Article de méthode

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

DOI :

10.3791/56973

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8 mai 2018

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1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.

Résumé

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La possibilité d’étudier la genèse des cellules souches hématopoïétiques (CSH) durant le développement embryonnaire a été limitée par la rareté des précurseurs de l’HSC dans l’embryon précoce et le manque de tests qui fonctionnellement identifier le potentiel à long terme de la prise de greffe multilignée de précurseurs HSC putatifs individuels. Nous décrivons ici la méthodologie permettant l’isolement et la caractérisation des précurseurs d’HSC fonctionnellement validés au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, nous utilisons indice tri pour cataloguer le paramètre phénotypique précis de chaque cellule individuellement trié, en utilisant une combinaison de marqueurs phénotypiques d’enrichir des précurseurs de l’HSC avec des marqueurs supplémentaires pour l’analyse expérimentale. Deuxièmement, chaque cellule index-triées est co cultivée avec le stroma vasculaire niche de la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA), qui prend en charge la maturation des précurseurs des HSC non-faire une exception HSC fonctionnelle avec greffe multilignée, à long terme potentiel dans essais de transplantation. Cette méthodologie permet la corrélation des propriétés phénotypiques des précurseurs hemogenic clonale avec leur potentiel fonctionnel de greffe ou d’autres propriétés telles que profil transcriptionnel, fournissant un moyen pour l’analyse détaillée des précurseurs de l’HSC développement à l’échelle de la cellule unique.

Introduction

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Clonales études ont révélé une hétérogénéité dans les propriétés à long terme de greffe de CSH adultes, donnant un aperçu nouveau en sous-types HSC et changements dans le comportement HSC au cours du vieillissement1. Toutefois, des études similaires de CSH embryonnaires et de leurs précurseurs ont été plus difficile. Au début du développement embryonnaire, CSH proviennent d’une population de précurseurs connus hemogenic l’endothélium dans un processus transitoire visé à comme l’endothélium hématopoïétiques transition2. Le premier HSC, défini par leur capacité à fournir la greffe multilignée robuste, à long terme, suite à une transplantation en conditionné bénéficiaires adultes, ne sont pas détectées jusqu’après jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez l’embryon de souris, à très basse fréquence3 . Au cours de leur développement, précurseurs des HSC (pre-HSC) découlant de l’endothélium hemogenic doivent être soumis à maturation avant d’acquérir les propriétés de HSC adulte qui permettent une prise de greffe efficace en transplantation essais4,5 , 6. obscurcissant l’étude d’origine rare de HSC, une multitude de progéniteurs hématopoïétiques avec érythroïdes, potentiel myéloïde et lymphoïde sont déjà détectés avant l’émergence du HSC de pre-HSC7,8. Distinguer pré-HSC des autres progéniteurs hématopoïétiques requiert donc des méthodes pour isoler par clonage des cellules et de leur fournir les signaux suffisants pour leur maturation à HSC, de détecter leurs propriétés de greffe lors d’essais de transplantation.

Plusieurs approches ont été décrits qui permettait de détecter des pré-HSC de maturation en vivo ou ex vivo de HSC. Ex vivo méthodes ont compté sur la culture des tissus embryonnaires, telles que la région de l’AGM, où le premier HSC sont décelées dans développement9. S’appuyant sur ces méthodes, protocoles qui incorporent la dissociation, tri et re-agrégation des tissus AGM ont permis la caractérisation des populations triées contenant des précurseurs de l’HSC au cours du développement de E9.5 à E11.5 dans le para-aortique splanchnopleura (P-Sp) / AGM régions4,5,10; Cependant, ces approches ne sont pas disposés à haut débit analyse des précurseurs au niveau de la cellule unique requis pour l’analyse clonale. De même, in vivo la maturation par greffe sur des souris nouveau-nées, où le microenvironnement est censé mieux convenir à l’appui des premiers stades des précurseurs de l’HSC, a également permis des études de populations triées du sac vitellin et AGM / P-Sp (P-Sp est la région de précurseur à l’AGA) présentant des caractéristiques de pre-HSC, mais ces méthodes aussi ne parviennent pas à fournir une plate-forme robuste simple cellule analyse11,12.

