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Article de méthode

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

10.7K vues

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DOI :

10.3791/56943

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21 mars 2018

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1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

Dans cet article

Résumé

Obtention de l’ADN génomique de haute qualité provenant de tissus de la tumeur est une première étape essentielle pour l’analyse des altérations génétiques à l’aide de séquençage de la génération suivant. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et rapide pour enrichir les cellules tumorales et obtenir des ADN intact de toucher les échantillons de cytologie mentions légales.

Résumé

Il est essentiel de déterminer le statut mutationnel dans le cancer avant administration et traitement des médicaments ciblés moléculaires spécifiques pour les patients atteints de cancer. Dans le contexte clinique, fixés au formol les tissus inclus en paraffine (FFIP) sont largement utilisés pour les tests génétiques. Cependant, FFPE ADN est généralement endommagé et fragmentée au cours du processus de la fixation par le formol. Par conséquent, FFPE ADN n’est parfois pas suffisant pour les tests génétiques en raison de la faible qualité et la quantité d’ADN. Nous présentons ici une méthode de cytologie d’empreinte tactile (TIC) pour obtenir l’ADN génomique des cellules cancéreuses, qui peut être observé au microscope. Nombre de cellules du cancer et de la morphologie cellulaire peut être évalué à l’aide de spécimens TIC. En outre, l’extraction de l’ADN génomique provenant d’échantillons TIC peut être complétée dans les deux jours. Le montant total et la qualité des TIC ADN obtenu à l’aide de cette méthode était supérieur à celui de la FFPE ADN. Cette méthode simple et rapide permet aux chercheurs d’obtenir des ADN de haute qualité pour les tests génétiques (par exemple, analyse de la génération prochaine séquence, numérique de PCR et PCR quantitative en temps réel) et de raccourcir le délai pour la présentation des résultats.

Introduction

Prochaine génération technologie de séquençage a fourni des chercheurs des progrès importants dans l’analyse de l’information de génome de variations génétiques, maladies mendéliennes, prédispositions héréditaires et cancer 1,2,3 . Le Cancer Genome Atlas (TCGA) et l’International Cancer Genome Consortium (oncologie) ont poursuivi l’identification des altérations génétiques dans plusieurs types de cancers communs4. Des centaines de gènes de pilote au cancer essentielles ont été identifiées avec succès, et certaines de ces molécules sont ciblés pour drug development1,5,6.

Dans le contexte clinique, échantillons FFPE sont couramment utilisés pour le diagnostic pathologique et tests moléculaires pour diverses maladies, y compris le cancer. Toutefois, au cours du processus de la fixation par le formol, la réticulation ADN-protéines ou d’ADN intervient et fragmentation de l’ADN est induite. Ainsi, les échantillons FFPE ADN ne conviennent pas toujours pour l’analyse génétique en raison de la faible qualité et la quantité d’ADN7,8,9. En outre, il faut plusieurs jours pour préparer des échantillons FFPE et habileté technique n’est nécessaire d’établir avec précision les sections. Par conséquent, il est souhaitable d’élaborer une méthode simple et rapide pour obtenir qualité ADN intact.

Cytologie est une méthode alternative pour le diagnostic pathologique. Préparation des échantillons cytologiques est plus simple, moins coûteux et plus rapide approche contre FFIP préparation10. La technique TIC a été réalisée sur les ganglions sentinelles et marginales tissus de patients atteints de cancer du sein pour un diagnostic rapide peropératoire pour quelques années11,12. Cependant, il y a peu de rapports qui ont tenté de déterminer si l’ADN génomique de haute qualité peut être extraites de spécimens TIC et utilisé pour l’analyse génétique ultérieure. Les échantillons cytologiques sont couramment tachées de Papanicolaou (Pap) ou la coloration de Giemsa, et nous avons déjà indiqué que la quantité et la qualité de l’ADN extrait d’échantillons TIC (en particulier les échantillons colorés au Giemsa) sont supérieurs aux échantillons prélevés FFIP 13de tissus. Par rapport à la coloration de Pap, coloration de Giemsa a un avantage d’exiger moins méthodes de coloration. Dans la coloration de Pap, après que les échantillons ont été fixés et colorés, ils doivent être montés avec montage moyen (par exemple, Malinol) pour distinguer le contenu de l’échantillon, telles que les cellules tumorales, les cellules normales et des cellules inflammatoires au microscope. Si le spécimen de Pap est préparé sans l’étape de montage, il est presque impossible d’observer des cellules au microscope parce que l’échantillon est séché. En comparaison, la coloration au Giemsa peut être observée à l’état séché, l’étape de montage n’est donc pas nécessaire pour une évaluation rapide cellulaire. Pour microdissection, coloration de Giemsa est plus appropriée car il nécessite des spécimens secs.

