Article de méthode

Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide cryptococcique espèces et corps cellulaire

7.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/56957

⸱

11 janvier 2018

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

Dans cet article

Résumé

Cette technique décrit un processeur d’image batch automatisé conçu pour mesurer les rayons de corps et de la capsule polysaccharidique. Initialement conçu pour les mesures capsules Cryptococcus neoformans , que le processeur d’image automatisé peut également s’appliquer aux autre détection de contraste basé des objets circulaires.

Résumé

Le but de cette technique est de fournir un processus cohérent, précis et facile à gérer pour un grand nombre de mesures capsule polysaccharidique.

Tout d’abord, une image de seuil est générée en fonction sur les valeurs d’intensité unique calculés pour chaque image. Puis, cercles sont détectés basée sur le contraste entre l’objet et l’arrière-plan à l’aide de l’algorithme de Transformation de Hough de cercle (CHT) bien établi. Enfin, les capsules de cellules détectées et les organes sont adaptées selon les coordonnées du centre et de la taille du rayon, et données sont exportées vers l’utilisateur dans un tableur facile à gérer.

Les avantages de cette technique sont simples mais importantes. Tout d’abord, parce que ces calculs sont effectués par un algorithme plutôt qu’un être humain l’exactitude et la fiabilité sont augmentés. Il n’y a pas de déclin dans l’exactitude ou la fiabilité peu importe combien d’échantillons est analysés. Deuxièmement, cette approche établit un mode opératoire normalisé potentiel pour le champ de Cryptococcus plutôt que de la situation actuelle où les capsule mesure varie selon le laboratoire. Troisièmement, étant donné que les mesures capsules manuelles sont lent et monotone, automation permet des mesures rapides sur un grand nombre de cellules de levure qui à son tour facilite l’analyse de données à haut débit et des statistiques de plus en plus puissants.

Les principales limites de cette technique viennent de comment les fonctions de l’algorithme. Tout d’abord, l’algorithme ne générera pas cercles. Alors que les cellules de Cryptococcus et leurs capsules prennent une morphologie circulaire, il serait difficile d’appliquer cette technique de détection d’objet non circulaire. Deuxièmement, en raison de comment sont détectées les cercles l’algorithme CHT peut détecter les énormes Pseudo-cercles basés sur les bords extérieurs de plusieurs cercles en cluster. Cependant, n’importe quel corps cellulaires dénaturés, pris dans le Pseudo-cercle de peut être facilement détectés et supprimés d’ensembles de données qui en résulte.

Cette technique est destinée à mesurer les capsules polysaccharidiques circulaire des espèces de Cryptococcus basés sur l’encre de Chine microscopie en champ clair ; Bien qu’elle pourrait s’appliquer aux autre contraste basé ses mesures objet circulaire.

Introduction

Cryptococcus neoformans est une levure pathogène trouvée partout dans le monde entier qui est associé à des maladies humaines, principalement dans les populations immunodéprimées. C. neoformans représente surtout une cause importante de décès annuels totales en Afrique subsaharienne à cause de maladies infectieuses1. La principale manifestation clinique infection cryptococcique est une méningo-encéphalite, qui suit l’invasion du système nerveux central par les transports dans les macrophages infectés (manière de cheval de Troie) ou traversée directe de la barrière hémato - encéphalique. C. neoformans exprime plusieurs facteurs de virulence, y compris la possibilité de répliquer à la température du corps humain, l’activité uréasique, mélanisation et formation d’une capsule polysaccharidique2. La capsule de polysaccharide est composée de répéter des glucuronoxylomannan et des polymères glucoronoxylomannangalactan et des fonctions comme une barrière protectrice contre les facteurs tels que le stress environnemental et hôte des réponses immunitaires2.

Bien que la taille de la taille de capsule polysaccharidique cryptococcique n’a pas toujours été associée avec virulence, il y a des preuves que c’est un facteur dans la pathogenèse2,3,4,5, 6,7. Taille de la capsule est associé à la méningite pathologie6, peut affecter la capacité des macrophages pour contrôler l' infection de Cryptococcus 5et peut causer une perte de virulence si absent8. Donc, Mensurations taille capsule sont communes dans la recherche de cryptocoque, mais il n’y a aucun fieldwide standard pour une méthode de mesure de la capsule.