Études de Mustafa et coll. ont démontré que cette stroma Akt-lancée de cellules endothéliales (EC) peut fournir un substrat de niche pour le soutien des adultes HSC autorenouvellement in vitro13,14,,15. Nous avons récemment déterminé que ce Akt-activé, dérivé de la région de l’Assemblée générale annuelle (AGM-EC) prévoit une niche adapté en vitro la maturation des précurseurs hemogenic, isolé dès E9 dans le développement, à faire une exception adulte HSC, ainsi que la suite l’auto-renouvellement de généré HSC16. Étant donné que ce système utilise une simple culture CO 2 dimensions, il est facilement adaptable pour analyse clonale du potentiel HSC des précurseurs hemogenic isolés individuellement.

Nous avons récemment rapporté une approche pour analyser le potentiel HSC des précurseurs hemogenic clonale en combinant indice tri des précurseurs chimiques individuels hemogenic embryons murins avec co-culture AGM-EC et les analyses fonctionnelles en transplantation des analyses de17. Index de tri est un mode de fluorescence-lancée de cellules triant (FACS) qui enregistre (index) tous les paramètres phénotypiques (c'est-à-direavant dispersion (FSC-A), côté scatter (SSC-A), fluorescence paramètres) de chaque cellule individuellement trié tel que ces caractéristiques peuvent être rétrospectivement corrélés ultérieures analyse fonctionnelle après tri. FACS logiciel enregistre les deux informations phénotypiques pour chaque cellule et la position/puits de la plaque à 96 puits dans lequel il a été placé. Cette technique a déjà été élégamment utilisée pour identifier l’hétérogénéité adulte HSC, déterminer les paramètres phénotypiques encore enrichissent pour le sous-ensemble après à long terme de HSC et corrèlent phénotypiques paramètres de HSC avec transcription Propriétés sur le single cell niveau18,19. Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée de cette approche qui permet l’identification des paramètres phénotypiques uniques et les contributions de la lignée de pre-HSC durant les premiers stades du développement embryonnaire.

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. préparation des AGM-EC monocouches de co-culture

  1. 24 h avant la dissection de l’AGA et trier, faire AGA-ce milieux de culture et filtre stériliser.
  2. Ajouter 0,1 % de gélatine dans l’eau (100 µL/puits) dans chaque puits d’une plaque 96 puits et incuber à température ambiante pendant 15 min. aspirer les feuilles de gélatine et laisser la plaque sous une hotte de culture tissulaire avec le couvercle retiré jusqu'à ce que les puits sont à secs.
  3. Dissocier les monocouches de AGM-EC et plaque pour plaques 96 puits.
    Remarque : Maintenir l’AGA-EC, préparée comme décrite précédemment16dans les milieux de culture AGM-ce. Par souci de cohérence, les lignées de cellules AGM-EC devraient être congelées dès qu’un nombre suffisant est obtenu (généralement le passage 1-3) et utilisées dans un certain nombre de passage défini (généralement le passage 5-12) pour des expériences de culture mixte. Lignées cellulaires AGM-EC sont dérivées de C57BL/6J (CD45.2) Assemblée générale annuelle. Consultez la Table des matières pour toutes les compositions de médias.
    1. Aspirer les médias de la culture de l’Assemblée générale annuelle-EC dans une fiole de2 75 cm et ajouter 5 mL de PBS. Aspirer les PBS et ajouter 3 mL de solution de trypsine (voir Table des matières).
    2. Incuber à 37 ° C pendant 2-4 min jusqu'à ce que la plupart des cellules sont soulever la plaque. Ajouter 7 mL de milieu de culture de AGM-EC et pipette 8 - 10 fois avec une pipette de 10 mL pour préparer la suspension de cellules individuelles et transférer dans un tube de 15 mL.
    3. Filer à 300 x g pendant 5 min, retirez le surnageant, remettre en suspension dans 10 mL de milieu de culture AGM-ce et estimer le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Diluer les cellules à une concentration de 1 x 105 cellules/mL dans les milieux de culture AGM-EC.
  4. Ajouter 100 µL AGM-EC cellule de suspension (1 x 104 cellules) dans chaque puits d’une plaque de 96 puits gélatinisée. Place dans un 37 ° C, 5 % CO2 vitroplants incubateur durant la nuit pour permettre à l’Assemblée générale annuelle-EC joindre et former une monocouche confluente.
    NOTE : Répartir uniformément le cellules stromales AGM-EC donc il n’y a limité la prolifération ou la cellule s’agglutiner pour co-culture optimale.
  5. Préparer la monocouche AGM-EC co-culture AGM.
    1. Le lendemain matin, préparer les milieux sans sérum AGM.
    2. À l’aide d’une pipette multicanaux 12 puits, retirez le support de culture de AGM-ce de l’AGM-EC et ajouter 200 µL/puits de médias AGM sans sérum sans cytokines laver par tout média résiduels contenant du sérum.
    3. Retirez le support et ajouter 200 µL/puits des médias AGM sans sérum avec les cytokines. Travailler rapidement en retirant et en ajoutant le support pour que la couche endothéliale n’est pas compromise ; par exemple, supprimer et rajouter une ligne de médias à la fois. Placer les plaques de 96 puits dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules embryonnaires sont prêts pour le tri.