Dans ce rapport, nous présenter une méthode simple et rapide pour la préparation de spécimens TIC avec coloration de Giemsa et démontrer que les TIC est une meilleure source d’ADN par rapport aux échantillons FFPE.

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Protocole

1. TIC préparation rapide évaluation microscopique à l’aide de verre Normal glisse

  1. Effectuer la préparation TIC dès que possible après que le tissu pathologique clinique matériaux sont disponibles. Si les spécimens TIC ne peuvent immédiatement être préparés, conserver les matériaux de tissu recouverts de solution saline humidifiée-gaze stérile et stocker au réfrigérateur pour éviter le dessèchement des tissus.
  2. Préparer 5 mm3 matériel tissulaire telles que des tumeurs solides (par exemple, du foie, des poumons et les tissus du sein) cliniquement obtenu par chirurgie ou par endoscopie.
    1. Doucement, essuyer le tissu avec une gaze stérile recouverte de sérum physiologique et enlever le sang, si la surface du tissu a beaucoup de sang.
    2. Pour les échantillons microscopiques tels que les matériaux de la biopsie, garder l’échantillon imbibé stérile-gaze imbibée de sérum physiologique.
  3. Couper et tailler le tissu normal avec un couteau de parage et exposer la surface de la lésion tumorale, si les masses de la tumeur ne sont pas visibles grossièrement.
  4. Touchez la surface de la tumeur des spécimens réséqués sur une lame de verre normal plusieurs fois avec des mains gantées. Confirmer visuellement que la zone touchée est supérieure à 80 % de la lame de verre normal.
  5. Légèrement, appuyez sur la lame de verre normale contre une diapositive de membrane polyéthylène naphtalate (PEN) et frottez doucement 2 ou 3 fois avec des mains gantées. Confirmer visuellement que les cellules sont transférées de la lame de verre normal à la diapositive de membrane de stylo.
  6. Sécher à l’air le verre et le PEN membrane diapositives pendant 5 min à température ambiante.
  7. Colorer la lame de verre normale pour l’examen cytologique direct. Tremper les lames de verre avec une solution de fixation pour 5 s et puis tache avec la solution pour 15 de coloration au Giemsa s.
  8. Évaluer et entièrement avec un microscope pour une évaluation rapide de l’écran le contenu de la tumeur et de la cellularité sur la lame de verre normal. Évaluer les cellules tumorales basées sur plusieurs critères ; l’élargissement nucléaire, caryotype anormal, chromatine abondante, une répartition inégale des cellules, rapport de la composante nucléaire de composant/cytoplasmique, la taille des cellules et polarité cellulaire.

2. préparation du Film diapositive PEN Membrane pour les tests génétiques

  1. Si l’échantillon montre cellularité de la tumeur, plus de 60 % par une rapide évaluation microscopique (étape 1.8), couper le film tumeur-touché des PEN membrane diapositives pour l’extraction de l’ADN avec un couteau et gantés mains. Transférer le film coupe dans un tube de microcentrifuge stérile avec une pincette et mains gantées.
  2. Si la cellularité de la tumeur a été déterminée comme étant faible (moins de 60 % du contenu tumeur) par rapide évaluation microscopique (étape 1.8), utiliser le laser microdissection de saisie et obtenir des échantillons de tumeur.
    1. Effectuer afin d’évaluer les cellules tumorales à l’aide de protocoles standard de coloration de Giemsa.
    2. Couper le film de la diapositive de membrane PEM par microdissection de saisie de laser approprié.
    3. Transférer le film coupe dans un tube de microcentrifuge stérile avec une pincette et mains gantées.
    4. Conserver le tube microtubes contenant du film à 4 ° C jusqu'à l’extraction de l’ADN (le protocole peut être suspendu ici).