Actuellement, c. neoformans polysaccharide capsule mesure repose sur des mesures manuelles d’images de microscopie, et les méthodes exactes des acquisitions d’image et de mesure varient selon les laboratoires9,10, 11. Une préoccupation immédiate à cette méthode, c’est que certaines études nécessitent l’acquisition de milliers de mesures individuelles, ce qui rend difficile la maintien de précision et de fiabilité. En outre, même lorsque les résultats sont publiés, il y a souvent une description insuffisante de la méthode de mesure. Nombreuses publications n’expliquent pas comment leurs mesures ont été obtenues, quel plan focal a été utilisé, comment ils ont déterminé le seuil pour l’identification des capsule, si ils utilisaient rayon ou le diamètre, ils ont utilisé une mesure ou était en moyenne de plusieurs, ou d’autres Détails. Certaines publications seul État leur méthode dans le programme qui a été utilisée, par exemple, « Adobe Photoshop CS3 a été utilisé pour mesurer les cellules »11. Ce manque de normalisation et des rapports de détail peut rendre reproductibilité difficile voire impossible. Différences de vue humaine, la luminosité de l’ordinateur, paramètres de microscope, faire glisser l’éclairage et autres facteurs peuvent varier non seulement entre les individus, mais entre les échantillons, alors que les calculs basés sur les rapports des valeurs d’intensité pixel reste constantes et Il y a lieu entre les échantillons. Cette technique a été générée dans le contexte de la fourniture d’une technique normalisée, précise, rapide et simple pour mesurer des tailles de capsules pour un champ dans lequel il n’y avait aucun avant.

Tel que mentionné précédemment, l’algorithme CHT est établie de longue date, et scripts pour détecter automatiquement les cercles ont été écrit avant. Cette méthode améliore dans deux domaines où les autres scripts tomberait courts. Tout d’abord, simplement détecter les cercles ne suffit pas, car avec les cellules cryptococciques deux cercles distincts doivent être constatées par rapport à l’autre. Cette méthode détecte spécifiquement corps cellulaires dans les capsules, établit une distinction entre les deux et effectue des calculs que sur les paires de corps-capsule pertinentes. En second lieu, même lorsque suivant le même protocole, les différents chercheurs finiront avec différents acquis des images. En permettant le contrôle de l’enquêteur sur chaque paramètre d’algorithme, cet outil peut être réglé pour correspondre à un large éventail de méthodes d’acquisition. Il n’y a pas besoin d’un cadre normalisé, objectif, filtre et ainsi de suite.

Cette technique peut être appliquée facilement à toute situation dans laquelle l’enquêteur doit détecter les cercles dans une image qui contraste avec leur fond. Les deux cercles plus légers et plus sombres que leur origine puisse être détectée, compté, mesuré à l’aide de cette technique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. préparation de l’encre de Chine diapositive

  1. Déposer 10µl de cryptococcose échantillon sur une diapositive. Toute souche de levure circulaire va fonctionner, mais pour cette expérience H99 était la seule souche utilisée.
    Remarque : Si l’échantillon est directement à partir de milieux de culture, dilution 1:2 avec PBS ou l’eau peut empêcher l’encre de Chine de s’agglutiner.
  2. Distribuer 2 µL de tache d’encre sur l’échantillon et mélanger en physiquement pousser l’embout de la pipette à l’échantillon et se déplaçant dans un mouvement circulaire jusqu'à ce que l’encre de Chine semble répartie de façon uniforme.
  3. Placez un lamelle couvre-objet sur l’échantillon en appuyant sur le bord gauche de la lamelle couvre-objet sur la surface de la diapositive, puis légèrement et uniformément abaissant l’autre côté de la lamelle couvre-objet sur l’échantillon.
  4. Permettre à la lame à l’air sec pendant 5 min.
  5. Exercez une légère couche de vernis à ongles à la frontière de la lamelle couvre-objet pour former un joint et préserver la tache d’encre de Chine.

2. imagerie Slide

  1. Placer les lames dans un microscope à champ lumineux avec une fixation de la caméra et connue pixel-à-micron conversion. Ajuster les filtres, objectifs et le contraste afin que les capsules de cellule sont claires et les corps cellulaires sont des bandes focalisées et sombres.
    NOTE : Les différents filtres, objectifs et paramètres de contraste vont travailler mais un 20 x objectif, filtre Ph1 et binning 2 x 2 est recommandé.
  2. Assurez-vous que le champ de vision est dense mais pas surpeuplée avec cellules cryptococciques, avec un contraste clair entre la capsule de la cellule et l’arrière-plan et correctement ciblée avec le corps de la cellule visualisé comme une bande sombre.
    Remarque : Le nombre exact de cellules pour une image optimale variera selon l’échantillon et l’objectif utilisé. Les aspects importants sont pour cellules ne soient pas en clusters ou qui se chevauchent, que les plans focaux de cellule ne varient pas significativement, et qu’il n’y a encre importante tachent bien visible à l’arrière-plan (au moins 25 % du champ).
  3. Enregistrer des images dans un répertoire unique avec des titres clairs, comme l’algorithme de mesure sera exécutée sur des images dans un répertoire unique et les données de sortie seront organisées selon les noms des fichiers image.