2. préparation de la Suspension de la cellule unique de tissus embryonnaires murines

  1. Disséquer l’AGA dans chronométré de culture.
    1. Mis en place des accouplements chronométré pour générer des tissus embryonnaires de l’âge désiré.
    2. Récolte des embryons de femelles gravides à 9,5 à 11,5 jours post coitum (dpc), selon le stade de pre-HSC à analyser.
      Remarque : Les tissus embryonnaires sont récoltées de souris C57BL/6J (CD45.2), comme décrit précédemment et précisément mis en scène somite basé sur comte16. Nous avons mis l’accent sur l’analyse des populations de la région embryonnaire de l’AGA et son précurseur, le P-Sp, entre E9.5 à E11.5, basé sur la mise en scène du somite.
    3. L’Assemblée générale annuelle du20embryons de disséquer.
      Remarque : Les protocoles détaillés pour la dissection de l’AGM d’embryons murins ont été publiées par d’autres20. Alternativement, sac vitellin ou autres tissus était censées avoir pré-HSC activité pourraient également être analysés par cette méthode.
  2. Dissocier les tissus embryonnaires disséqués.
    1. Recueillir les tissus disséqués dans un tube conique 15 mL contenant 10 mL de PBS avec 10 % BF sur la glace. Gravité régler les tissus, aspirer le PBS/FBS et puis immédiatement ajouter 1 mL de collagénase de 0,25 % et la place dans un bain-marie à 37 ° C pendant 25 min.
    2. Ajouter 1 mL de PBS/10% FBS et pipette de 20 - 30 fois avec une pointe de pipette de 1 mL pour obtenir une suspension de cellules du même. Ajoutez 8 mL de PBS/10% FBS supplémentaire et centrifugeuse de cellules à 300 g pendant 5 min. éliminer le surnageant.

3. anticorps coloration des cellules embryonnaires murines

  1. Préparer le tampon de blocage pour la coloration des anticorps.
    1. Ajoute 1 mL de PBS avec 10 % de 10 µg/mL anti-souris CD16/CD32 (bloc de récepteur (FcR) Fc) et 1 µg/mL DAPI (stock 1 mg/mL H2O) FBS.
    2. Dresser dans une seringue de 3 mL et passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm pour stériliser. Resuspendre le culot cellulaire des tissus murins embryonnaires dissociées (de l’étape 2.2.2) dans le blocage de 500 µL de tampon et incuber sur glace pendant 5 min.
  2. Préparer le mélange d’anticorps17.
    1. Ajoutez le bloc de FcR de 10 µg/mL à 1 mL de PBS avec 10 % FBS et 10 µL de chaque anticorps anti-VE-cadhérine fluorochrome-conjuguées (CD144, voir la Table des matières) et les anticorps anti-EPCR fluorochrome-conjuguées (CD201, voir la Table des matières). Utiliser une dilution finale 1/100 d’anticorps sauf indication contraire basé sur les recommandations du fabricant ou selon les titrages.
      Remarque : Cette combinaison d’anticorps est utilisée pour définir les portes pour le tri, comme décrit ci-dessous (étape 4.2). Tri basé sur la co-expression de la VE-cadhérine et EPCR permet un enrichissement significatif pour la partie de cellules dérivées d’AGM contenant l’activité précurseur HSC, comme décrit précédemment17.
    2. Ajouter d’autres anticorps fluorochrome-conjuguées pour analyse phénotypique des précurseurs d’index-triées individuels.
      Remarque : Ces anticorps ne sont pas nécessairement utilisés pour la définition de gates pour le tri. Dans ce protocole d’échantillonnage, nous avons inclus des anticorps anti-CD41 PE conjugué et anticorps anti-CD45 FITC conjugué pour analyser l’expression relative de ces marqueurs hématopoïétiques, qui évoluent au cours de l’émergence des pré-HSC d’endothélium hemogenic4 ,5,16,17. Autres marqueurs d’intérêt peuvent être inclus comme vous le souhaitez. Échantillons colorés avec contrôles anticorps conjugué fluorochrome isotype sont utilisés pour définir des portes négatives et positives pour l’analyse.
    3. Dresser le mélange d’anticorps dans une seringue de 3 mL et passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm à stériliser. Ajouter 500 µL du mélange anticorps à la suspension de cellules dans un tampon bloquant, pipette pour mélanger et incuber sur glace pendant au moins 15-20 min.
  3. Laver les cellules colorées.
    1. Ajoutez 8 mL PBS/10% FBS. Centrifuger les cellules à 300 g pour 5 min, aspirer et remettre en suspension les cellules à pellets avec 1 mL PBS/10% FBS.
    2. Enlever les amas de cellules en pipettant également, la suspension cellulaire en établissant un plafond de crépine de cellule μm 35 sur un tube de 5 mL. Lavez le tamis cellulaire avec un autre 3 mL PBS/10% FBS. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min, aspirer, remettre en suspension dans 500 µL PBS/10% FBS et placer sur la glace jusqu'à FACS.