3. Extraction d’ADN

  1. Effectuer l’extraction de l’ADN des échantillons de tissu TIC ou FFIP, à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN FFIP selon les instructions du fabricant avec des modifications mineures. Il existe un kit équivalent pour l’étape d’extraction FFPE ADN.
  2. Ajouter 180 µL de tampon de lyse tissulaire (pH = 8,3) au tube microtubes contenant du film avec une pipette manuelle 200 µL. Ajouter 20 µL de protéinase K avec une pipette manuelle 20 µL et mélanger au vortex avec un agitateur Vortex à vitesse maximale (environ 2 500 tr/min) pendant 5 s.
  3. Incuber les échantillons à 56 ° C pendant la nuit avec un incubateur de l’air.
  4. Incuber les échantillons FFPE et TIC à 90 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 h et 10 min, respectivement. Tournez brièvement en bas du tube de microcentrifuge à 1 500 g pendant 5 s à température ambiante avec une mini centrifugeuse.
  5. Ajouter 200 µL de tampon de lyse de l’échantillon avec une pipette de 200 µL et mélanger soigneusement au Vortex à vitesse maximale pendant 5 s.
  6. Ajouter 200 µL d’éthanol (96-100 %) avec une pipette de 200 µL et homogénéiser au Vortex à vitesse maximale pendant 5 s. brièvement tournez en bas du tube de microcentrifuge à 1 500 g pendant 5 s à température ambiante avec une mini centrifugeuse.
  7. Transvaser avec soin tout le lysat de la colonne avec une pipette de 1 000 µL et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
  8. Placer la colonne dans un tube propre 2 mL collection avec des mains gantées et jeter le tube de prélèvement contenant le cheminement dans une boîte en plastique de l’élimination.
  9. Ajouter 500 µL de tampon de lavage à la colonne avec une pipette de 1 000 µL et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
  10. Placer la colonne dans un tube propre 2 mL collection avec des mains gantées et jeter le tube de prélèvement contenant le cheminement dans une boîte en plastique de l’élimination.
  11. Ajouter 500 µL de tampon de lavage à la colonne avec une pipette de 1 000 µL et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
  12. Jeter le tube de prélèvement contenant le cheminement dans une boîte en plastique de l’élimination. Placer la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL propre avec des mains gantées et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min à 25 ° C, sécher la membrane.
  13. Placer la colonne dans un tube de liaison ADN-doux avec des mains gantées.
    1. Ajouter 40-50 µL de tampon d’élution au centre de la membrane avec une pipette 100 µL.
    2. Incuber à température ambiante pendant 5 min et centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à 25 ° C.
    3. Stocker les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu’au niveau suivant (le protocole peut être suspendu ici).

4. estimation de qualité de l’ADN par PCR Quantitative en temps réel

  1. Préparer le mélange maître dans un tube de microcentrifuge stérile avec une pipette, comme suit : 10 µL de 2 x PCR en temps réel Master Mix, 1 µL de 20 x RNase P sonde Primer Mix (taille de l’amplicon : 87 bp) et 8 µL d’eau stérile exempte de nucléase.
  2. Préparer le deuxième mélange maître dans un des tubes de microcentrifuge stérile comme suit : 10 µL de 2 x PCR en temps réel Master Mix, 1 µL de 20 x RNase P sonde Primer Mix (taille de l’amplicon : 268 bp) et 8 µL d’eau stérile exempte de nucléase.
  3. Effectuer des dilutions successives de l’ADN génomique de contrôle de l’homme (fourni dans le kit) 4 fois pour une courbe standard de cinq points et déterminer l’absolue de concentrations ADN13.
  4. Ajouter 19 µL des deux mélanges maîtres préparés (préparé à l’étape 4.1 et 4.2) dans un puits distinct d’une optique 96 puits réaction avec une pipette de 20 µL.
  5. Ajouter 1 µL de FFPE ADN ou d’ADN de TIC aux différents puits contenant le mélange réactionnel avec une pipette de 2 µL. Ajouter 1 µL d’eau exempte de nucléase dans un puits distinct contenant le mélange réactionnel pour l’aucun contrôle de modèle.
  6. Tenez le côté non adhésive d’un film adhésif optique et Décollez la sauvegarde depuis le centre du film de protection. Doucement, faites glisser l’applicateur sur le film et le film le joint sur la plaque à 96 puits.
  7. Mélanger délicatement la plaque à 96 puits en utilisant un mélangeur plaque 96 puits pendant 10 s à la température ambiante à 2 000 tr/min. Centrifuger la plaque brièvement à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante.
  8. Allumez l’appareil de PCR en temps réel et les insérer la plaque à 96 puits. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 95 ° C pendant 20 s, suivie de 45 cycles de 95 ° C pour 1 s et 60 ° C pendant 20 s. utilisation « courbe standard » et « mode rapide ».
  9. Évaluer la fragmentation de l’ADN avec le ratio de l’ADN (quantification relative ; RQ) obtenues pour l’amplicon long (268 bp) à l’amplicon court (87 bp). QR est la valeur moyenne de la valeur moyenne de l’amplicon/le long de l' amplicon court13.

