss	EM109	Ou similaire TEM
Appareil photo numérique	Nikon	DMX 1200F	Ou appareil photo similaire
Logiciel d’imagerie TEM  ;	Nikon	ACT-1
Microscope à fluorescence	Zeiss	Imager.D2	Ou similaire Microscope à fluorescence
Logiciel d’imagerie FM	Zeiss	ZEN Blue
Incubateur	Nuaire	4750E
Centrifugeuse	Hettick	ROTANTA 460R-80
Congélateur	Thermo electro corporation	n.a.
FACS	BD	BD FACScalibur	Ou cytomètre en flux similaire
Foret	Ferm	FCT-300	Avec foret de 0,8 mm
Forets micro-torsadés HSS, 0,8 mm	Proxxon	28 852	Foret de 0,8 mm
Caméra IVIS	Xenogen	Ivis Lumina	Désigné dans le manuscrit comme caméra de bioluminescence. Xenogen fait désormais partie du logiciel d’image Perkin Elmer
Living2.60	Xenogen / Igor Por	n.a	Xenogen fait désormais partie de Perkin Elmer
10 µ ; Seringue L	Hamilton	Neuros Modèle 1701 RN
Aiguille : Hamilton RN Aiguille pour seringue, calibre 26, Pointstyle AS, longueur personnalisée 2 cm	Hamilton	n.a.Caliper
	Mitutoyo	G08004463
Autoclave	Astell	n.a.Lampe
chauffante	Philips	n.a.
Milieu de culture
Sérum fœtal bovin	Hyclone	RYG35912
Lysat de plaquettes	n.a.n.a.IMDM
medium	Lonza	BE12-722F
alpha-MEM medium	Lonza	BE02-002F
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
pen/strep/glutamine	GIBCO	10378-016
héparine	LEO	012866-08
Trypsine/EDTA (10x)	GIBCO	15400-054
fortes
adipeux dérivées MSCs	n.a.n.a.MSCs
GFP	n.a.n.a.Fibroblastes
humains	n.a.n.a	.
143B	cellules ATCC	CRL-8303
FLUC-143B cellules	ATCC	CRL-8303	Transduit
Disposables
Flacons de culture 175 cm2	CELLSTAR	660175
Tubes de 50 mL	Greiner bio-one	210261
Tubes de congélation	Thermoscientific	377224
Tubes ultra-clairs	Beckman	344058	Désignés dans le manuscrit sous le nom de tubes ultra-centrifuges
0,22 & micro ; Filtre m	Millex	SLGV033RS
200 mesh Grilles en nickel recouvertes de carbone Formvar	EMS (Electron Microscopy Sciences)
Seringues à insuline de 0,5 mL avec aiguille 29G	Terumo	U-100  ;
Boîte de Pétri	Sigma - Aldrich	P7612
Papier filtre  ;	Thermo fisher Scientific	50363215
Réactifs / kits
paraformaldéhyde	Alfa Aeser	43368.9M
PBS	Braun	220/12257974/110
glutaraldéhyde	EMS (Electron Microscopy Sciences)	16300
uranyl oxalate	EMS (Microscopie électronique Sciences)	22510
acétate d’urany	EMS (Electron Microscopy Sciences)	22400
méthylcellulose	EMS (Electron Microscopy Sciences)	1560
PKH67	Sigma	mini67-1kt	Désigné dans le manuscrit comme GFLD
BSA	Sigma	A8412
CBA - human inflammatory cytokine kit	BD	551811
Formaldéhyde 37 %	VWR	104003100
Lames chirurgicales en acier au carbone	Swann-Morton	206	Désigné dans le manuscrit comme couteau chirurgical
anti-vimentine humaine anticorps	Santa Cruz	sc-6260	Clone V9
Diluant d’anticorps	DAKO	S0809
HRP anti souris IgG anticorps	Technologies	32230
DAB-kit	DAKO	K500711
hématoxylline	Sigma	GHS232
Tampon EDTA	n.a.n.a.Tampon
citrate	n.a.n.a.rabbit
polyclonal anti-GFP	anticorps Abcam	n.a.Ab290
DAPI  ;	Life Technologies	D1306
Paracétamol, 120 mg / 5 ml sirop	Bayer	n.a.Sinaspril	, solution de paracétamol pour enfants
Isoflurane 1000 mg/g	Pharmacie Vumc	n.a.Chlorhydrate
buprénofine, 0,3 mg/ml	Indivior UK Limited	n.a.lidocaine-HCL
2 %	Pharmacie Vumc	n.a.70
% éthanol	VWR	93003.1006
Colle tissulaire	Derma+Flex, cyanoacrylate médical formulé	Vygon	LB604060
Gouttes oculaires : Vidisec Carbogel, 2 mg/ml	Bausch+Lomb	n.a.D-luciférine
, sel de potassium	Biotechnologie d’or	LUCK-1
Lames de verre	Thermo scientific	630-0954
Boucles en acier inoxydable	n.a.n.a	.
Mice experiments
Mice, Hsd :Athymic Nude-Foxn1nu,  ; femelle, 6 semaines à l’arrivée, état bactérien conforme FELASA	ENVIGO	n.a.Maison
intelligente en pâte à papier (enrichissement en cage)	Bio Services	n.a.Alpha-dri
matériau de literie	Shepperd Speciality Papers	n.a.
Nourriture pour souris : Teklad global 18 % protein rongeurs	régime ENVIGO	2918-11416M
Sutures	Ethicon	V926H
Ciseaux	Sigma-Aldrich	S3146-1EA(	ou similaire)
Pince à épiler	Sigma-Aldrich	F4142-1EA	(ou similaire)