4. indice tri des précurseurs Hemogenic unique à 96 puits avec le Stroma AGM-EC pour co-culture

  1. Préparer la machine FACS pour le mode de la plaque et aligner le tri aux plaques de 96 puits selon les instructions du fabricant. Sélectionnez le mode de cellule unique et indice tri mode dans le logiciel pour les paramètres du masque pureté maximale et permettre l’acquisition des paramètres d’index de chaque cellule triée.
  2. Acquérir un échantillon de cellules de l’anticorps teinté d’échantillons pour définir des portes pour le tri.
    1. Charger l’échantillon de cellules colorées sur la machine de FACS et d’acquérir des cellules au débit le plus bas. Tracer les versets FSC-a SSC-A et sélectionnez un portail qui contient des cellules de taille variable (Figure 1 b) (qui est basé sur l’observation que l’activité pré-HSC est identifiée dans les cellules des profils de taille différente à l' AGM17). Tracer des versets FSC-a FSC-W et SSC-A versets SSC-W, puis sélectionnez portes d’exclure les doublets. Tracer ensuite FSC-a versets DAPI à la porte des cellules vivantes (négatifs pour DAPI) (Figure 1 b).
    2. Reporter les PECy7 (ou le fluorochrome concerné pour la tache de la VE-cadhérine) contre PerCP (ou le fluorochrome concerné pour la tache EPCR). La porte des cellules qui sont positifs pour la VE-cadhérine (qui comprend une population mixte de cellules endothéliales ainsi que les progéniteurs hématopoïétiques et pré-HSC de l’AGA) et qui ont une expression EPCR élevée (qui enrichit pour pre-HSC du P-Sp/AGM17). C’est la porte finale qui sera utilisée pour trier des cellules individuelles à l’étape 4.3 (Figure 1 b) de l’index.
    3. Parcelle de terrain supplémentaires fluorochromes utilisés pour la coloration.
      NOTE : Selon la sous-population à analyser, portes supplémentaires peuvent être définies selon la détection d’autres marqueurs inclus pour la coloration des cellules. Cependant, indice tri y permet l’enregistrement des paramètres fluorescents pour chaque cellule trié tels que ces paramètres peuvent être analysés a posteriori. Ainsi, aucun processus de blocage supplémentaire n’est nécessaire à ce stade. Pour toutes les configurations de FACS, échantillons colorées avec les anticorps unique doivent servir à régler la compensation, pour tenir compte des retombées dans l’émission de fluorochromes qui se chevauchent et avec des anticorps de contrôle isotype, pour tenir compte de la coloration de fond et de déterminer négatif/positif gates.
  3. Indice de trier les cellules AGM.
    1. Posez une plaque à 96 puits préparée avec le stroma AGM-EC dans les médias AGM sans sérum avec les cytokines (de l’étape 1.5.3) dans le bloc de la plaque de la machine de tri de FACs. Charge l’exemple et commencer l’acquisition de l’échantillon. Sélectionnez le mode de tri/single cell index et commencer sortingsingle cellules de 96-puits individuels. Utiliser le débit le plus bas pour minimiser les contraintes de cisaillement sur les cellules embryonnaires.
    2. S’assurer que tous les événements sont enregistrés pendant le tri d’index. Cette initiative permettra d’énumération du nombre total de cellules analysées dans la porte de tri relative aux 96 triés pour chaque nombre réels-puits, que pas tous les événements enregistrés seront triés à Herbert George wells.
    3. Une fois que les cellules ont été triés à une ensemble plaque 96 puits, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C, fixé à 5 % de CO2à culture de tissus. Répétez pour plaques supplémentaires requis par l’expérience.
    4. Cellules de co-culture individuellement trié à 96 puits contenant des AGM-EC (de l’étape 4.3) jusqu'à 7 jours (5 jours pour les cellules triés d’embryons E11-11,5, 6jours E10-10,5 embryons, de 7 jours à partir d’embryons E9-9,5). Visualiser les colonies hématopoïétiques de différentes tailles et morphologies avec un microscope inversé au grossissement X 100 (Figure 2 b) après la période de culture mixte.
      NOTE : Les médias n’a pas à être changé pendant la période de culture mixte. Tri hemogenic précurseurs peuvent intégrer au départ de la couche de AGM-EC avec une morphologie de type EC et ne peut pas être initialement distingué de stroma AGM-EC (Figure 2 a). Toutefois, suivant 24-48 h en co-culture, petite, arrondies des cellules hématopoïétiques ou amas de cellules peuvent être détectées. À la fin de co-culture (5-7 jours), des colonies de cellules hématopoïétiques peuvent être visualisées dans le sous-ensemble de 96 puits ayant reçu une cellule triée avec potentiel hématopoïétique clonale. Si visuellement inspectés puits contiennent plus d’une colonie distincte, alors cet échantillon est exclu de l’analyse en aval d’exclure les échantillons ayant subi plusieurs cellules triées par puits.

