L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est un épithélium multifonctionnel de le œil. Nous présentons ici un protocole visant à mettre en place des cultures de cellules primaires provenant de la RPE murine.
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Article de méthode
Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est un épithélium multifonction hautement polarisé qui se trouve entre la rétine neurale et la choroïde de le œil. C’est une simple feuille de cellules pigmentées qui sont hexagonal emballés et reliés par des jonctions serrées. Les principales fonctions du RPP comprennent l’absorption de lumière, phagocytose des segments extérieurs cabanon photorécepteur, spatial tamponnage des ions, transport des nutriments, des ions et l’eau ainsi une participation active dans le cycle de visuel. Avec ces fonctions importantes et diverses, il est essentiel d’étudier la biologie des cellules RPE. Un certain nombre de lignées de cellules RPE ont été établi ; Cependant, les cellules immortalisées et repiquées sont connus rapidement perdre certaines caractéristiques morphologiques et physiologiques des cellules naturelles de RPE. Ainsi, les cellules primaires sont plus adaptés pour l’étude des différents aspects de la biologie cellulaire RPE et fonction. Culture de cellule pre primaire de souris est très utile pour les chercheurs car les modèles murins sont largement utilisés dans les études biologiques, cependant RPE de recueillir les cellules de souris est également très difficile en raison de leur petite taille. Nous présentons ici un protocole pour l’établissement de cultures de cellules de souris primaire RPE qui comprend l’énucléation et la dissection des yeux et l’isolement des feuilles RPE à produire les cellules de culture. Cette méthode permet une récupération efficace cellule. Les cellules RPE deux souris peuvent atteindre confluence sur un insert de membrane polyester 12 mm pré-chargés dans la plaque de culture après une semaine de la culture et Visualisez quelques-unes des propriétés originales de RPE véritable cellules telles que la forme hexagonale et la pigmentation après deux semaines de culture.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est une seule couche de cellules épithéliales polarisées qui se trouve entre la rétine neurale et la choroïde de le œil. La fonctionnalité des cellules RPE et l’intégrité de la monocouche RPE sont critiques pour la vision car le RPE joue un rôle majeur dans plusieurs processus comme le maintien de la barrière de sang-rétinienne externe, de l’eau et des ions entre la rétine et la choroïde, légère absorption, protection contre le stress oxydatif, la régulation du métabolisme des rétinoïdes et phagocytose des segments externes des photorécepteurs1,2. L’emplacement de la RPE à l’arrière de le œil, ainsi que sa fonction de barrière empêchant les médicaments administrés systématiquement de passer du sang à l’humeur vitrée, il est difficile d’étudier la complexité de la RPE function in vivo. Ainsi, il y a un grand besoin de la mise en place de cultures de cellules RPE pour étudier les cellules RPE dans un environnement contrôlé flexible3,4.
Un certain nombre de lignées de cellules RPE établies existe, fournissant un moyen simple et commode d’obtenir et de stocker les cellules ; Cependant, les cellules repiquées ont quelques inconvénients par rapport aux cellules primaires2,3,4. Tout d’abord, ils sont souvent caractérisés par des changements dans la morphologie des cellules. Par exemple, aucun des lignées cellulaires existants ont été trouvés pour convenir à une étude fiable des propriétés barrière RPE en raison de la perte du phénotype de polarité cellulaire et la disparition partielle des jonctions serrées,4. Outre la perte de polarité et les connexions appropriées de cellule-cellule, les lignées de cellules RPE perdent rapidement leur pigmentation en raison de l’absence des enzymes clés mélanogénèse dans les adultes pre5. La pigmentation peut être restaurée, mais l’analyse approfondie du mécanisme de la re-pigmentation qui comprend une combinaison de microscopie électronique à transmission, gene expression analyse et chimique tests pour confirmer la présence de mélanine n’a jamais été effectué6. Une des limitations plus sont que les lignées de cellules RPE cellule longue vie (parfois - l’immortalité) et sous certaines conditions peuvent se transformer en l’autorenouvellement des cellules souches multipotentes qui en détacher le substrat et la forme flottante colonies7, 8. cette limitation, il est impossible d’utiliser les lignées cellulaires pour des expériences de transplantation3.
