Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide cryptococcique espèces et corps cellulaire

Résumé

Cette technique décrit un processeur d’image batch automatisé conçu pour mesurer les rayons de corps et de la capsule polysaccharidique. Initialement conçu pour les mesures capsules Cryptococcus neoformans , que le processeur d’image automatisé peut également s’appliquer aux autre détection de contraste basé des objets circulaires.

Résumé

Le but de cette technique est de fournir un processus cohérent, précis et facile à gérer pour un grand nombre de mesures capsule polysaccharidique.

Tout d’abord, une image de seuil est générée en fonction sur les valeurs d’intensité unique calculés pour chaque image. Puis, cercles sont détectés basée sur le contraste entre l’objet et l’arrière-plan à l’aide de l’algorithme de Transformation de Hough de cercle (CHT) bien établi. Enfin, les capsules de cellules détectées et les organes sont adaptées selon les coordonnées du centre et de la taille du rayon, et données sont exportées vers l’utilisateur dans un tableur facile à gérer.

Les avantages de cette technique sont simples mais importantes. Tout d’abord, parce que ces calculs sont effectués par un algorithme plutôt qu’un être humain l’exactitude et la fiabilité sont augmentés. Il n’y a pas de déclin dans l’exactitude ou la fiabilité peu importe combien d’échantillons est analysés. Deuxièmement, cette approche établit un mode opératoire normalisé potentiel pour le champ de Cryptococcus plutôt que de la situation actuelle où les capsule mesure varie selon le laboratoire. Troisièmement, étant donné que les mesures capsules manuelles sont lent et monotone, automation permet des mesures rapides sur un grand nombre de cellules de levure qui à son tour facilite l’analyse de données à haut débit et des statistiques de plus en plus puissants.

Les principales limites de cette technique viennent de comment les fonctions de l’algorithme. Tout d’abord, l’algorithme ne générera pas cercles. Alors que les cellules de Cryptococcus et leurs capsules prennent une morphologie circulaire, il serait difficile d’appliquer cette technique de détection d’objet non circulaire. Deuxièmement, en raison de comment sont détectées les cercles l’algorithme CHT peut détecter les énormes Pseudo-cercles basés sur les bords extérieurs de plusieurs cercles en cluster. Cependant, n’importe quel corps cellulaires dénaturés, pris dans le Pseudo-cercle de peut être facilement détectés et supprimés d’ensembles de données qui en résulte.

Cette technique est destinée à mesurer les capsules polysaccharidiques circulaire des espèces de Cryptococcus basés sur l’encre de Chine microscopie en champ clair ; Bien qu’elle pourrait s’appliquer aux autre contraste basé ses mesures objet circulaire.

Introduction

Cryptococcus neoformans est une levure pathogène trouvée partout dans le monde entier qui est associé à des maladies humaines, principalement dans les populations immunodéprimées. C. neoformans représente surtout une cause importante de décès annuels totales en Afrique subsaharienne à cause de maladies infectieuses¹. La principale manifestation clinique infection cryptococcique est une méningo-encéphalite, qui suit l’invasion du système nerveux central par les transports dans les macrophages infectés (manière de cheval de Troie) ou traversée directe de la barrière hémato - encéphalique. C. neoformans exprime plusieurs....

Protocole

1. préparation de l’encre de Chine diapositive

1. Déposer 10µl de cryptococcose échantillon sur une diapositive. Toute souche de levure circulaire va fonctionner, mais pour cette expérience H99 était la seule souche utilisée.
   Remarque : Si l’échantillon est directement à partir de milieux de culture, dilution 1:2 avec PBS ou l’eau peut empêcher l’encre de Chine de s’agglutiner.
2. Distribuer 2 µL de tache d’encre sur l’échantillon et mélanger en physiquement pousser l’embout de la pipette à l’échantillon et se déplaçant dans un mouvement circulaire jusqu'à ce que l’encre de Chine semble répartie de façon uniforme.
3. Placez un lamelle couvre-ob....

Résultats

Tout d’abord, les images sont obtenues en microscopie de diapositives d’encre utilisant un microscope à champ lumineux couplé avec un appareil photo (Figure 1A). Il est important d’avoir des cellules séparées et sa densité suffisamment faible ne pas de submerger le champ de vision, ainsi qu’à utiliser assez tache pour créer un contraste entre les cellules et l’arrière-plan. Comme indiqué dans le protocole, le nombre exact de cellules pour une.......

Discussion

Les étapes critiques de cette technique sont préparer la diapositive de l’encre de Chine et acquérir les images de microscope. Alors que l’algorithme a été testé avec succès avec une variété de techniques de diapositive et image le protocole recommandé est décrite dans ce manuscrit. La capsule de polysaccharide est détectée basée sur l’exclusion des particules d’encre du domaine de la capsule, puisque ces particules sont trop grosses pour pénétrer dans le réseau de fibrilles de polysaccharide. Exclusion de l’encre de Chi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Encre de Chine	Becton, Dickinson et Cie.
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Vernis à ongles	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 souche
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinué ; Microscope à fond clair
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Fin de série ; Appareil photo Microscope Accessoire
MATLAB	MathWorks	N/A	la plus récente recommandée
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 nécessaire ; 2.7 recommandée
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Version la plus récente recommandée
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813

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