Article de méthode

Un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome pour définir la Communication médiée par les vésicules extracellulaire entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses

DOI :

10.3791/56932

⸱

6 mai 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Injection directe de vésicules extracellulaires dérivées du cancer (EVs) conduit à la reprogrammation de la moelle osseuse supportant la progression tumorale ; Cependant, les cellules médient cet effet n’est pas claire. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier les interactions de EV médiée par les cellules souches tumeur mésenchymateuse (MSC) in vivo, révélant un rôle crucial pour MSCs EV-éduqués à la métastase.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le microenvironnement tumoral, résidents ou recrutés cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent à la progression maligne dans plusieurs types de cancer. Sous l’influence de signaux environnementaux spécifiques, ces cellules souches adultes peuvent libérer des médiateurs paracrines conduisant à la croissance accélérée tumorale et les métastases. Définir la diaphonie entre la tumeur et MSCs est primordiales pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression du cancer et d’identifier de nouvelles cibles d’intervention thérapeutique.

Les cellules cancéreuses produisent des quantités élevées de vésicules extracellulaires (EVs), qui peuvent affecter profondément le comportement des cellules cibles dans le microenvironnement tumoral ou sur des sites éloignés. EVs tumeur joindre biomolécules fonctionnelle, notamment inflammatoires ARN et des protéines (onco), qui peuvent sensibiliser les cellules stromales afin d’améliorer le comportement métastatique des cellules cancéreuses ou de participer à la formation préalable métastatique niche. Dans cet article, nous décrivons le développement d’un modèle de souris cancer précliniques qui permet l’évaluation précise de la diaphonie EV-négociée entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses. Tout d’abord, nous décrivons la purification et la caractérisation de la tumeur-sécrétée SVE et l’évaluation de l’internalisation de l’EV de MSCs. Nous alors de faire usage d’un multiplex immunodosage axée sur la perle pour évaluer l’altération du profil expression de cytokines MSC induite par le cancer du SVE. Enfin, nous illustrer la génération d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome qui récapitule l’interaction de la tumeur-MSC et montrer l’apport des MSCs EV-éduqués à la formation de la croissance et la métastase des tumeurs.

Notre modèle offre la possibilité de définir comment le cancer EVs façonnent un environnement supportant les tumeurs et d’évaluer si le blocus de la EV-mediated communication entre la tumeur et MSCs empêche la progression du cancer.

Introduction

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Le microenvironnement tumoral participe activement à la plupart, sinon tous, aspects de la progression de tumorigenèse et cancer du sein, y compris la formation de métastases et le développement de la résistance à la thérapeutique1. Cela souligne la nécessité pour les modèles de souris de cancer orthotopique préclinique permettant la dissection des interactions tumeur-stroma complexes qui se produisent dans le créneau de la tumeur.

Parmi les nombreux composants cellulaires du microenvironnement tumoral, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent fortement à la progression du cancer dans plusieurs types de cancers comme le cancer du sein, cancer de la prostate, tumeurs cérébrales, myélome multiple et ostéosarcome2 ,3,4,5,6,7. MSCs sont les cellules souches multipotentes qui résident dans divers tissus foetus et adultes, y compris la moelle osseuse, tissu adipeux, placenta, sang de cordon ombilical et autres8,9. En réponse aux signaux inflammatoires généré par le cancer, MSCs migrent vers les sites tumoraux, incorporent dans le microenvironnement tumoral et finalement se différencient en cellules de cancer supportant10. Ces MSCs associés à cancer facteurs essentiels (p. ex., les facteurs de croissance, chimiokines, cytokines et médiateurs immunosuppresseurs) prévoient de la progression tumorale agissant sur les cellules tumorales tant sur stroma environnant2, 3 , 11 , 12 , 13. alors que les effets favorisant la tumeur de MSCs associés au cancer ont été étudiés dans nombreux modèles de cancer, les mécanismes par lesquels les cellules tumorales reprogrammer MSCs pour façonner une niche cancer de promotion sont mal compris. Nous décrivons ici la génération d’un modèle de xénogreffes orthotopiques permettant spécifiquement de l’étude de l’interaction pro-tumorigènes entre cellules cancéreuses osseuse et MSCs, par l’intermédiaire de vésicules extracellulaires (EVs).