Considérant les inconvénients des lignées cellulaires établies RPE, les cultures primaires de cellules RPE obtenus à partir des tissus frais pourraient servir un modèle biologiquement plus pertinent d’étudier la RPE. Des cellules primaires de RPE ont été utilisés non seulement pour étudier les fonctions pre-spécifiques tels que le métabolisme de vitamine A9, phagocytose des photorécepteurs segments externes10 et ion transport11, mais aussi d’étudier la biologie de la cellule de base tels qu’épithéliales cellule polarité2 , homéostasie lysosomal et autophagie12,13.
Dans les deux dernières années, il y a eu un certain nombre de publications sur l’établissement des cultures primaires de RPE, ce qui indique un intérêt croissant dans ce domaine de recherche3,14,15. Nombreux protocoles pour les cellules humaines de RPE et cellules RPE non humains tels que les cellules RPE bovines et porcines ont été publiés16,17,18,19. Toutefois, il est plus difficile à gérer les cellules de souris RPE en raison de leur taille beaucoup plus petite. Même si un grand nombre de publications ont décrit des protocoles visant à isoler les cellules RPE de la souris14,20,21, il y a encore beaucoup de chercheurs qui luttent pour isoler les cellules RPE sans contamination des cellules choroïdes ou cellules des débris de la rétine neuronale. Nous présentons ici le protocole pour l’établissement principal de culture de cellules RPE, y compris l’obtention aux yeux de la souris, la dissection des yeux et l’isolement des feuilles RPE à produire les cellules de culture de la souris. Ce protocole vidéo serait particulièrement utile pour les chercheurs qui commencent à travailler avec les cultures primaires de RPE de souris et besoin de conseils sur les techniques de dissection.
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Protocole
Procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l’utilisation Comité (IACUC) à l’Université de Pittsburgh et d’institutionnels animalier
1. préparer des solutions
- Préparer le milieu de croissance en complétant Dulbecco Eagle modifié (DMEM), hyperglycémie avec 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % pénicilline/streptomycine, 2,5 mM de L-glutamine et 1 x MEM acides aminés non essentiels. Réchauffez les médias dans incubateur à 37 ° C avant utilisation.
- Préparer la solution de travail de 2 % (wt/vol) a II :
- Préparer une solution d’a 100 mg/mL II en dissolvant 30 mg d’a II à 300 µL HEPES salin (50 millimètres HEPES/KOH pH 7,4, NaCl 150 mM). Ce volume est pour 3-4 souris, il peut être mis à l’échelle ou en bas selon le nombre de souris pour l’expérience). Ce stock peut être conservé pendant au moins 1 semaine à 4 ° C.
- Préparer la solution de travail de 2 % a en ajoutant 300 µL de la 100 mg/mL stock II a à 1,2 mL de DMEM stérile, hyperglycémie et la solution de filtrage à travers un filtre à 0,22 µm. Cette étape doit être exécutée dans le flux laminaire dans des conditions stériles. Réchauffez l’a préparés II dans incubateur à 37 ° C avant utilisation.
2. obtenir les yeux de souris
- Euthanasier la souris à l’aide de toute méthode approuvée et placez-le sur un tampon absorbant.
- Porter des gants, mettre le pouce et l’index autour de le œil et poussez doucement la peau pour proptose le globe oculaire.
- Insérez la pointe d’angle ciseaux entre la peau et le globe oculaire et découper soigneusement le œil. Pour éviter toute contamination, brièvement tremper le œil dans l’éthanol à 70 %.
- Placer immédiatement le œil dans le tampon Phosphate salin (PBS) dans une boîte de Pétri.
- Répétez les étapes 2.2 à 2.4 pour enlever le deuxième œil.
3. dissection de l’oeil
- Retirer soigneusement du tissu conjonctif de le œil sous le microscope à dissection. Cela peut être fait soit dans du PBS, soit sur le plat de Pétri sec.
- Pinces à suture permet de soulever les tissus conjonctif de le œil et découpez-les à l’aide de ciseaux de Vannas. Ne pas couper la sclère parce qu’il est pratiquement impossible d’obtenir les œilletons postérieurs intacts si la sclère est coupée.
- Après le nettoyage du tissu conjonctif, garder les globes oculaires résultants dans du PBS pour la prochaine étape de lavage.
Remarque : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans le flux laminaire dans des conditions stériles.
