Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

Résumé

Un workflow semi-automatisé est présenté pour le séquençage des ARNr 16 s de lait maternel et d’autres types d’échantillons de faible biomasse ciblé.

Résumé

Études des communautés microbiennes sont multipliées avec le développement du séquençage relativement peu coûteux, rapide et haut débit. Cependant, comme avec toutes ces technologies, des résultats reproductibles dépendent un flux de travail de laboratoire qui intègre les contrôles et les précautions d’usage. Ceci est particulièrement important avec des échantillons de faible biomasse où la contamination ADN bactérien peut générer des résultats trompeurs. Cet article décrit un flux de travail semi-automatique pour identifier les microbes des échantillons de lait maternel à l’aide de séquençage ciblé de la région de V4 de l’ARN ribosomique (ARNr) 16 s sur une échelle de faible à moyenne throughput. Le protocole décrit la préparation de l’échantillon de lait entier, y compris : lyse, extraction des acides nucléiques, l’amplification de la région de la V4 du gène ARNr 16 s et préparation de bibliothèque avec des mesures de contrôle de la qualité de l’échantillon. Ce qui est important, le protocole et la discussion tenir compte des questions qui sont importantes pour la préparation et l’analyse des échantillons de faible biomasse, y compris les contrôles positifs et négatifs appropriés, enlèvement d’inhibiteur de la PCR, contamination des échantillons par environnement, réactif, ou sources expérimentales et des pratiques exemplaires expérimentaux visant à garantir la reproductibilité. Le protocole tel que décrit est spécifique aux échantillons de lait maternel, mais il est adaptable à nombreux types d’échantillons de faible et haute-biomasse, y compris les échantillons sur écouvillons, congelés soignée, ou stabilisés dans un tampon de préservation.

Introduction

Les communautés microbiennes qui colonisent les humains sont censées être d’une importance cruciale pour la santé humaine et les maladies qui influencent le métabolisme, développement immunitaire, susceptibilité à la maladie et les réponses à la vaccination et le médicament de thérapie^{1, 2}. efforts pour comprendre l’influence de la microflore sur la santé humaine actuellement mettent l’accent sur l’identification des microbes associés définis compartiments anatomiques(p. ex., peau, intestin, oral, etc.), ainsi que des sites localisés au sein ces compartiments^3,

Protocole

Pour toutes les étapes du protocole, portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté, et méthodes de prévention de contamination rigoureuses doivent être prises. Observer le flux de travail de pré-amplification zones de chantiers après amplification pour minimiser la contamination des échantillons de travail. Toutes les fournitures utilisées sont stériles, sans RNase, DNase, ADN et pyrogène. Toutes les pointes de pipette sont filtrés. Un diagramme des étapes protocole est fourni (Figure 1).

1. lyse de l’échantillon

NOTE : Lyse de l’échantillon et l’extra....

Résultats

Le protocole présenté ici comprend important contrôle qualité (CQ) des mesures pour s’assurer que la rencontre de données générées de repères pour le contrôle de sensibilité, spécificité et contamination protocole. Première étape QC du protocole suit amplification par PCR de la région de V4 16 s (Figure 2). 1 µL du produit PCR de chaque échantillon a été analysé par électrophorèse pour confirmer qu’il était dans la plage de la taille attendue de bp 315-450 (<.......

Discussion

Ciblée génération séquençage des ARNr 16 s est une technique largement utilisée, rapide pour microbiome caractérisation¹⁸. Cependant, de nombreux facteurs, y compris les effets du traitement par lots, contamination de l’environnement, cross-contamination des échantillons, sensibilité et reproductibilité peuvent nuire résultats expérimentaux et confondre leur interprétation^{7,19 , 20}. pour mieux faciliter l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AllPrep Mini Kit ARN/ADN	Qiagen	80204	Kit d’extraction d’ADN/ARN
Eliminase	Fisher Scientific	435532	RNase, DNase, décontaminant
ADN Thermo Mixer	Fisher Scientific		vortexer à température contrôlée
RLT plus	Tampon de lyse de thiocyanate de guanidinium Qiagen 1053393 / Partie du kit
Allprepß ;-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689-25ML-F	ß ;-ME est un agent réducteur qui dénaturera de manière irréversible les RNases en réduisant les liaisons disulfure
LME Beads	MP Biomedicals	116914050	tube à billes
QIAgen TissueLyzer	Qiagen	85300	kit d’adaptateur disrupteur d’échantillon automatisé
QIAshredder column	Qiagen	79654
	Tube microcentrifuge du fabricant du tube
QIAcube et articles en plastique associés	Qiagen	9001292	instrument automatisé de purification d’ADN/ARN
DNA exitus plus	Applichem	A7089	Solution de décontamination non enzymatique
EB Buffer	Qiagen	19086	Tampon d’élution
QIAgility et articles	en plastique associésQiagen	9001532	robot manipulateur de liquides
PCR eau	MO BIO	17000-5PRIME
HotMasterMix	Quantabio	2200400
Amorces inversées à code-barres	Eurofin	No Catalog #'s	designed and ordered
96 well PCR plate	USA scientific	1402-9708
Tapestation 2200 et articles en plastique associés	Agilent	G2964AA	analyseur automatisé de fragments d’ADN/ARN
Réactifs D1000 pour Tapestation	Agilent	5067-5585	Le tampon d’échantillon et l’échelle font partie de ce kit Kit d’élimination des
inhibiteurs de PCR OneStep	Zymo Research	50444470	l’élimination des inhibiteurs de PCR se fait selon les instructions du fabricant.
Kit de purification PCR QIAquick	Qiagen	28104	: purification des produits PCR à base de membrane de silice
Kit de dosage HS Qubit dsDNA Thermo	Fisher	Q32854	tampon de dilution à base de diméthylsulfoxyde et le colorant font partie de ce kit.
Fluorimètre Qubit	Thermo Fisher	Q33216
NanoDrop	Spectrophotomètre microvolume	Thermo Fisher
MiSeq 300 V2 kit	Illumina	15033624/15033626
MiSeq	Illumina	No Catalog #	Séquenceur de nouvelle génération

Tampon RB QIAgen en kit Kit de nettoyage de l’ADN Le