5. préparation de la prochaine génération séquençage bibliothèque

  1. Se préparer à la bibliothèque de séquençage pour le séquençage de génération suivant selon les instructions du fabricant.
  2. Préparer le mélange maître de multiplex PCR dans un tube de microcentrifuge stérile par exemple comme suit : 4 µL de 5 x solution de réaction PCR Multiplex, 4 µL de 5 x piscine apprêt, µL ≤6 TIC ou FFPE ADN (ng 1-100) et ajouter jusqu'à 20 µL d’eau exempte de nucléase.
    1. Ajouter le mélange maître de PCR multiplex à un tube PCR et mélanger doucement en tapant sur le tube.
    2. Tournez brièvement en bas du tube de microcentrifuge à 1 500 g pendant 5 s à température ambiante avec une mini centrifugeuse.
  3. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 99 ° C pendant 2 min, suivie de 20 cycles de 99 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 4 min et tenue pas 10 ° C. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
    NOTE : Déterminer le nombre de cycles basés sur le nombre de paires d’amorces.
  4. Ouvrez le couvercle du tube PCR et ajoutez 2 µL de l’enzyme de restriction avec une pipette de 2 µL. Fermer le couvercle du tube PCR et mélanger doucement en tapant sur le tube PCR. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
  5. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 50 ° C pendant 10 min, 55 ° C pendant 10 min, 60 ° C pendant 20 min, et tenue pas 10 ° C. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
  6. Ajoutez le mélange maître de ligature adaptateur dans le chaque cupule contenant les amplicons PCR digérés avec une pipette comme suit : 4 µL de solution de ligature d’adaptateur, 0,5 µL de codes à barres, 0,5 µL d’adaptateur, 2 µL d’eau exempte de nucléase et 2 µL de DNA ligase. Fermer le couvercle du tube PCR et mélanger doucement en tapotant. Tournez brièvement en bas du tube PCR avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante.
  7. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 22 ° C pendant 30 min, 68 ° C pendant 5 min, 72 ° C pendant 5 min, et tenue pas 10 ° C.
  8. Purifier la bibliothèque de séquençage avec billes magnétiques selon les instructions du fabricant.
  9. Transférer la solution adaptateur-ligaturé bibliothèque dans le tube de liaison faible d’ADN de 1,5 mL. Ajouter 45 µL de billes magnétiques dans le tube de faible liaison ADN pour la purification dest 1. Mélanger doucement en tapant sur le tube et laisser incuber 5 min à température ambiante.
  10. Placer le tube de liaison ADN-basse dans un support magnétique, puis incuber pendant 2 min à température ambiante jusqu'à ce que la solution est claire. Soigneusement, éliminer le surnageant avec une pipette de 200 µL sans déranger les billes magnétiques.
  11. Ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % fraîchement préparée avec une pipette de 200 µL, puis déplacez le tube à côté de l’aimant pour laver les perles. Soigneusement éliminer le liquide surnageant sans déranger les billes magnétiques.
  12. Répétez l’étape 5.11 pour un second lavage.
  13. Tournez brièvement en bas du tube avec mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante. Placer le tube de faible liaison ADN dans un support magnétique et jeter avec précaution les gouttelettes de l’éthanol avec une pipette de 10 µL.
  14. Ajouter 50 µL de basse TE dans le tube de faible liaison d’ADN contenant le culot de billes magnétiques pour disperser les perles. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
  15. Placer le tube de faible liaison ADN dans une grille magnétique et incuber à température ambiante pendant 2 min, jusqu'à ce que la solution est claire.
  16. Transférer les 50 µL de liquide surnageant dans le nouveau tube de faible liaison ADN et ajouter 75 µL de billes magnétiques avec une pipette 100 µL de purification 2nd . Mélanger doucement en tapant sur le tube et laisser incuber 5 min à température ambiante.
  17. Placer le tube de faible liaison ADN dans un support magnétique, puis incuber pendant 2 min à température ambiante jusqu'à ce que la solution est claire. Soigneusement, éliminer le surnageant avec une pipette de 200 µL sans déranger les billes magnétiques.
  18. Ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % fraîchement préparée avec une pipette de 200 µL, puis déplacez le tube à côté de l’aimant pour laver les perles. Soigneusement éliminer le liquide surnageant sans déranger les billes magnétiques.
  19. Répétez l’étape 5.18 pour un second lavage.
  20. Tourner brièvement dans le tube avec une mini centrifugeuse à 1 500 x g pendant 5 s à température ambiante. Placer le tube de faible liaison ADN dans un support magnétique et jeter avec précaution les gouttelettes de l’éthanol avec une pipette de 10 µL.
  21. Ajouter 50 µL de faible TE dans le tube de faible liaison d’ADN contenant le culot de billes magnétiques pour disperser les perles. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
  22. Placer le tube de faible liaison ADN dans une grille magnétique et incuber à température ambiante pendant 2 min, jusqu'à ce que la solution est claire.
  23. Transférer les 45 µL du liquide surnageant contenant la bibliothèque purifiée dans le nouveau tube de faible liaison ADN avec une pipette 100 µL.