SVE est des médiateurs essentiels de communication intercellulaire entre la tumeur et les cellules du stroma14. SVE porte des biomolécules fonctionnelles de la cellule d’origine, y compris les protéines, les lipides et réglementation RNAs. Une fois libérés dans l’espace extracellulaire, ces vésicules peuvent être absorbés par les cellules environnantes ou transportées à des sites distants via le sang ou la circulation lymphatique et peuvent influencer profondément le comportement des cellules cibles. 15 , 16 , 17 par exemple, absorption du cancer EVs par les fibroblastes stromales peut entraîner dans la différenciation des myofibroblastes soutenant l’angiogenèse et en accélérant la tumeur croissance in vivo18,19, internalisation par endothéliale les cellules peuvent stimuler l’angiogenèse tumorale et augmenter la perméabilité vasculaire16,20, et interaction avec les cellules immunitaires pourrait conduire à la suppression du système immunitaire antitumorale21.

Nous avons récemment démontré, à l’aide d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome, que les cellules tumorales libèrent des quantités élevées de serveur virtuel Exchange qui invite MSCs pour acquérir un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro. Cet effet est dû à un changement radical dans le profil d’expression de cytokines MSC (dénommé « Enseignement de la SMC ») et peut être prévenu par l’administration d’un anticorps thérapeutique récepteur de l’interleukine-6 (IL-6R) à7. Nos travaux ont montré que le cancer EVs modulateurs cruciales du comportement MSC, fournissant ainsi une justification pour les approches ciblées microenvironnement stopper la progression de l’ostéosarcome. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier la tumeur-MSC EV-mediated interaction in vivo. Ce modèle est destiné à : 1) en particulier définir les altérations du cancer EV du comportement MSC dans le microenvironnement tumoral, 2) évaluer comment cette interaction contribue à la croissance de tumeur osseuse et la formation de métastases et l’étude 3) s’interférant avec la diaphonie induite par l’EV en vivo empêche la progression du cancer.

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Protocole

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Les tissus adipeux humains pour isoler des cellules souches mésenchymateuses ont été obtenus auprès du service de chirurgie plastique de l’hôpital de Tergooi (Hilversum, Pays-Bas) après l’approbation par le Comité institutionnel d’éthique et consentement éclairé écrits. MSCs adipeuses GFP-positifs ont été obtenus du Department of Medical et chirurgical des Sciences pour enfants et adultes (Université de Modène et Reggio Emilia).

Des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la loi néerlandaise sur l’expérimentation animale, et le protocole a été approuvé par le Comité sur l’expérimentation animale du VU University medical center, Amsterdam, Pays-Bas.

1. isolement des vésicules extracellulaires sécrétée à la tumeur.