5. analyse clonale progéniture hématopoïétiques suite co-culture

  1. Récolte de clones de 96 puits chacun pour l’analyse des FACS.
    1. Vigoureusement pipette de dissocier les cellules hématopoïétiques de couches endothéliales à l’aide d’une pipette multicanaux avec pointes de pipette 200 µL. Essayez de ne pas dissocier la couche endothéliale. Retirer 100 µL (environ 50 % de l’échantillon) pour une analyse phénotypique de la progéniture hématopoïétique de FACS.
    2. Transférer sur une plaque de fond en V 96 puits et centrifuger à 300 x g pendant 2 min granuler les cellules. Retirez le support effleurement des médias de la plaque avec un seul mouvement rapide tandis que la plaque est inversée (mettez la plaque).
    3. Placer le reste des 100 cellules µL dans la plaque à 96 puits originale dans une utilisation incubatorfor de 37 ° C dans l’essai de greffe ultérieure (étape 6).
  2. Incuber les cellules avec les anticorps appropriés pour l’analyse hématopoïétique.
    1. Remettre en suspension les granules cellulaires dans chaque puits de 96 puits V fond avec 50 µL de FBS PBS/2% contenant le bloc de FcR de 10 µg/mL et 1 µg/mL DAPI. Incuber les plaques à 4 ° C pendant 5 min.
    2. Ajouter 50 µL de FBS PBS/2% contenant le bloc de FcR de 10 µg/mL et un mélange d’anticorps pour l’analyse de l’HSC contenant PE-Cyanine7-conjugué anti-VE-cadhérine, PerCP-conjugué anti-CD45, PE-conjugué anti-EPCR, APC conjugué anti-Sca1 et conjugué FITC anti-Gr1 et anti-F4/80 (chaque anticorps à une dilution au 1/100 final sauf indication contraire fondée sur les recommandations du fabricant, ou selon les titrages). Incuber les plaques à 4 ° C pendant au moins 20 min.
  3. Éliminer les anticorps non lié avec dilution séquentielle et d’analyser les cellules.
    1. Ajouter 200 µL/puits PBS/2% FBS et centrifuger à 300 x g pendant 2 min granuler les cellules. Ensuite, balayez plaque pour éliminer le surnageant et ajouter 200 µL PBS/2% FBS chaque culot cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 2 min granuler des cellules.
    2. Feuilleter la plaque pour éliminer le surnageant et ajouter 50 µL/puits PBS/2% FBS pour analyse. Continuer d’analyser les cellules par FACS à l’aide d’un cytomètre en flux équipé d’un lecteur.
      NOTE : Acquérir un volume fixe de cellules (par exemple, 35 µL de la 50µl totale utilisée pour la remise en suspension) pour énumérer les sous-ensembles de la progéniture hématopoïétique.
  4. Analyser les données de FACS pour chaque cupule contenant la progéniture hématopoïétique pour dépister les colonies qui contiennent HSC potentiel (Figure 3).
    1. Porte tout d’abord la population positive CD45 qui est négative pour les marqueurs myéloïdes Gr1 et F480. Porte pas les cellules qui expriment encore des niveaux faibles de la VE-cadhérine. Les cellules de la couche de AGM-EC qui sont perturbées pendant la récolte des colonies hématopoïétiques sont VE-cadhérine positif et négatif de CD45.
    2. Porte de CD45+VE-Cad- / lowGr1 cellules F4/80– –plus loin sur le sous-ensemble qui expriment des niveaux élevés de EPCR et Sca1 (Figure 3 a -C).
      Remarque : dans les études antérieures, les colonies dépourvu de cellules avec CD45+VE-Cad- / lowGr1––de F4/80 Sca1SalutEPCRSalut phénotype (Figure 3D) façon reproductible n’a pas détectable greffe de sang périphérique multilignée souris irradiées de destinataire17 (données non présentées) ; ainsi, ces colonies ne doivent pas être inclus dans l’analyse de transplantation ultérieure à l’étape 6.

