Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer des cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur Immunofluorescence et ADN poisson

CTC représente une étape clé du cancer cellule diffusion¹. Leur présence dans le sang périphérique des patients est associé (métastatique) rechute et maladie progression^2,3. La CCT isolement et caractérisation du sang de patients atteints de cancer est un type de biopsie liquide non invasif. Ces dernières années, il est devenu de plus en plus évident que suivi de la progression et la réponse des tumeurs aux traitements différents à l’aide de ce type d’analyse fournit des informations cliniques importantes^4,5. La biopsie liquide est encore plus utile lorsque la chirurgie n’est pas réalisable ou lorsque le tissu de la tumeur primitive n’est pas disponible, c'est-à-dire, pour les lésions non-biopsiable. Par conséquent, cette approche est prometteuse dans des milieux de cancer spécifique comme des CBNPC métastatique, où la présence des PTC s’est avérée avoir un rôle pronostique négatif⁶. NSCLC est une tumeur qui bénéficie notamment des approches thérapeutiques ciblées^7,8,9 , conçu pour agir sur les molécules spécifiques (cibles moléculaires) connus pour être impliqués dans la croissance, la progression, et propagation de la maladie. Par conséquent, la détection de cibles spécifiques au cours de la progression de la maladie est nécessaire. Enquête de la CCT est une approche de diagnostique extrêmement intéressante pour détecter et suivre des cibles de médicaments sans la nécessité pour les tissus primaires ou métastatiques. Par exemple, la détection de translocations gène ALK dans les cellules NSCLC est associée avec une sensibilité au crizotinib, une thérapie ciblée spécifique¹⁰. Toutefois, à l’heure actuelle, la détection de translocations ALK est exécutée uniquement sur l’aspiration de l’aiguille fine ou petites biopsies ; en conséquence, sans une tumeur tissulaire analyse ALK n’est pas possible. DCC est une alternative possible à la tumeur enquêtes axées sur les tissus et représente une approche de diagnostic compagnon très prometteur.

Malgré leur importance potentielle, CTC est toujours un sujet de grand débat entre recherche, principalement en raison de leur rareté (1-10 cellules/mL de sang périphérique,¹¹). Les méthodes actuelles de biopsie liquide utilisent une quantité limitée de sang (c.-à-d., 1-30 mL)^12,13, mais cela crée une situation sous-optimale sensibilité pour la détection des CTC. en conséquence, recherche est garanti à la conclusion approches et en développement de dispositifs pour effectuer des biopsies liquides CCT ciblée sur un plus grand volume de sang périphérique.

Un autre dispositif, un fil médical fonctionnalisé (voir Table des matières), a été conçu pour surmonter les limites de prélèvement d’échantillons de sang et obtenir une analyse plus représentative des PTC. Ce fil fonctionnalisé est un dispositif médical homologué CE qui capture CTC directement à partir de la circulation sanguine des patients de cancer¹. Il est composé d’un fil d’acier inoxydable de 16 cm de long (Figure 1 a) avec une pointe de fonctionnalisés de 2 cm de long recouverte d’une couche de 0,2 µm-épaisseur de l’or. La couche est recouverte à son tour par une strate d’hydrogel polycarboxylate de 1 à 5 µm d’épaisseur par covalence couplée avec des anticorps dirigés contre le EpCAM, un des antigènes exprimés plus largement sur la surface du CTC¹⁴. La pointe fonctionnalisée du fil est introduite dans une veine du bras du patient et doit rester en position pendant au moins 30 min. Cette approche permet d’isoler des CTC in vivo, directement dans le sang périphérique et à l’écran près de 1,5 à 3,0 L de sang (environ 300 fois plus que le volume utilisé d’approches alternatives)¹.

Pantel et al. démontré l’efficacité de cette approche pour isoler le CTC directement dans les veines des bras du poumon cancer patients¹⁵. Ils ont joué fil immunofluorescence souillant pour identifier la CTC en utilisant des anticorps conventionnels dirigés contre EpCAM et pan-cytokératine et CD45 pour détection de leucocyte. Le fil a été examiné sous un microscope de fluorescence optique¹⁵. Les auteurs ont démontré que l’appareil a pu isoler le PTC, mais ils ne pas enquêter sur toutes les cibles liées à la thérapie, tels que des translocations ALK.