6. quantifier la Concentration de bibliothèque par PCR Quantitative en temps réel

  1. Déterminer la concentration de chaque bibliothèque selon les instructions d'13 du fabricant.
    1. Préparer une solution de dilution 20 fois comme suit : mélangez 2 µL de bibliothèque purifiée et 38 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de liaison faible d’ADN avec une pipette 2 µL et 100 µL.
    2. Conserver les bibliothèques non dilués à-20 ° C jusqu'à l’étape 7.3.
  2. Préparer une solution de 200-fold dilution comme suit : mélanger 5 µL de la bibliothèque de purifié diluée 20 fois (préparée à l’étape 6.1) et 45 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de faible liaison ADN.
  3. Préparer une solution de 2,000-fold dilution comme suit : mélanger 5 µL de la 200-fold bibliothèque de purifié diluée (préparée à l’étape 6.2) et 45 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de faible liaison ADN.
  4. Préparer le mélange de réaction de maître comme suit : mélangez 10 µL de 2 x solution de mélange principal et 1 µL de 20 x solution Test amorce-sonde en tubes de microcentrifuge stérile avec une pipette, puis mélanger en tapant sur le tube. Ajouter 11 µL du mélange maître réaction dans les puits d’une réaction de 96 puits optique.
  5. Ajouter 9 µL de la 2,000-fold bibliothèque diluée, 9 µL de chaque contrôle standard ou 9 µL d’eau exempte de nucléase dans chaque puits avec une pipette de 10 µL.
  6. Tenez le côté non adhésif du film adhésif optique et Décollez la sauvegarde depuis le centre du film de protection.
    1. Doucement, faites glisser l’applicateur sur le film et le film le joint sur la plaque à 96 puits.
    2. Mélanger délicatement la plaque à 96 puits en utilisant un mélangeur plaque 96 puits pendant 10 s à température ambiante.
    3. Centrifuger la plaque brièvement à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante.
  7. Allumez l’appareil de PCR en temps réel et les insérer la plaque à 96 puits. Exécuter les réactions de PCR utilisant le protocole suivant : 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 20 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pour 1 s et 60 ° C pendant 20 s. utilisation « courbe standard » et « mode rapide ».
  8. Calculer la concentration de bibliothèque non dilué en multipliant la concentration déterminée avec le qPCR de 2 000.