3. algorithme Setup

  1. Installez Python version 2.7 de
  2. Installer les bibliothèques supplémentaires python en exécutant les commandes « pip installer oreiller » et « pip install openpyxl ».
  3. Installer MATLAB en suivant les instructions à
  4. Construire la bibliothèque python MATLAB en suivant les instructions fournies à https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Télécharger les trois fichiers requis inclus dans documents de ce manuscrit complémentaires (« QCA.py », « Analysis2.m » et « TestRun.m »).
    Remarque : Ces fichiers peuvent être extraits à n’importe quel endroit, mais tous les trois doivent être dans le même répertoire.

4. utilisation de l’algorithme

  1. Exécutez l’application en double-cliquant sur QCA.py.
    Remarque : L’application peut prendre plusieurs minutes pour démarrer. Le fichier « QCA.py » contient la structure du programme qui appelle les « fichiers ".m" » pour exécuter l’algorithme réel.
  2. Suivez les étapes décrites dans le programme.
    1. Entrée précédée d’une période, le type d’extension des fichiers image et séparées par des points-virgules (ex. ». TIF ;. JPEG ») puis cliquez sur le bouton entrer .
    2. Choisissez le répertoire dans lequel se trouvent les fichiers d’image en cliquant sur le bouton Sélectionner le répertoire et sélectionner le dossier qui contient les images.
    3. Générer la liste des fichiers d’image dans le répertoire en cliquant sur le bouton Générer liste d’images . Les images apparaîtront dans la zone de texte vers la droite. Examiner et s’assurer de que la liste est exacts et complets.
    4. Sélectionnez une image au hasard dans la liste à utiliser comme un aperçu en cliquant sur le bouton Sélectionner une Image aléatoire .
      Remarque : Si l’image ne peut pas ouvrir en raison d’une « erreur de mode image incorrecte », l’algorithme encore fonctionnera correctement malgré ne pas afficher l’image. Après l’étape 4.2.7, affichera toujours l’image de test.
    5. Objectif de microscope et sélection des paramètres d’entrée. Si les paramètres par défaut ne correspondent pas au microscope utilisé, sélectionnez « Custom Pixel Conversion » et introduisez la conversion pixel-à-um pour les fichiers image. Une fois sélectionné, cliquez sur le bouton de Conversion de calculer et d’assurer que la conversion est correcte selon la zone de texte sur la droite.
      NOTE : Les images représentatives illustrés à la Figure 1 ont été calculés avec 40 x grossissement et 2 x 2 binning sélectionné.
    6. Entrée des paramètres de l’algorithme de détection de cercle.
      1. Le rayon minimal et maximal détectable pour la détection de capsule externe comme les entrées Min et Max Capsule rayon d’entrée. Une plage plus petite permet des résultats plus précis.
      2. Le rayon minimal et maximal détectable pour détection corps cellulaire comme les entrées Min et Max corps cellulaire rayon d’entrée.
        Remarque : Tous les quatre de ces entrées doivent être nombres représentant leurs valeurs respectives en pixels, selon les images de la source.
      3. Déplacez les curseurs de Capsule et de la sensibilité du corps cellulaire d’ajuster le seuil de sensibilité de l’algorithme. Une faible sensibilité sera stricte et réduire la détection de faux positifs cercle, mais peut aussi détecter des cercles réels moins. À l’inverse, une sensibilité élevée augmentera le taux de détection, mais peut aussi entraîner des milieux positifs fausses.
        NOTE : Résultats représentatifs ont été obtenus avec un rayon minimal de capsule de 7, rayon capsule maximum de 45, rayon de corps minimale de 4, rayon de corps maximale de 30, capsule sensibilité de 87 et sensibilité de l’organisme de 87.
    7. Tester les paramètres de l’image sélectionnée au hasard en cliquant sur le bouton Exécuter le Test . Les résultats seront affichés au centre supérieur de la programme pour remplacer l’image d’origine. Si les résultats semblent exacts, il est recommandé de sélectionner une image aléatoire supplémentaire pour faire ainsi en sorte que les paramètres sélectionnés seront adaptera à toutes les images sélectionnées.
      1. Maximiser le nombre de corps et capsules détectés et inspectent visuellement si les cercles apparaissent pour monter correctement. Le nombre de corps dans les capsules détectés s’affiche dans la zone de texte vers la droite. Jusqu'à ce que les résultats sont exacts, manipuler les paramètres d’algorithme.
        NOTE : Les cercles colorés épais sont uniquement pour aider à la visualisation. Les cercles réelles générées pour la mesure est une courbe mathématique calculée par l’algorithme HCT.
    8. Exécuter l’algorithme de détection sur tout le répertoire des fichiers d’image en cliquant sur le bouton Commencer l’analyse . Chaque image sera analysé et le programme affiche « fini » dans la zone de texte vers la droite lorsque toutes les images ont été analysées.
    9. Cliquez sur le bouton de nettoyage et Match . Cela correspond à des corps cellulaires détectés aux capsules détectés qu’ils résident dans et calculer le rayon vrai capsule en soustrayant le corps de la capsule.
      Remarque : Si l’algorithme est utilisé pour détecter la fluorescence ou une autre situation dans laquelle un seul cercle est détecté cette étape est inutile. Au lieu de cela cliquez sur les Seules les instances de tirer ou Seulement tirer les Capsules pour recueillir les données pour seulement le bleu ou seulement les cercles verts, respectivement. Il est important de noter que si seulement les données de la capsules sont récupérées le rayon réfèrera au rayon total de la cellule comme le rayon du corps cellulaire ne pourrait pas être soustraite.
    10. Localiser les données dûment remplies dans le fichier « CleanedOuput.csv » dans le répertoire de l’image. Si seulement un élément de données a été activée, le fichier sera intitulé « CleanedBodies.csv » ou « CleanedCapsules.csv ».