La méthode présentée vise à identifier les présumés CTC dans les lignées cellulaires NSCLC sur la base des paramètres phénotypiques, par exemple, EpCAM positivité et la présence de biomarqueurs moléculaires, par exemple le statut ALK (Figure 1 b). Cette procédure 3-journée combine un fil fonctionnalisé et immunofluorescence souillant avec ADN fluorescencein situ-hybridation ADN, nommé Immuno-DNA-FISH. Étant donné que PTC est des entités rares, l’avantage de ce protocole est que PTC peut être caractérisée sur le même fil en termes de caractéristiques immunophénotypiques et réarrangements de l’ADN.

1. ADN Immuno-FISH sur un lamelle couvre-objet 2D

1. Lamelle couvre-objet préparation et adhérentes cellule ensemencement
   Remarque : Effectuez toutes les opérations suivantes sous une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
   1. Immerger la lamelle en éthanol 100 % pour les désinfecter.
      Remarque : Nous utilisons 12 mm × 12 mm soutenu par silicone carré lamelles couvre-objet (tous les réactifs sont énumérés dans la Table des matières).
   2. Placer les lamelles dans une boîte de Pétri (100 mm de diamètre). Sec à l’aide d’obligé débit d’air pendant 5 min.
   3. Laver le plat de Pétri avec du phosphate de 15 mL stérile 1 × Dulbecco solution saline tamponnée (PBS).
   4. La boîte de Pétri avec 10 mL de milieu complet de lavage (voir tableau 1).
   5. Graines de cellules adhérentes (environ 1 650 000 cellules dans 10 mL de milieu, comptés par analyse de FACS) en abaissant doucement la suspension de cellules dans la boîte de Pétri pour obtenir placage cellulaire uniforme (environ 30 000 cellules/cm²).
      Remarque : Pour ~ 70 % confluence, adhérentes cellules doivent être cultivées sur des lamelles couvre-objet pendant au moins 48 h.
2. Fixation et permeabilization
   ATTENTION : L’acétone est un inflammable et irritant des substances volatiles. Utilisez des plastiques seulement résistantes à l’acétone ou récipients en verre (pas de PVC ou PVDF).
   Remarque : Effectuez ces étapes sous une hotte chimique.
   1. Enlever le milieu de culture à l’aide d’une pipette d’aspiration jetable.
   2. Laver le plat de Pétri avec 1 × PBS.
   3. À l’aide de pinces à épiler, laver les lamelles en les plongeant dans un bécher en verre contenant 5 mL de 1 × PBS.
   4. Sécher les lamelles couvre-objet sur du papier absorbant.
   5. Fixer les cellules sur la lamelle couvre-objet en l’immergeant dans une solution d’acétone 100 % pendant 10 min à température ambiante (RT).
   6. Enlever le couvre-objet en pince à épiler. Lamelle couvre-objet à l’aide d’une circulation d’air forcée pendant 5 min à sec.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade. La lamelle doit être conservée à-20 ° C.
3. Immunofluorescence, jour 1
   Remarque : Cette étape consiste à une incubation (O/N) pendant la nuit (~ 16 h).
   1. Laver les lamelles dans 1 × PBS.
   2. Déposer 100 µL de tampon de dilution d’anticorps (pour plus de détails, voir le tableau 1 ) sur la lamelle couvre-objet et laisser incuber 30 min à température ambiante.
      Remarque : Le volume de la Solution doit être ajustée sur la base de la surface de la lamelle couvre-objet pour couvrir la lamelle entière et éviter tout risque de débordement.
   3. Préparer le mélange d’anticorps (tableau 1) en utilisant un 01:20 dilution de l’anticorps primaire monoclonal conjugué avec le tampon fluorochrome et anticorps, comme spécifié dans la fiche technique fournie par le fabricant.
      Remarque : Il est fortement conseillé d’utiliser des anticorps monoclonaux conjugués fluorochrome thermostable. Si un fluorochrome non-thermostable est utilisé, la température utilisée durant les étapes de DNA-FISH du protocole peut endommager le fluorochrome et éteindre les émissions fluorescentes. Dans ce protocole, nous avons opté pour un anticorps EpCAM-FITC (01:20 dilution), qui n’ont pas montré de problèmes importants avec la température utilisée.
