Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.
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Article de méthode
Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut
Dans cet article
Résumé
Résumé
La leucémie myéloïde aiguë (AML) est un hétérogène et si ne pas traitée, la maladie mortelle. C’est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie chez l’adulte. Au départ, AML est une maladie des cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques de leucémie et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches de la leucémie (LSC), avec cette cellule dynamique compartiment évoluer pour surmonter les diverses pressions de sélection imposée pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. Pour définir plus précisément la population de la LSC, l’ajout de CD90 et CD45RA permet la discrimination de la GPX normales et de cellules souches multipotentes dans le compartiment de cellules CD34 + CD38. Ici, nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée de plusieurs marqueurs LSC putatifs (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par cytométrie en flux multiparamétrique. De plus, nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes. Cette méthode de détection et de quantification de LSC putatif sont utilisables pour suivi clinique de la réponse de la chimiothérapie (i.e., maladie résiduelle), comme le LSC résiduelle peut provoquer une récidive AML.
Introduction
Leucémie myéloïde aiguë (LMA) est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie. Initialement, AML est une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. Récemment, clonale hétérogénéité de la population cellulaire blast a été établie essentiellement à l’aide de stratégies de séquençage (NGS) prochaines génération et montrant l’existence d’une évolution intra-clonale de cellules de tumeur1.
L’hétérogénéité s’étend à la prése....
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Protocole
Nous suivons les normes européennes pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique local (#3097-2015120414583482v3).
1. préparation de l’échantillon
- Recueillir la moelle osseuse (2 mL) de novo de AML dans des tubes contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique anticoagulant (EDTA) à une concentration de 1,8 mg / mL de moelle osseuse.
- Effectuer la séparation de Ficoll, une séparation de gradient de densité à isoler des cellules mononucléaires de globules rouges et des granulocytes, comme suit. Diluer la moelle osseuse en 3 volumes de solution saline ....
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Résultats
Nous présentons ici une méthode pour déterminer les populations de souches dans des échantillons de la moelle osseuse humaine normaux et malins. Nous prélevé un PDX réussie de la moelle osseuse et la rate et cytométrie multiparamétriques comme décrit ci-dessus. Nous avons comparé plusieurs sous-populations de cellules blastiques entre le sérum du patient diagnostique et le PDX correspondante et en particulier, le compartiment de CD34 + CD38-géniteur, notamment enrichis en LSC putatif. Nous avons trouvé que la fraction de.......
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Discussion
Une évaluation précise et reproductible de membrane ou de marqueurs cytoplasmiques par cytométrie nécessite que les paramètres de l’instrument sont vérifiés tous les jours pour un alignement optique, bon fonctionnement du systeme fluidique, sensibilité optique et normalisation à l’aide de perles de calibration.
Détection des populations cellulaires blast AML utilisant CD90 et CD45RA par analyse en cytométrie en flux multi paramétrique est une méthode relativement simple et fiable. Une étape cr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par le Français Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centre Nord), Fondation de France (Comité de leucémie), SIRIC Oncolille et Français du National Cancer Institute.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| Tampon de lyse des globules rouges (10x) | Ozyme | BLE420301 | solution de lyse des globules rouges A : 8,29 g de NH4Cl + 0,037 g de Na2EDTA dans 100 mL de solution stérile de H2O et de lyse des globules rouges B : 1 g de KHCO3 dans 100 mL de H2O |
| NOD/SCID/IL2R&gamma stériles ; cnull ; (NSG) ; souris | JACKSON LABORATORY | N° de commande : 005557 | |
| PBS | Gibco par life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer &ndash ; Tampon de séparation MACS | Tampon MACS Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) ; | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow ; | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep kit de sélection PE humain | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep ; aimant ; | Technologies des cellules souches | 18551 |
Références
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One.
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Réimpressions et autorisations