  1. Préparer le sérum bovin fœtal appauvris en EV (FBS) par centrifugation FBS à 70 000 x g pendant la nuit (16 heures), sans frein, à 4 ° C à l’aide d’un rotor oscillant ultra de seau (attendre 1 h pour la décélération). Recueillir soigneusement le surnageant (FBS appauvris en EV) sans déranger le culot. Filtrer la FBS appauvris en EV avec un filtre de 0,22 µm.
  2. Préparer appauvris en EV de milieu de culture en le complétant Medium (IMDM de Dulbecco modifiée de Iscove) avec 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, glutamine 2 mM (1 x P/S/G) et 5 % FBS appauvris en EV.
  3. 3 x 106 143 b cellules dans des flacons de2 175 cm de graines et leur culture en milieu appauvri en EV de culture dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Lorsque les cellules sont 80 à 90 % anastomosé (typiquement après 36 h à 48 h), recueillir le surnageant de 8 x 175 cm2 flacons (28 mL/flacon) pour EV-isolation.
  4. Avance le surnageant de cellule pour enlever les cellules et les débris cellulaires par centrifugation différentielle (centrifugation le surnageant au tour précédent chaque fois) conformément au protocole suivant :
    1. Centrifuger le surnageant deux fois à 500 x g pendant 10 min.
    2. Centrifuger le surnageant deux fois à 2000 g pendant 15 min.
    3. Centrifuger le surnageant deux fois à 10 000 x g pendant 30 min.
    4. Effectuer toutes les centrifugations à 4 ° C, avec une accélération maximale et les paramètres de vitesse de décélération. Après chaque étape, soigneusement recueillir le surnageant contenant EV, en laissant environ 1 mL. Aller de l’avant immédiatement pour revenir en 1.5 ou magasin la préapprouvés conditionné milieu à-80 ° C jusqu'à l’isolement de l’EV.
  5. Isoler le SVE en centrifugeant préapprouvé milieu conditionné une fois à 70 000 x g pendant 1 h, ralentir le frein, à 4 ° C dans des tubes d’ultracentrifugeuse (volume final 38,5 tube/mL) à l’aide d’un rotor oscillant ultra de seau.
  6. Soigneusement retirer le surnageant, en laissant environ 1 mL derrière, remettre les boulettes contenant EV dans le volume restant, leur piscine tout en un seul tube ultracentrifugeuse et ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’au remplissage complet tube (volume final mL 38,5).
  7. Centrifugeuse, une fois de plus à 70 000 x g pendant 1 h à 4 ° C, sans frein (attendre 1 h pour la décélération). Avec précaution, retirez le surnageant sans déranger le culot et laisser 100-200 µL.
  8. Resuspendre le culot-EV et ajuster le volume final de 200 µL avec du PBS (standardisé pour tous-l’isolement de l’EV). Utilisez la préparation EV immédiatement ou conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation22.
    NOTE : EVs peuvent être conservés jusqu'à 6 mois à-80 ° C.

2. EV caractérisation.

EVs purifiés peuvent être visualisés par transmission electron microscopy (TEM)23.

  1. Mix EV se prépare avec un volume égal de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate.
  2. Manteau 200 mesh Formvar-carbone-enduit des grilles TEM nickel 5 µl de suspension EV pendant 20 min à température ambiante.
  3. Fixer les échantillons EV sur les grilles TEM au glutaraldéhyde 1 % dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0), contraste avec l’oxalate d’uranyle (pH 7,0) et l’incorporer dans un mélange de 4 % d’uranyle acétate et 2 % cellulose méthylique dans un ratio de 1:9 sur la glace.
  4. Retirez les grilles avec des boucles en acier inoxydable et épongez l’excès de liquide avec du papier filtre pour assurer une épaisseur appropriée de la pellicule de cellulose méthylique.
  5. Après séchage, examinez les grilles avec un microscope électronique à transmission et capturer des images avec un appareil photo numérique couplé au logiciel image correspondante.

3. l’éducation de MSCs par EVs dérivées de tumeurs.

  1. Préparer le milieu de culture MSC en complétant un milieu essentiel alpha-minimum (alpha-MEM) avec 4 % appauvris en EV humaine lysat plaquettaire (hPL)24, héparine (10 U/mL) et 1 x P/S/G.
    NOTE : Les hPL appauvris en EV est obtenue suivant la procédure décrite à l’article 1.1.
  2. Graine de 1,4 x 106 dérivés MSCs adipeux par flacon de 75 cm2 et leur culture dans un milieu appauvri en EV MSC-culture dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
  3. Lorsque les cellules atteignent 70 % confluence, ajoutez 143 ter ostéosarcome - ou contrôler les fibroblastes humains (hf)-EVs, 10 µL EV préparation/cm2 du flacon de culture. Incuber pendant 24 heures et ajouter la même quantité d’EVs pour heures supplémentaires. Remarque : Les fibroblastes humains sont cultivées dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) 10 % FBS et EVs sont isolés comme décrit à l’article 1.
  4. Recueillir le surnageant MSC, centrifuger 1 x à x 500 g pendant 5 min à 4 ° C (avec une accélération maximale et les paramètres de vitesse de décélération), transférer dans un nouveau tube et stocker le surnageant défriché à-80 ° C pour permettre l’analyse future cytokine (section 5).
  5. Pour in vivo les expériences (article 6), éduquer GFP-positif MSCs25 tel que décrit dans les sections 3.1 à 3.3, recueillir les cellules et remettre en suspension dans du PBS à une concentration finale de 106 cellules / 100 µL. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à l’injection.