   4. Rincer les lamelles deux fois en 1 × PBS.
   5. Placez le côté cellule lamelles vers le haut dans un humide chambre et déposer 100 µL du mélange anticorps sur la lamelle couvre-objet.
      Remarque : Le volume de la Solution doit être ajustée sur la base de la surface de la lamelle couvre-objet pour couvrir la lamelle entière et réduire le risque de débordement.
   6. Incuber les O/N (~ 16 h) dans l’obscurité à 4 ° C.
4. Immunofluorescence, jour 2
   1. Bloquer l’incubation des anticorps en lavant les lamelles dans 1 × PBS deux fois.
      NOTE : Magasin les lamelles couvre-objet immergé dans 100 µL de 1 × PBS à 4 ° C dans une chambre avec une atmosphère humide constante dans l’obscurité jusqu'à ce que le test FISH est réalisé.
5. DNA-FISH 2D jour 2
   ATTENTION : Doit être une attention particulière à la température élevée des instruments et la chambre humide.
   1. Mettre en place l’hybridation four et four à chaleur sèche (~ 3 h avant de commencer le protocole DNA-FISH). Régler le four de l’hybridation à 75 ° C, réglez le four de chaleur sèche à 37 ° C et refroidir la solution SSC de 0,4 × (pH = 7,0 ± 0,1) (voir le tableau 1pour la recette de la SSC) à 4 ° C.
      Remarque : statut de pH des tampons de poissons est essentiel : pH = 7,0 ± 0,1.
   2. Lavez la lamelle trois fois à glacee 0,4 × SSC solution.
   3. Sécher la lamelle sous une hotte chimique pendant 10 min dans l’obscurité.
   4. Vortexer pendant 10 s et effectuer une rotation rapide vers le bas (au taux maximum) de la sonde de la paroi de la sonde-tube.
   5. Placez la côté cellule lamelle sur une chute de 5 µL de sonde de poisson sur un toboggan et un sceau tous les bords de la lamelle avec du ciment de caoutchouc.
      ATTENTION : Les deux étapes suivantes impliquent des températures élevées. Porter des gants.
   6. Mettez la diapositive dans une chambre sombre humide dans le four à hybridation pendant 8 min à 75 ° C pour la dénaturation complète de l’ADN.
   7. Déplacer la chambre humide dans le four à chaleur sèche à 37 ° C O/N.
6. DNA-FISH 2D jour 3
   1. Le bain d’eau à 72 ° C et y déposer un pot de coloration à glissière avec tampon SSC 0,4 × dedans (tableau 1). Après 30 min, vérifiez la température de la mémoire tampon SSC 0,4 ×, laquelle doit avoir lieu 72 ± 1 ° C.
   2. Préparer deux béchers en verre : une avec 2 × SSC + 0,05 % Tween tampon (pH = 7,0 ± 0,1) (tableau 1) et une autre avec de l’eau distillée.
   3. Sortir du four la chambre humide, soigneusement enlever le ciment de caoutchouc de la lame et détacher la lamelle avec des pincettes.
   4. Laver la lamelle en trempant dans 0,4 × SSC pendant 2 min à 72 ° C.
   5. Laver la lamelle en plongeant dans les 2 × SSC + 0,05 % Tween tampon pendant 30 s.
   6. Rincer la lamelle couvre-objet dans l’eau distillée.
   7. Sécher les lamelles sous une hotte chimique pendant 10 min dans l’obscurité.
   8. Monter la lamelle dans un milieu liquide de montage avec 1,5 µg/mL de 4´, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à contre-coloration ADN total. Déposer la lamelle couvre-objet cell-côté sur une chute de 5 µL de milieu de montage sur une diapositive, appuyez sur la pince à épiler sur la lamelle couvre-objet pour obtenir l’air dehors, sceller avec du vernis à ongles.
      Remarque : Un volume moyen de montage doit être ajustée sur la base de la taille de la surface de la lamelle couvre-objet.
7. Analyse et observation microscope 2D
   Remarque : Les Images peuvent être acquises avec des systèmes différents de microscope.