7. la prochaine génération séquençage

  1. Planifier la condition d’exécution et définissez le paramètre d’exécution au sein du logiciel.
    1. Cliquez sur [ongletPlan] et [modèle], puis sélectionnez la méthode d’exécution appropriée.
    2. Sélectionnez l’application et le type de technique et cliquez sur [suivant].
    3. Sélectionnez l’instrument, kit de préparation d’échantillon (facultatif), type de bibliothèque de kit, kit de modèle, kit de séquençage, mode étalonnage de base, type de puce, jeu de séquence (facultatif) et code à barres de contrôles et cliquez sur [suivant].
    4. Sélectionnez plugins et cliquez sur [suivant].
    5. Sélectionnez le projet et cliquez sur [suivant].
    6. Choisissez référence par défaut et les fichiers du lit de la région ciblée.
    7. L’exemple de nom de type, sélectionnez le code à barres et cliquez sur [exécuter pour le Plan].
  2. Effectuer la préparation du modèle et la puce de chargement dans un instrument automatisé selon les instructions du fabricant. Dégelez la cartouche de réactif à température ambiante pendant 45 min avant utilisation.
  3. Diluer la bibliothèque non diluée avec de l’eau exempte de nucléase selon la concentration de bibliothèque calculée à l’étape 6,8 et faire 20 bibliothèques de pM.
    1. Préparer une bibliothèque mis en commun pour le séquençage et le magasin sur la glace.
    2. Ajouter 25 µL de la bibliothèque mis en commun avec une pipette µL 100 vers le bas du tube échantillon. Utilisez la bibliothèque regroupée sous 48 h.
  4. Mettez sous tension et ouvrez le couvercle de l’instrument automatisé.
    1. Placer la puce de séquençage, adaptateur puce, enrichissement cartouche, cartouche de pointe, plaque PCR, joint d’huisserie PCR, tube de récupération, cartouche de solution et cartouche de réactif à la position appropriée de l’instrument automatisé.
    2. Appuyer sur [la mise en place Run] et [étape] sur l’écran.
    3. Fermer le couvercle et appuyer sur [Start check] sur l’écran.
    4. Après le pont les processus de numérisation, appuyer sur [suivant] sur l’écran.
    5. Vérifiez le contenu de l’affichage (type de kit, type de puce, puce plans d’ID, ID d’échantillon,), régler l’heure et appuyer sur [OK] sur l’écran.
  5. Après avoir terminé le chargement de la puce :
    1. Appuyer sur [suivant] sur l’écran et ouvrir le couvercle.
    2. Déchargé de la puce de séquençage de l’adaptateur de puce avec des mains gantées.
    3. Placer la puce dans le récupérateur, rap avec parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que la réaction de séquençage.
    4. Retiré la cartouche de l’enrichissement, plaque PCR, joint d’huisserie PCR, tube de récupération, cartouche de solution et cartouche de réactif de la position appropriée de l’instrument automatisé avec des mains gantées.
    5. Transférer une cartouche vide-pointe à la position de pointe des déchets de l’instrument automatisé avec des mains gantées.
    6. Appuyer sur [suivant] et fermer le couvercle.
    7. Appuyer sur [Start] et nettoyer l’instrument automatisé par rayons ultraviolets pendant 4 min.
  6. Dissoudre un comprimé de chlorite de sodium dans 1 000 mL d’eau ultrapure et solution de filtration avec une unité de filtrage de flux filtre 0,22 µm.
    1. Allumez l’appareil de séquençage.
    2. Toucher [Clean] et [suivant] sur l’écran de l’instrument de séquençage.
    3. Nettoyer l’appareil de séquençage avec 250 mL de solution de chlorite de sodium stérilisée par filtration et par la suite 250 mL d’eau ultrapure.
  7. Appuyer sur [Initialize] et sélectionnez le kit de séquençage approprié sur l’écran.
    1. Installer un expéditeur gris à l’endroit voulu avec des mains gantées.
    2. Initialiser l’instrument de séquençage avec la solution de lavage (fourni dans le kit), la solution de réglage du pH (contenant 350 µL d’hydroxyde de sodium de 100 mM) et la solution étalon de pH (fourni dans le kit).
  8. Ajouter 20 µL de dATP, la dCTP, dGTP et dTTP nucléotides (fourni dans le kit) en tubes de 50 mL (fournis dans le kit) avec une pipette 100 µL.
    1. Installer un expéditeur gris à l’endroit voulu avec des mains gantées.
    2. Charger le tube de 50 mL et visser sur l’appareil de séquençage.
    3. Appuyer sur le [suivant] sur l’écran pour commencer à l’étape d’initialisation, qui prend environ 25 min.
  9. Après avoir terminé l’étape d’initialisation :
    1. Appuyer sur [Run] sur l’écran et sélectionner l’instrument de préparation bibliothèque appropriée.
    2. Scanner le code-barres bidimensionnel de la puce.
    3. Insérez la puce de séquençage sur la position appropriée.
    4. Fermer la porte de pince et instrument de puce.
    5. Toucher [cocher puce], [page suivante] et [OK] sur l’écran pour lancer l’exécution de séquençage.
  10. Après la réaction de séquençage, transférer les données et exécuter le pipeline analyser les données sur le serveur de séquençage13,17.