4. EV internalisation dosage.

Pour visualiser l’absorption EV par MSCs, du label EVs avec un colorant fluorescent vert linker (GFLD) (disponible dans le commerce) suivant le protocole du fabricant :

  1. Brièvement, ajouter 180 µL de diluant à la prep de EV 200 µL. Diluer 1 µL de colorant GFLD dans 50 µL de diluant et ajouter 20 µL de colorant dilué à la prep EV diluée.
  2. Doucement de la composition de pipetage et incuber pendant 3 min à température ambiante dans l’obscurité.
  3. Ajouter 5 mL de 0,1 % de BSA dans du PBS, transfert à ultracentrifugeuse tubes et remplir le tube avec du PBS (volume final 38,5 tube/mL).
  4. Centrifuger 1 x à 70 000 x g pendant 1 h à 4 ° C, sans frein (attendre 1 h pour la décélération). Avec précaution, retirez le surnageant et Resuspendre le EV-culot étiqueté dans un volume final de 200 µL (régler le volume avec du PBS).
  5. Ajouter le SVE marqué à la culture MSC ou de les stocker à-80 ° C. Après une nuit d’incubation, évaluer l’internalisation de la vésicule en microscopie par fluorescence et flow cytometry7.

5. évaluation du profil d’Expression de MSC Cytokine.

  1. Pour la quantification multiplexe de l’interleukine-8 (IL-8), interleukin-1β (IL-1β), interleukine-6 (IL-6), interleukine-10 (IL-10), facteur de nécrose tumorale (TNF) et des niveaux de protéine interleukine - 12p 70 (IL - 12p 70) au SMC conditionné support (reportez-vous à l’étape 3.4), utiliser un Tableau de perle commercialisé par cytométrie en flux (CBA) pour des cytokines inflammatoires humains suivant les instructions du fabricant.
  2. En bref, mélangez les perles de l’anticorps conjugué de capture et les ajouter à tous les tubes à essai. Ajouter les dilutions standard de cytokine ou les échantillons conditionnés moyens aux tubes.
  3. Ajouter le réactif de détection et incuber pendant 3 heures à température ambiante.
  4. Laver les billes avec la solution de lavage fourni. Mesurer les échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux et analyser les données selon les instructions du fabricant.

6. génération d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques de l’ostéosarcome.