1. Acquérir des images à l’aide d’un appareil photo numérique de 12 bits et 20 × / 0,50 NA et objectif de NA 40 x/0.65 avec des filtres appropriés pour le rouge (excitation : 599 nm ; émission : 588 nm), vert (excitation : 509, émission : 524) et le bleu (excitation : 367 nm ; émission : 452 nm) sondes.
2. Analyser les images à l’aide d’outil logiciel de choix.
   Remarque : Pour évaluer l’immunofluorescence souillant et la localisation de l’ALK-sonde, nous avons utilisé ImageJ. Diapositives peuvent être conservés à-20 ° C dans le noir pour un maximum de 3 semaines. Pour une conservation prolongée, nous suggère d’utiliser le milieu de montage spécifique pour le stockage à long terme.

2. Immuno-DNA FISH sur fil

1. Cellule ligne spike composant logiciel enfichable sur le fil (support de la 3D)
   NOTE : Installation préliminaire implique une précision sélection des adhérentes cellules lignes basées sur EpCAM-positivité. Le fil est fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM afin que seulement les cellules positives EpCAM sont souillées.
   Remarque : Ne pas toucher la partie fonctionnalisée du fil pour éviter tout dommage.
   NOTE : Toutes les étapes devraient être effectuées sous une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
   1. Remettre en suspension l’intégralité du contenu d’une fiole de T75 (confluence de 80 %) dans un flacon de 5 mL à l’aide de 4 mL de milieu complet ; pour un seul épi-in, environ 2 000 000 cellules sont recommandées pour maximiser l’adhérence de cellules au fil.
   2. Retirez le fil de son emballage de verre.
   3. Tremper la partie or fonctionnalisée du fil dans le flacon, veiller à ce que le fil-bouchon est un ajustement étanche pour le flacon. Sceller avec un film de laboratoire.
      Remarque : L’utilisation de tube 5 mL est recommandée pour permettre une correspondance exacte entre le fil-bouchon et le flacon.
   4. Incuber 30 min à ta dans une coiffe de tube (0-120 angle).
   5. Rincez le fil trois fois en 1 × solution de PBS à l’aide de 3 flacons propres différents.
2. Fixation et permeabilization
   ATTENTION : L’acétone est une substance inflammable qui peut irriter les voies respiratoires. Utilisez uniquement les plastiques résistant à l’acétone ou récipients en verre (pas de PVC ou PVDF).
   Remarque : Effectuez ces étapes sous une hotte chimique.
   1. Sécher à l’air le fil.
   2. Fixer les cellules en trempant le fil dans la solution 100 % acétone pendant 10 min à l’utilisation de la RT. un tube de 5 mL.
      Remarque : Le fil-bouchon ne doit pas entrer en contact avec le fixateur.
   3. Sécher à l’air le fil pendant 5 min à température ambiante.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Le fil doit être stocké à-20 ° C. Lors de l’emballage le fil pour le stockage à long terme, placer le fil-bouchon à côté de la pointe fonctionnalisé et insérer le fil dans le tube de verre de stockage, en prenant soin de ne pas endommager la pointe fonctionnalisée. Fermer le verre de stockage et de stocker (verticalement ou horizontalement) à-20 ° C.
3. Immunofluorescence, jour 1
   Remarque : Cette étape consiste à une incubation O/N (~ 16 h).
   1. Laver deux fois dans 1 × solution de PBS à l’aide de tube de 5 mL.
   2. Incuber le fil dans le tampon de dilution d’anticorps pendant 30 min à RT à l’aide de tube de 5 mL.