6. analyse des propriétés de la greffe de Clones individuels et corrélation avec les propriétés phénotypiques élucidées par le tri de l’Index

  1. Le jour de (si possible) ou le matin suivant l’analyse phénotypique à l’étape 5, remis en suspension le reste des 100 cellules µL de chaque 96 puits contenant des colonies hématopoïétiques après culture mixte (de l’étape 5.1) par pipetage vigoureux à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.
  2. Préparer et ajouter des cellules de sauvetage de toute la moelle osseuse de la souche congéniques B6. SJL-PtprcunPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) chez la souris adulte16,17.
    1. Compter les cellules nucléées de moelle osseuse en solution de Turcs sous un hémocytomètre. Diluée à une concentration de 5 x 105 nucléées cellules/mL dans du PBS contenant 2 % FBS.
    2. Ajouter 100 µL de cellules de moelle osseuse de sauvetage (5 x 10,4) dans chaque cupule contenant hématopoïétique progéniture pour l’analyse de la transplantation et la composition de pipetage.
  3. Transplanter la progéniture des clones individuels dans une souche unique congéniques destinataire mortellement irradiés B6. SJL-PtprcunPepcb/BoyJ (CD45.1 B6) souris adulte.
    1. Mortellement irradient le même nombre de souris B6 CD45.1 que le nombre de clones d’injecter individuellement les descendants d’un seul clone (à l’aide de 1 000 cGy provenant d’une source de césium).
    2. Tirage 200 µL de la suspension cellulaire totale (y compris les cellules du clone et cellules de moelle osseuse de 5 x 104 CD45.1 B6 sauvetage) dans une seringue à insuline ½ mL avec une aiguille de ½ pouce de 29 G.
    3. Mortellement irradient B6 CD45.1 bénéficiaires adultes 2 à 24 heures avant d’injection.
    4. À l’aide d’une drisse de souris en plastique qui permet d’accéder de la queue, injecter par le volume de 200 µL de veine de queue contenant les cellules de chaque clone et cellules 5 x 104 CD45.1 B6 la moelle osseuse adulte sauvetage pour aider à la survie de destinataire.
    5. Étiquette d’oreille et peser les souris bénéficiaires et vérifier leur poids/santé à intervalles réguliers (par exemple, 3 - 4 fois / semaine post irradiation/transplantation, ou par des modes opératoires normalisés institutionnels) pour assurer la bonne santé.
  4. Effectuer une analyse de prise de greffe de sang périphérique à intervalles réguliers (par exemple, 2, 16, 24 semaines) suite à une transplantation.
    1. Enlever 50-100 µL de sang via la rétro-orbitaire saigner ou toute autre méthode de laisser de sang approuvés sur le plan éthique.
    2. Ajouter 3 mL de tampon de lyse (16,6 g NH4Cl, 2 g de NaHCO3 et 74,4 mg EDTA à 2 L H2O) au sang et incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. aspirer et Resuspendre le culot avec 2 mL PBS/2% FBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
    3. Resuspendre le culot avec 150 µL PBS/2% BF 10 µg/mL FcR bloc conteneur et 1 µg/mL DAPI et verser 1/3 du volume d’un bien contenant 50 µL isotype des contrôles pour les donateurs et la lignée, 1/3 à un anticorps de 50 µL contenant bien pour les donateurs et isotype contrôles pour lineage et 1/3 dans une cupule contenant 50 µL anticorps pour détecter les pays donateurs et lignée.
      Remarque : Les anticorps pour la détection de prise de greffe multilignée : APCeFluor780 conjugué anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-conjugué anti-CD45.1, conjugué FITC anti-CD3, PE-conjugué anti-F4/80, PerCP-conjugué anti-Gr1 et APC conjugué anti-CD19, ou contrôles pertinents isotype.
    4. Identifier des clones avec greffe à long terme en évaluant l’apport de sang périphérique de FACS au fil du temps de CD45.2 (donateur)-dérivé des cellules hématopoïétiques myéloïdes (Gr1 et/ou F4/80 positif), cellules B (CD19 positif) et la cellule T (CD3 positifs) (Figure 4 a -B).
      NOTE : Prise de greffe hématopoïétique peut également être analysé par CD45.2 (donateur)-dérivé contribution aux populations hématopoïétiques tissus récoltés de la moelle osseuse, rate, thymus et le péritoine, ou à la suite secondaire de transplantation de cellules de moelle osseuse chez des souris B6 CD45.1 pour analyser les propriétés de greffe série17.
  5. Corrélation entre les caractéristiques phénotypiques de chaque clone tel que déterminé par l’indice initial seule cellule Tri avec ses propriétés de greffe. À l’aide du logiciel d’analyse de flux, télécharger des paramètres de tri pour chaque cellule index-triées (en corrélation avec le 96 puits à laquelle il a été trié). Carte des données fonctionnelles sur les parcelles de flux pour évaluer les propriétés phénotypiques des cellules individuelles en ce qui concerne leur sortie fonctionnelle (par exemple, à long terme, multilignée greffe) (Figure 4).