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Résultats

La figure 1 montre l’ensemble du processus de préparation d’éprouvettes TIC à l’extraction de l’ADN. Notamment, la procédure prend deux jours seulement pour obtenir de l’ADN génomique provenant d’échantillons TIC. Nous avons évalué les effets de stockage de la tumeur avant le traitement de la diapositive. Nous avons constaté que les cellules tumorales étaient fixés sur la lame de verre lorsque des échantillons de tissus ont été immédiatement touchés sur le to...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons présenté une méthode alternative pour l’obtention de tumeur ADN des échantillons pathologiques cliniques utilisant les TIC. Préparation des TIC est très simple et nécessite moins de temps par rapport aux méthodes FFIP, sans la nécessité d’instruments spéciaux10. Toutes les procédures de la préparation de TIC à l’extraction de l’ADN peuvent être complétées dans les deux jours (Figure 1). Cette méthode raccourcit ainsi le délai d’exécution p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tout le personnel médical et auxiliaire de l’hôpital et les patients pour consentir à participer. Nous remercions Gabrielle White Wolf, Ph.d., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour éditer une ébauche du présent rapport. Cette étude a été financée par une subvention de Genome Research Project de la préfecture de Yamanashi (Y.H. et M.O.) et une subvention de la YASUDA Medical Foundation (Y.H.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FINE FROST white20 micro slide verreMatsunami Glass ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN Membrane Lames de verreThermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Quick A solutionMuto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B solutionMuto Pure Chemicals20581
May-Grunwald SolutionMuto Pure Chemicals15053
Giemsa solutionMuto Pure Chemicals15002
QIAamp DNA FFPE kit de mouchoirsQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents KitThermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate(s)Thermo Fisher Scientific4346907
MicroAmp Film adhésif optiqueThermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 Système de PCR en temps réelThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit de quantificationThermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress Adaptateurs de codes-barres 1-16 KitThermo Fisher Scientific4471250
Ion PGM Hi-Q View Kit de séquençage (base 200)Thermo Fisher ScientificA30044
Système Ion ChefThermo Fisher Scientific4484177
Veriti Thermocycleur 96 puitsThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle KitThermo Fisher ScientificA25591
Agencourt&trade ; AMPure&trade ; XP KitBeckman CoulterA63881
Support magnétique 16 positionsThermo Fisher Scientific4457858
Tubes Microfuge antiadhésifs, sans RNase, 1,5 mL (tube à faible liaison)Thermo Fisher ScientificAM12450
Eau sans nucléaseThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp&trade ; Plaques de réaction optiques à 96 puitsThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp&trade ; Film adhésif transparentThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt&trade ; AMPure&trade ; XP KitBeckman CoulterA63881
Éthanol(99.5)Nacalai Tesque08948-25
Hydroxyde de sodium (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipette Pipet-Lite LTS L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipette Pipet-Lite LTS L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
Pipette Pipet-Lite LTS L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
Pipette Pipet-Lite LTS L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
petit-changeWAKENMODEL8864Mini centrifugeuse
petit-incubateurWAKENWKN-2290Incubateur d’air
SensiCare Gants d’examen en nitrile non poudréMEDLINESEM486802
Gaze stérileOsaki11138
Réfrigérateur MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
PLUMEDE GARNITURE PLUMENo.130
PLUME DE GARNITUREPLUME PLUMENo.260
FEATHER SFEATHERFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458Mélangeur Vortex
PincetteNATSUMEA-5
1,5 mL microtubeBIOBIKRC-0150
DE

Références

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