  1. Autoriser les six semaines, la femelle, Athymic nu-Foxn1nu souris pour s’acclimater pendant au moins une semaine avant de commencer les procédures expérimentales.
  2. Un jour avant l’intervention chirurgicale et comme l’analgésie périopératoire ajouter paracétamol à l’eau potable. Diluer la « solution de paracétamol pour les enfants » (voir Table des matières) avec de l’eau pour obtenir une concentration finale de 2 mg/mL. Basé sur une consommation d’eau moyenne de 150 mL/kg/jour, et un poids corporel moyen de 20 g, cette dose est suffisante pour atteindre une dose de 6 mg/souris/jour (300 mg/kg/jour).
  3. Continuer le traitement analgésique jusqu'à 24 heures après l’opération, ou plus longtemps si les animaux montrent des signes de la douleur.
  4. Le jour de l’intervention chirurgicale, recueillir des cellules cultivées luciférase positifs (Fluc) 143 ter (précédemment générés par transduction LENTIVIRAUX) par centrifugation à 300 x g pendant 10 min et remettre en suspension les cellules à une concentration de 2 x 105 cellules/µL dans du PBS. Maintenir la suspension de cellules sur la glace à 6 heures.
  5. Appareils d’électrochirurgie autoclave. Préparer et nettoyer la zone de travail et placer les pinces et ciseaux stérilisés sur feuilles stériles. Vingt minutes avant l’intervention chirurgicale (étape 6,8), injecter par voie sous-cutanée les animaux avec la buprénorphine (0,05 mg/kg, dilué dans du sérum physiologique à 0,9 %) comme analgésique en utilisant des seringues à insuline 0,5 mL (aiguille de calibre 29).
  6. Juste avant d’anesthésier chaque animal, remplir une seringue de 10 µL au moins 1 µL de la suspension de cellules (Fluc) 143 ter concentrée (voir étape 6.4).
  7. Anesthésier l’animal avec l’anesthésie par inhalation isoflurane (2 à 3 % d’oxygène). Vérifier le niveau de l’anesthésie par orteil-pincer l’animal. Lorsque l’animal ne réagit pas à la pincer, c'est-à-dire, qu'il est profondément anesthésié, appliquer la pommade sur les yeux pour prévenir le dessèchement pendant l’anesthésie.
  8. Placez l’animal sur le dos avec la tête dans un masque d’anesthésie et avec les jambes vers l’opérateur. Fléchir le genou gauche. Essuyer la peau avec l’éthanol à 70 % et appliquez lidocaïne (2 %) avec un bout de coton 3 fois comme analgésique local.
  9. Utiliser un bistouri stérile pour faire une petite incision (environ 5 mm) sur la peau juste au-dessous du genou pour exposer le tibia. Percer un trou d’épingle dans le tibia, environ 2 mm en dessous du genou à l’aide d’un foret hélicoïdal micro de 0,8 mm. Soyez prudent ne pas à percer à travers les deux cortex tibia.
  10. Injecter 1 µL de la suspension cellulaire (environ 2 x 105 cellules) lentement (en 5 secondes environ) dans le trou à l’aide d’une aiguille de calibre 26. Fermer le trou avec une goutte de colle tissu pour empêcher le reflux de la suspension.
  11. Fermer la peau avec des sutures monofilament et une goutte de colle tissu. Laissez le récupérer animaux dans un environnement bien chauffé (utiliser une lampe chauffante). N’abandonnez pas animaux jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Seulement après que les animaux sont pleinement récupérés de l’anesthésie, les retourner à leurs propres cages.
  12. Deux jours après l’inoculation de la tumeur, injecter EV instruits ou naïf GFP-positif MSCs (106 cellules dans 100 µL de PBS, reportez-vous à l’étape 3.5) par voie intraveineuse avec une seringue d’insuline de 0,5 mL dans la veine de la queue des souris.
  13. Suivez la croissance tumorale par bioluminescence imagerie26 deux fois par semaine. À cette fin, injecter la souris i.p. avec 150 µL de D-luciférine (30 mg/mL) avec une seringue à insuline. Dix minutes après l’injection, positionner les animaux dans la bioluminescence système d’imagerie et de mesurer le photon-flux généré par les cellules tumorales.
  14. En outre, mesurer le diamètre de la tumeur osseuse primaire avec un pied à coulisse. Largeur x longueur2 x 0,5 estime le volume de la tumeur (en mm3).
  15. Remarque : Les points limites sont définies comme diamètre de la tumeur > 15 mm ou poids perte > 15 %.

7. évaluation du nombre de nodules pulmonaires

  1. Lorsque l’un des animaux atteigne le point de terminaison sans cruauté définie à l’étape 6.14 (dans environ 3-4 semaines), mettre fin à l’expérience et de recueillir et d’analyser tous les tissus.
  2. 10 min avant l’euthanasie, injecter 150 µL D-luciférine (30 mg/mL) avec une seringue d’insuline de 0,5 mL.
  3. Anesthésier les animaux avec l’anesthésie par inhalation isoflurane (voir étape 6,7). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réactions de la souris à l’orteil-pincement. Euthanasier les souris par dislocation cervicale27.
  4. Recueillir des poumons, foie, rate et les reins à l’aide de pinces et ciseaux stérilisés. Lavez les organes dans du PBS pour enlever des traces de sang et mettez-les sur un plat de Pétri.
  5. Placer la boîte de Pétri avec les organes de la bioluminescence, système d’imagerie. Mesurer le signal de bioluminescence des deux côtés des organes. Immédiatement après la mesure, plonger les organes dans du formol de 4 % pour les fixer (24-72 heures, à la droite) pour des analyses histologiques.
  6. Traiter les images obtenues avec le logiciel d’imagerie approprié par seuillage manuelle. Compter le nombre de nodules pulmonaires sur chaque photo. Compter le nombre total de nodules pulmonaires sur les deux côtés des poumons.