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Résultats

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Figure 1 a montre une représentation schématique du plan expérimental. Une fois que les tissus P-Sp/AGM sont disséqués, mis en commun et dissociées dans collagènase, elles sont tachées avec anticorps anti-VE-cadhérine et EPCR pour le tri des index. Pre-HSC sont plus riches en cellules triées à la VE-cadhérine+EPCRélevé (Figure 1 b). Autres anticorps conjugués fluorochrome peuvent être incluses pour analyser ...

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Discussion

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L’étude de la genèse de la HSC durant le développement embryonnaire nécessite des moyens pour détecter les potentiels des précurseurs hemogenic manque encore la compétence pour fournir à long terme multilignée reconstitution hématopoïétique chez les receveurs adultes transplantés HSC. Dans ce protocole, nous présentons un test clonal des hemogenic embryonnaires précurseurs par co-culture stromal sur niche vasculaire ECs de l’AGA, qui favorise la maturation des précurseurs des HSC, avec analyse fonctionnelle lors d’essais...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Andrew Berger, Stacey Dozono et Brian Raden INSEREE dans le Fred Hutchinson Flow Cytometry d’assistance avec FACS. Ce travail a été soutenu par l’instituts nationaux de santé NHLBI UO1 grant #HL100395, auxiliaires Collaborative Grant #HL099997 et NIDDK accordent #RC2DK114777. Brandon Hadland est supporté par l’Alex Lemonade Stand Fondation et Hyundai Hope sur roues Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieux de culture AGM-EC
Matériaux pour la culture de cellules endothéliales
TrypLE ExpressGibco12605-028Utilisation pour dissocier les monocouches AGM-EC
Gélatine 0,1 % dans l’eauStemCell Technologies7903Utilisation pour faire adhérer les monocouches AGM-EC sur le plastique
Plaques de culture tissulaire à 96 puitsCorning3599À utiliser pour la co-culture de monocouches AGM-EC et de clones triés par index
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144pour la dissection et la coloration FACS
Flacons filtrants de 500 mlFisher Scientific9741202Utilisation pour le filtre stérile Média endothélial
Milieu de culture AGM-EC (500 ml)
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Bovin SerumFisher ScientificSH30088.03100 mls
Penicillin StreptomycinGibco15140-1225 mls
HeparinSigmaH314950 mg dissous dans 10 mls de
milieu L-glutamine (200 mM)StemCell Technologies71005 mls
Endothélial Mitogen (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Ajouter 10 mls de milieu à dissoudre et ajouter
Matériaux pour l’indice AGM
Collagénase (0,25 %)StemCell Technologies7902Utilisation pour la dissociation des tissus embryonnaires
Seringue de 3 mlBD Biosciences309657Utilisation pour des solutions d’anticorps filtrants stériles pour FACS
0.22 et micro ; Filtre à seringueMilliporeSLGP033RSUtiliser pour filtrer stérilement les solutions d’anticorps pour FACS
Tube en polystyrène de 5 ml avec capuchon de filtreCorning352235Utiliser pour éliminer les amas cellulaires avant l’utilisation de FACS
DAPI (préparé sous forme de stock de 1 mg/ml dans H2O)Millipore268298Utiliser pour exclure les cellules mortes du tri
anti-souris CD16/CD32 (bloc FcR)BD Biosciences553141Utilisation pour bloquer la coloration non spécifique aux récepteurs Fc
Anticorps pour le tri de l’indice AGM
Anti-souris CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82Coloration du
rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7eBioscience25-4301-81Contrôle isotype pour CD144 PE-Cyanine7
Anti-souris CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Coloration
du rat IgG2b kappa Contrôle de l’isotype, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Contrôle de l’isotype pour CD201 PerCP-eFluor710
Anti-souris CD41 PEBD Biosciences558040Coloration
du rat IgG1 kappa Contrôle de l’isotype, PEBD Biosciences553925Contrôle de l’isotype pour CD41 PE