- Laver les yeux deux fois au pré chauffé à 37 ° C DMEM (hyperglycémie). Transvaser avec soin les globes oculaires dans le pré chauffé 37 Oc DMEM (hyperglycémie) à l’aide de pinces. Aspirer les globes oculaires moyen et le transfert à un milieu frais dans un plat à nouveau.
- Aspirer un milieu DMEM (haute glucosé) et incuber les yeux dans la solution de travail II a de 2 % (wt/vol) préchauffé pendant 45 min dans un incubateur à 37 ° C.
Remarque : Dans toutes les étapes suivantes, placer et manipuler des yeux ou des œilletons dans le milieu de croissance, qui permettra de protéger le tissu et de fournir un bon support pour la dissection. - Enlever la solution II a et laver les yeux deux fois dans le milieu en aspirant le milieu vieux et en ajoutant le nouveau milieu de croissance préchauffé 37 ° C (Figure 1 a).
Remarque : Après dissociation par a II, les globes oculaires deviennent mous. - Tenir l’oeil avec une pince et faire une incision autour de l’ora serrata de chacun des deux yeux à l’aide de ciseaux de Vannas sous le microscope à dissection placé dans l’écoulement laminaire du cabinet.
- Maintenant le globe oculaire dans la solution, retirer délicatement la cornée antérieure en étendant la coupe sur la circonférence de l’ora serrata et en tirant la cornée antérieure de suite après que la coupe a été complète.
- Retirer la capsule du cristallin et l’épithélium associé iris pigmenté en les tirant doucement hors de le œilleton avec une pince dentée (Figure 1 b, 1C).
- Incuber les œilletons postérieurs qui en résulte dans le milieu de croissance pendant 20 min à 37 ° C pour faciliter la séparation de la rétine neuronale de la RPE.
- Couper les œilletons postérieures en 4 pétales sous le microscope à dissection placé dans l’écoulement laminaire du cabinet. Les coupes doivent être suffisamment long pour aplatir le œilleton, mais assez courte pour garder les pétales connectés (Figure 1D).
- Aplatir le œilleton et enlever la rétine neurale en le tirant très doucement avec une pince tout en maintenant les autres pre-choroïde-sclérotique complexe avec une autre pince (Figure 1e). Commencez à tirer des bords plutôt qu’à partir du centre.
- Transférer tous les tissus en quartiers dans une nouvelle boîte de Petri stérile rempli de milieu de croissance préchauffé 37 ° C.
4. isolement de cellules primaires de l’ÉPR
- Tenant un pétale du complexe pre-choroïde-sclérotique écartelée avec super fine pince, décollez délicatement les feuilles intactes de RPE de la membrane de sous-sol sous-jacente (la membrane de Bruch) à l’aide d’un couteau microchirurgie croissant sous le microscope à dissection placé dans le flux laminaire (Figure 1f).
- Transférer les draps de la RPE dans la nouvelle boîte de Petri stérile contenant du milieu de culture à l’aide d’une micropipette P200. Lorsque vous transférez les draps de la RPE, mouiller les pointes de pipette avec milieu de culture en pipettant également à plusieurs reprises pour empêcher les tissus de coller à l’intérieur de la pointe. RPE sera clairement distinguée de la choroïde : RPE semble plus brunâtre, tandis que la choroïde est plus sombre et l’air collant et moelleux.
- Également utiliser la digestion enzymatique et dissociation douce sans pinces pour détacher le pre de la choroïde14.
- Laver les draps de la RPE 2 - 3 fois en utilisant préchauffé 37 ° C milieu de croissance dans la boîte de Petri stérile. Après chaque lavage, soigneusement collecter les draps de la RPE tout en évitant d’autres tissus tels que les débris de la rétine ou de la choroïde. À la fin du dernier lavage recueillir les draps de la RPE avec une micropipette P200 et placez-les dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
Remarque : Il est inutile de centrifuger les draps de la RPE : ils seront des sédiments par gravité dans 1 min. - Enlever le milieu de croissance supplémentaires à l’aide d’une micropipette P200. Remettre en suspension les cellules dans le milieu frais préchauffé et triturer délicatement à l’aide d’une micropipette P200. Eviter la formation de bulles. Une suspension de cellules individuelles est idéale, mais aussi d’éviter trop de trituration, sinon les cellules RPE ne sont pas capables de survivre. Nous vous recommandons très doucement de trituration pour 40 - 50 fois.
5. mise en culture des cellules RPE
- Plaque de cellules sur une plaque de culture.