8. histologique analyse

  1. Pour faire une analyse histologique des tissus pulmonaires :
    1. Incorporer les organes fixés au formol à la paraffine et préparer des lames de tissu 6 µm.
    2. Deparaffinate le tissu pulmonaire glisse et effectuer la recherche d’antigène en les faisant bouillir pendant 15 minutes dans un tampon citrate 0,01 M (pH 6).
    3. Incuber les lames horizontalement à température ambiante avec anti-l’homme vimentine anticorps (200 µg/mL) dilué 1 : 150 en anticorps-diluant (disponible dans le commerce), puis avec l’anticorps secondaire, HRP-étiquetée (0,5 mg/mL en dilution 1/500). Tacher les tissus 3'-diaminobenzidine (DAB) et des taches de comptoir de l’hématoxyline.
    4. Observer les lames de tissu teinté à l’aide d’un microscope optique couplé à la caméra correspondante et le logiciel d’image.
  2. Pour évaluer la présence de MSCs GFP-positifs dans les tibias de souris :
    1. Détartrer les tibias en acide tétraacétique (EDTA) 0,24 M, pH 7,2 – 7,4. Actualiser le tampon EDTA tous les autres jours jusqu'à os deviennent souples (environ 1 semaine).
    2. Déshydrater les tibias et les infiltrer avec de la paraffine. Incorporer les tibias (y compris les tissus de l’ostéosarcome) dans des blocs de paraffine.
    3. Un microtome permet de préparer 6 sections de paraffine µm. Déposer les éléments de la paraffine sur lames de verre. Après séchage, stocker des diapositives du jour au lendemain à la température ambiante.
    4. Effectuer la recherche d’antigène induite par la chaleur à l’aide du tampon citrate (voir 8.1.2) et tacher les tissus avec l’anticorps anti-GFP (antisérum entier) dans une dilution de 1:900 en anticorps-diluant. Contre-coloration tissus avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
    5. Observer les lames de tissu avec un microscope à fluorescence couplé au logiciel d’imagerie correspondant.

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Résultats

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Dans cette étude, nous avons exploré la capacité des EVs ostéosarcome-sécrété à éduquer MSCs vers un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro. Nous montrons que les cellules d’ostéosarcome libèrent exosome comme EVs qui sont internalisés par MSCs. Nous avons mesuré la modification du profil de l’expression des cytokines MSC induite par le cancer EVs et évalué l’effet des MSCs EV instruits sur la croissance tumorale et de la formation de métastases. La représentation générale de la c...