   3. Préparer 150 µL du mélange de l’anticorps avec une dilution de l’anticorps primaire monoclonal conjugué fluorochrome dans le tampon de dilution des anticorps, comme spécifié dans la fiche technique. Par exemple, les anticorps EpCAM-FITC a été utilisé avec un 01:20 dilution.
   4. Utiliser un embout de p200 pour effectuer d’incubation, comme suit : extrait le fil le fil-bouchon et insérez doucement le fil à travers l’orifice le plus large de la pointe. Insérez d’abord la fin tétrahydrofuraniques et tirez lentement sur le fil par le trou plus petit jusqu'à ce que la partie or est juste au-delà de l’orifice le plus large.
   5. Déposer délicatement 150 µL du mélange anticorps (par exemple anti EpCAM_FITC anticorps 01:20 dilué) dans l’extrémité. Pour éviter le risque de formation de bulles, délicatement tournoyer le fil jusqu'à ce que la partie fonctionnalisée est complètement plongée.
   6. Étanchéité jusqu'à l’orifice de la pointe. Un film de laboratoire d’emballage autour du trou peut aider.
   7. Incuber verticalement O/N (~ 16 h) dans l’obscurité à 4 ° C.
4. 2e jour immunofluorescence
   1. Bloquer l’incubation des anticorps en lavant le fil deux fois en 1 × PBS.
   2. Ré-insérer le fil dans son fil-bouchon.
      NOTE : Magasin à 1 X PBS à 4 ° C dans un 5 mL flacon jusqu'à ce que le test FISH est réalisé.
5. DNA-FISH 3D jour 2
   ATTENTION : Doit être une attention particulière à la température élevée des instruments et chambre humide.
   1. Mettre en place l’hybridation four et four à chaleur sèche (~ 3 h avant de commencer le protocole DNA-FISH). Régler le four de l’hybridation à 75 ° C, réglez le four de chaleur sèche à 37 ° C et refroidir la solution SSC de 0,4 × (pH = 7,0 ± 0,1) à 4 ° C.
      Remarque : Le statut de pH des tampons de poissons est essentiel et doit être 7,0 ± 0,1.
   2. Lavez le fil 3 fois à glacee 0,4 × SSC solution.
      NOTE : Gardez le fil dans l’obscurité afin d’éviter le photoblanchiment fluorochrome durant les procédures suivantes.
   3. Sec pendant 10 min dans le noir sous la hotte.
   4. Vortex et un essorage la sonde pendant 5 s.
   5. Déposer 10 µL de la sonde dans des microtubes de verre. Couvrir avec un film de laboratoire.
   6. Faites tourner les microtubes comme suit : envelopper le microtube dans un put absorbant, papier sec dans un tube de 50 mL et essorer brièvement.
   7. Placez le fil séché dans le microtube délicatement et insérer le fil-bouchon. Sceller avec du ciment de caoutchouc.
      ATTENTION : Les deux étapes suivantes impliquent des températures élevées.

En utilisant la procédure décrite ci-dessus il est possible d’effectuer un test ADN Immuno-FISH sur CTC (ou d’autres cellules équivalentes) enrichie par le fil fonctionnalisé. Avant la mise en place de ce protocole, la compatibilité de ces deux techniques a été déterminée (immunofluorescence avec poisson) sur des supports 2D standards. Deux différentes lignées cellulaires NSCLC exprimant EpCAM (tenue de respecter le fil couplé à l’anticorps contre EpCAM) ont été sélectionnées. Ils ont un statut différent de ALK, qui est utile pour tester les conditions de départ différentes. Le premier, NCI-H1975, possèdent des gènes de type sauvage (WT) de ALK, tandis que le second, NCI-H3122, se caractérise par des translocations ALK.