- Si les applications en aval des cellules RPE besoin retenir de leur polarité, les cellules de plaque le pre de 2 souris dans un insert de membrane polyester 12 mm pré-chargés en plaques de 12 puits de culture. Les cellules à haute densité de placage est souhaitée car dans ce cas les cellules RPE sont capables de garder les propriétés d’origine, tels que la forme hexagonale et la pigmentation.
- Ne pas déplacer la plaque ou changer le milieu de croissance pour les 72 premières heures de culture. Après 3 jours, remplacer le milieu de l’ancien avec le milieu frais préchauffé. Après cela, changer le milieu de culture tous les deux jours. Une fois que les cellules RPE confluency, réduire la FBS dans le milieu de croissance à 2 %.
Remarque : Les cellules peuvent être divisées à l’aide de 0,25 % de trypsine. Toutefois, après le fractionnement, les cellules peuvent perdre leur forme hexagonale et la pigmentation dans les passages suivants. Nous ne recommandons pas de fractionnement de cellules, mais si elle est requise par les applications en aval de la culture, n’oubliez pas que les piles ne peuvent être repiquées indéfiniment : ils sont connus pour se différencier après 5 à 7 passages.
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Résultats
La culture la souris de la RPE primaire établie de 2 souris en 12 mm membrane polyester insert atteint confluence de 90-95 % après 1 semaine de culture. Après 2 semaines de culture, les cellules atteint 100 % confluence et a commencé à former une mosaïque de cellules hexagonales, pigmentées et bi-nucléées. En 3 semaines de culture, les cellules ont continué pour former la forme et la pigmentation, cependant, après 4 semaines une partie des cellules obtenu hyperpigmentées (
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Discussion
Le protocole détaillé présenté permet création fiable de souris primaire RPE cultures qui atteignent la confluence après 1 semaine et présenter les principales caractéristiques RPE comme forme hexagonale et la pigmentation après 2 semaines. Les cellules RPE obtenus peuvent être utilisés pour un certain nombre d’applications en aval comme vitamine A metabolism9, phagocytose des photorécepteurs segments externes10 et ion transport11, cellules épithélia...
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Déclarations de divulgation
DS a reçu le financement de Bayer HealthCare, Allemagne, Suisse et F. Hoffmann-La Roche de la recherche. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêts financiers concurrents. Ce travail est soutenu par la recherche pour prévenir la cécité (subventions sans restriction à la Wilmer Eye Institute et l’Université de Pittsburgh). Ce travail est également soutenu par des fonds de démarrage de DS d’ophtalmologie, Université de Pittsburgh.
Remerciements
Cette étude a été financée en partie par la Fondation BrightFocus (pour DS).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| animals | |||
| 2~3-old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | >Comments |
| >reagents | |||
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), haute teneur en glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 1X, pH 7,4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Alcool éthylique | Fisher Scientific | 111000200 | |
| Anticorps RPE65 | Un cadeau du Dr Michael Redmond | ||
| Fluorescéine Phalloïdine ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; | Invitrogen | F432 | |
| Chèvre anti-Lapin IgG (H+L), Farine Alexa 568 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; | Invitrogen | A11011° ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; | |
| Sérum de chèvre | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Anticorps polyclonal | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Nom | Société | Catalog Numéro | Commentaires |
| instruments et équipements | |||
| Armoire à flux laminaire | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Microscope de dissection (stéréomicroscope Zoom) | Incubateur | SMZ1500 | |
| CO2 Nikon avec stérilisation à l’air chaud | Liant | C150 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5702 | |
| Boîtes de Pétri | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Inserts à membrane polyester préchargés dans des plaques de culture à 12 puits, taille des pores : 0,4 & micro ; m, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Ciseaux de ténotomie Westcott, lames std, | instruments STEPHENS | S7-1320 | |
| Castroviejo pince à suture 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent couteau droit | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Pince à épiler #5, 11 cm, Droit, 0.1x0.06 mm Pointes, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Ciseaux Vannas, 8 cm, 45° ; Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Unité de filtre à seringue, 0,22 & micro ; seringue | SLGL0250S | Millipore | |
| , 5 mL | BD | 309632 | |
| microscope de laboratoire inversé ; Leica DM IL LED | · Leica ; | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier et pointes de pipette non filtrées | Thermo Scientific |
Références
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
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Réimpressions et autorisations