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Tout d’abord, les images sont obtenues en microscopie de diapositives d’encre utilisant un microscope à champ lumineux couplé avec un appareil photo (Figure 1A). Il est important d’avoir des cellules séparées et sa densité suffisamment faible ne pas de submerger le champ de vision, ainsi qu’à utiliser assez tache pour créer un contraste entre les cellules et l’arrière-plan. Comme indiqué dans le protocole, le nombre exact de cellules pour une...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les étapes critiques de cette technique sont préparer la diapositive de l’encre de Chine et acquérir les images de microscope. Alors que l’algorithme a été testé avec succès avec une variété de techniques de diapositive et image le protocole recommandé est décrite dans ce manuscrit. La capsule de polysaccharide est détectée basée sur l’exclusion des particules d’encre du domaine de la capsule, puisque ces particules sont trop grosses pour pénétrer dans le réseau de fibrilles de polysaccharide. Exclusion de l’encre de Chi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Anthony Bowen dont diapositives ont été utilisés comme une deuxième comparaison côte-à-côte humaine mais aussi Sabrina Nolan dont diapositives ont été utilisés comme un troisième homme side-by-side et la deuxième comparaison de microscope.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Encre de ChineBecton, Dickinson et Cie.
Fisherbrand Superfrost Microscope SlidesFisher Scientific12-550-14325x75x1
Fisherfinest Premium Cover GlassFisher Scientific12-548-B22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Vernis à onglesSally HansenN/A109 invisible
SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821H99 souche
Olympus AX70 MicroscopeOlympusAX70TRFDiscontinué ; Microscope à fond clair
Qimaging Retiga 1300QimagingN/AFin de série ; Appareil photo Microscope Accessoire
MATLABMathWorksN/Ala plus récente recommandée
Python Programming LanguagePythonN/AVersion 2 nécessaire ; 2.7 recommandée
Microsoft ExcelMicrosoftN/AVersion la plus récente recommandée
Phosphate Buffered Saline (PBS)SigmaP3813
261194 Version

Références

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Mesure de la capsule de CryptococcusAnalyse automatis e de la capsuleTransformation de Hough circulaireColoration l encre de ChineD tection du corps cellulaireAnalyse de la capsule polysaccharidiqueMicroscopie en champ clairSeuillage d imageAppariement du corps de la capsuleMesure haut d bit

Articles connexes