Un système de détection coupure-apart de gène ALK pour le dosage de poissons a été utilisé. Le système se compose de deux sondes, un (orange) s’hybridant à la région proximale au sein de l’ALC sur 2p 23 et l’autre (vert) s’hybridant distal de l’ALK. Sur supports 2D, Immuno-DNA FISH a fourni des signaux bien définies pour les anticorps et la sonde (Figure 2). En particulier, les deux ont montré la localisation de membrane EpCAM bien définie de lignées de cellules. En outre, les signaux de sonde est apparu lumineuses et nettes : NCI-H1975 cellules montrent chevauchement des sondes oranges et vertes, confirmant le statut de type sauvage du gène ALK (Figure 2 a, b). À l’inverse, NCI-H3122 cellules montrent des signaux qui se chevauchent et les points verts unique, reflétant une délétion du gène ALK (Figure 2 c, d). Lorsque l’analyse Immuno-DNA FISH a été réalisée sur la 3D support fil fonctionnalisé, anticorps et sonde de signaux étaient généralement moins définies que sur l’appui 2D. EpCAM coloration n’était visible. Signaux de sonde ALK étaient moins défini mais reflète encore le statut ALK attendu (Figure 3). Les résultats ont montré qu’immunofluorescence souillant n’a pas entravé des signaux FISH de l’ADN. Les sondes hybridaient spécialement avec leurs cibles. Lignée cellulaire NCI-H3122 a montré un statut aberrant du gène ALK (Figure 3 b), contrairement à l’INFE-H1975, avec un gène ALK de type sauvage (Figure 3 a).

Figure 1 : Fonctionnalisés fil, arrangement schématique des sondes break-apart ALK, régime des patrons attendus de réarrangement de l’ALK et porte spécial. (a) rouge boîtes de mettre en évidence les trois parties principales du fil : fonctionnalisés pointe, fil-bouchon et Astuce non fonctionnalisé. La pointe fonctionnalisée est la partie la plus délicate du fil et ne doit pas être touchée pendant la manipulation pour éviter tout dommage ou détachement cellulaire. (b) les sondes verts et rouges respectivement lient aux séquences en amont et en aval des locus du gène ALK (à gauche). Sur la droite, modèles exemples d’arrangements d’ALC sont indiqués. Signaux de co-localisation rouges et vertes sur les cellules normales ; des signaux rouges et verts séparés indiquent un signal saut de ALK gène chromosomique (translocation du gène ALK) et un vert-orange colocalisation (aberrant cellule-1). Un signal rouge et deux signaux verts indiquent la perte d’un signal rouge, ce qui suggère une translocation chromosomique et une délétion (aberrant cellule-2). (c) fil titulaire ; cases rouges mettent en évidence les secteurs où les soins sont nécessaires lorsque vous manipulez le fil lors de l’analyse de la microscopie. Le fil peut subir une analyse de 360 ° en tournant le rotateur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dosage Immuno-DNA FISH sur support 2D (lamelle). (a, b) NCI-H1975 cellules faiblement positif pour EpCAM. EpCAM FITC signaux étaient appréciables. Les sondes oranges et vertes de l’ALK break-apart se chevauchaient, confirmant le statut WT du gène ALK dans la lignée de cellules NCIH1975. Les cellules affichant plus de deux signaux paires étaient présents en raison de leur aneuploïdie. (c, d) Dans la lignée de cellules exprimant EpCAM NCIH3122 haute, immunofluorescence signaux ont été brillants, qui s’est accentuée dans les jonctions cellule-cellule. POISSON des analyses des destructions confirmées du gène ALK, typique de cette lignée cellulaire. Flèches rouges indiquent des sondes verts seul (sans sondes orange correspondantes), reflétant la délétion du gène ALK. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Immuno-DNA FISH test utilisant le fil fonctionnalisé comme support de la 3D. (une) représentant l’image de cellules de NCI-H1975 sur le fil. Bien que difficile d’acquérir des images entièrement mise au point, la forme 3D des cellules sur le fil signal EpCAM est bien visible dans toutes les cellules. (b), représentant l’image de cellules de NCI-H3122 sur le fil. ALK sondes ont montré la délétion du gène (flèches rouges), comme déjà vue sur le support 2D. Les signaux de fond visible étaient très probablement due à la présence de la couche de polymère. Cependant, il n’affecte pas significativement l’analyse cellulaire d’identification ou de fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recettes de Solutions.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.