Anti-souris CD45 FITCeBioscience11-0451-85Coloration du
rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCeBioscience11-4031-81Contrôle isotypique pour CD45 FITC
AGM-sérum free media (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
facteur de cellules souches murines recombinantes (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml stock) Concentration finale 100 ng/ml
Ligand FLT3 humain recombinant (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml stock) Concentration finale 100 ng/ml
Thrombopoïétine humaine recombinante (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml stock) Concentration finale 20 ng/ml
interleukine-3 murine recombinante (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml de stock) Concentration finale 20 ng/ml
Matériaux pour la coloration des cellules co-cultivées
96 plaque de puits, V-bottomCorning3894Utilisation pour l’analyse FACS
Antibodies pour l’analyse de clones triés index co-cultivés avec des cellules endothéliales
Anti-souris CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82Coloration du
rat IgG2b kappa Contrôle des isotypes, PE-Cyanine5.5eBioscience35-4031-80Contrôle des isotypes pour CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-souris CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Coloration du
rat IgG2b kappa Contrôle des isotypes, PEeBioscience12-4031-81Contrôle des isotypes pour CD201 PE
Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83Coloration
rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, APCeBioscience17-4321-81Contrôle de l’isotype pour Ly-6A/E APC
Anti-souris F4/80 FITCeBioscience11-4801-81
du rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, FITCeBioscience11-4321-41Contrôle de l’isotype pour F4/80 FITC
Anti-souris Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Coloration
rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCBD Biosciences556923Contrôle isotypique pour Ly-6G/C et CD3 FITC
Matériaux pour l’injection de la veine caudale pour la transplantation Seringues à insuline
1/2 ml avec aiguilles 29G 1/2"BD Biosciences309306Utilisation pour l’injection de la veine caudale pour la transplantation
Anticorps pour l’analyse du sang périphérique après translant
Anti-souris Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Coloration
du rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCPBiolegend400629Contrôle d’isotype
pour Ly-6G/C PerCP Anti-souris F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 ColorationRat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, PEeBioscience12-4321-80Contrôle de l’isotype pour F4/80 PE
Anti-souris CD3 FITCBD Biosciences555274Coloration
Anti-souris CD19 APCBD Biosciences550992Coloration du
rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, APCBD Biosciences553932Contrôle de l’isotype pour CD19 APC
Anti-souris CD45.1 (A20) PE-Cyanine7eBioscience25-0453-82Coloration
du rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81Contrôle de l’isotype pour CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-souris CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82Coloration
du rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Contrôle de l’isotype pour CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II avec logiciel DIVABD Biosciences
BD FACSCanto II avec lecteur de plaquesBD Biosciences
HémocytomètreFisherScientific S17040Pour le comptage
de cellules Pipette multicanauxFisher Scientific14-559-417Pour logiciel
d’analyse FACSde distribution FlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Utilisation cellulaire du Coloration du de cellules

Références

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Mots-clés

Hematopoietic Stem CellSingle Cell Index SortingEndothelial Cell Niche Co cultureEmbryonic HSC PrecursorsAorta gonad mesonephros AGMFlow Cytometry AnalysisClonal Hematopoietic AnalysisVascular Endothelial CadherinEndothelial Protein C ReceptorLong term Engraftment Potential

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