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Discussion

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Vésicules extracellulaires sécrétée à la tumeur (EVs) peuvent influer sur la physiologie des cellules mésenchymateuses les et éloignés pour générer un environnement propice à la tumeur. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome qui permet la dissection des interactions entre cellules tumorales induite par l’EV et les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) in vivo. Nous montrons que l’injection systémique de tumeur humaine MSCs EV-éduqués dans des souris porteuses de ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. Baglio était soutenue par une bourse par l’Associazione Italiana per le la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-financé par l’Union européenne. En outre, ce projet a reçu de ne financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne en vertu de la Convention de subvention de Marie Sklodowska-Curie aucun 660200 (S.R. Baglio).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Equipment
Ultra CentrifugeuseBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650Désigné dans le manuscrit sous le nom de rotor à godets ultra-oscillants
Microscope électronique à transmissionZeissEM109Ou similaire TEM
Appareil photo numériqueNikonDMX 1200FOu appareil photo similaire
Logiciel d’imagerie TEM  ;NikonACT-1
Microscope à fluorescenceZeissImager.D2Ou similaire Microscope à fluorescence
Logiciel d’imagerie FMZeissZEN Blue
IncubateurNuaire4750E
CentrifugeuseHettickROTANTA 460R-80
CongélateurThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburOu cytomètre en flux similaire
ForetFermFCT-300Avec foret de 0,8 mm
Forets micro-torsadés HSS, 0,8 mmProxxon28 852Foret de 0,8 mm
Caméra IVISXenogenIvis LuminaDésigné dans le manuscrit comme caméra de bioluminescence. Xenogen fait désormais partie du logiciel d’image Perkin Elmer
Living2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen fait désormais partie de Perkin Elmer
10 µ ; Seringue LHamiltonNeuros Modèle 1701 RN
Aiguille : Hamilton RN Aiguille pour seringue, calibre 26, Pointstyle AS, longueur personnalisée 2 cmHamiltonn.a.Caliper
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.Lampe
chauffantePhilipsn.a.
Milieu de culture
Sérum fœtal bovinHycloneRYG35912
Lysat de plaquettesn.a.n.a.IMDM
mediumLonzaBE12-722F
alpha-MEM mediumLonzaBE02-002F
DMEM mediumLonzaBE12-614F
pen/strep/glutamineGIBCO10378-016
héparineLEO012866-08
Trypsine/EDTA (10x)GIBCO15400-054
fortes
adipeux dérivées MSCsn.a.n.a.MSCs
GFPn.a.n.a.Fibroblastes
humainsn.a.n.a.
143Bcellules ATCCCRL-8303
FLUC-143B cellulesATCCCRL-8303Transduit
Disposables
Flacons de culture 175 cm2CELLSTAR660175
Tubes de 50 mLGreiner bio-one210261
Tubes de congélationThermoscientific377224
Tubes ultra-clairsBeckman344058Désignés dans le manuscrit sous le nom de tubes ultra-centrifuges
0,22 & micro ; Filtre mMillexSLGV033RS
200 mesh Grilles en nickel recouvertes de carbone FormvarEMS (Electron Microscopy Sciences)
Seringues à insuline de 0,5 mL avec aiguille 29GTerumoU-100  ;
Boîte de PétriSigma - AldrichP7612
Papier filtre  ;Thermo fisher Scientific50363215
Réactifs / kits
paraformaldéhydeAlfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
glutaraldéhydeEMS (Electron Microscopy Sciences)16300
uranyl oxalateEMS (Microscopie électronique Sciences)22510
acétate d’uranyEMS (Electron Microscopy Sciences)22400
méthylcelluloseEMS (Electron Microscopy Sciences)1560
PKH67Sigmamini67-1ktDésigné dans le manuscrit comme GFLD
BSASigmaA8412
CBA - human inflammatory cytokine kitBD551811
Formaldéhyde 37 %VWR104003100
Lames chirurgicales en acier au carboneSwann-Morton206Désigné dans le manuscrit comme couteau chirurgical
anti-vimentine humaine anticorpsSanta Cruzsc-6260Clone V9
Diluant d’anticorpsDAKOS0809
HRP anti souris IgG anticorpsTechnologies32230
DAB-kitDAKOK500711
hématoxyllineSigmaGHS232
Tampon EDTAn.a.n.a.Tampon
citraten.a.n.a.rabbit
polyclonal anti-GFPanticorps Abcamn.a.Ab290
DAPI  ;Life TechnologiesD1306
Paracétamol, 120 mg / 5 ml siropBayern.a.Sinaspril, solution de paracétamol pour enfants
Isoflurane 1000 mg/gPharmacie Vumcn.a.Chlorhydrate
buprénofine, 0,3 mg/mlIndivior UK Limitedn.a.lidocaine-HCL
2 %Pharmacie Vumcn.a.70
 % éthanolVWR93003.1006
Colle tissulaireDerma+Flex, cyanoacrylate médical formuléVygonLB604060
Gouttes oculaires : Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lombn.a.D-luciférine
, sel de potassiumBiotechnologie d’orLUCK-1
Lames de verreThermo scientific630-0954
Boucles en acier inoxydable n.a.n.a.
Mice experiments
Mice, Hsd :Athymic Nude-Foxn1nu,  ; femelle, 6 semaines à l’arrivée, état bactérien conforme FELASAENVIGOn.a.Maison
intelligente en pâte à papier (enrichissement en cage)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
matériau de literieShepperd Speciality Papersn.a.
Nourriture pour souris : Teklad global 18 % protein rongeursrégime ENVIGO2918-11416M
SuturesEthiconV926H
CiseauxSigma-AldrichS3146-1EA(ou similaire)
Pince à épilerSigma-AldrichF4142-1EA(ou similaire)
positives à la Life de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

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