Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.
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Article de méthode
Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le recrutement des leucocytes à la blessure ou inflammation aux sites de blessures ou de dommages aux tissus a été étudié au cours de ces dernières décennies et a abouti à la notion de la cascade d’adhérence de leucocyte. Toutefois, l’exactes mécanismes moléculaires impliqués dans le recrutement des leucocytes n'ont pas encore été pleinement identifiés. Étant donné que le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et immunitaire recherche (auto-), nous présentons un simple test à flux laminaire pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence, et transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’essai in vitro peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires dans différents modèles d’inflammation vasculaire. Ce protocole décrit une analyse axée sur les hottes à flux laminaire à l’aide d’une chambre à flux parallèle et un microscope à contraste de phase inversé relié à une caméra pour étudier les interactions des leucocytes et des cellules endothéliales ou les plaquettes, qui peuvent être visualisés et enregistrées puis analysés en mode hors connexion. Les cellules endothéliales, les plaquettes ou les leucocytes peuvent être prétraités avec inhibiteurs ou des anticorps afin de déterminer le rôle des molécules spécifiques au cours de ce processus. Conditions de cisaillement, contrainte de cisaillement c.-à-d. artériel ou veineux, peuvent être facilement adaptées par la viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal.
Introduction
Sur blessure, inflammation ou infection, leucocytes répondent rapidement à pathogène ou dommages associés à - molecular patterns (PAMPs, DAMPs), transformer un état activé et sortir de la circulation sanguine aux sites d’inflammation et tissus des dommages. La capacité des leucocytes d’interagir avec leur environnement cellulaire et moléculaire est essentielle pour leur bon fonctionnement comme des cellules immunitaires, mise en évidence par des maladies génétiques comme le déficit d’adhésion leucocytaire1. Adhésion leucocytaire a fait l’objet d’une enquête intense durant les dernières décennies, et il en est résulté dans le concept de la casca....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’éthique médicale et Animal conseils éthiques d’Université de Maastricht.
1. flow-Based Test avec des cellules humaines
-
Isolement des plaquettes du sang humain
- Prélever du sang veineux en anticoagulant citrate (3,2 %).
- Ajouter 1/15 volume d’acide Citrate Dextrose (ACD : citrate trisodique 80 mM, 52 mM d’acide citrique et 183 mM de glucose) dans le sang.
- Centrifuger à 350 g sans frein pendant 15 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).
- Transférer le surnageant dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1/20 vol....
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Résultats
Pour étudier l’adhésion endothéliale-leucocytaire, fluorescent étiquetés cellules THP-1 ont été perfusés pendant une monocouche endothéliale TNFα - ou non-stimulés pendant 2 min à 3 dyne/cm2. Le nombre total de cellules adhérentes de monocytaire a été déterminé après 2 min de perfusion en capturant 6 champs indépendants sur une période de 2 à 6 min. Les cellules adhérentes ont été quantifiés dans au moins 6 photos prises avec un microscope à contraste/fluorescence phase inverse.......
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Discussion
Ce dosage in vitro est une méthode simple pour étudier les mécanismes sous-jacents de recrutement des leucocytes au cours de l’inflammation vasculaire, mais il y a certains points critiques à noter. La première condition pour réaliser avec succès ce test est la perfusion des leucocytes sur un intact et anastomosé vasculaires ou monocouche plaquettaire. Ceci peut être réalisé en enduisant préalable des surfaces avec du collagène de type I. En général, lorsque vous travaillez avec des cellules vasculaires primaire.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions les Drs Martin M. Schmitt et Fraemohs de la ligne. Ce travail a été soutenu par la Fondation néerlandaise pour la recherche scientifique (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Fondation pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR Nr. 1638) et le Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) attribué à R.R.K.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope à fluorescence inversée, par exemple EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump par ex. modèle : 210-CE | ; world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Corning | 353001 | |
| seringue de 50 mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Tube en silicone ; | VWR | 228-0700 | |
| Coude Luer Connecteur Mâle | Ibidi | 10802 | |
| Femelle Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Chambre d’écoulement | Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle | Brevet DE10328277A1 : Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strö ; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgä ; ngen an Zelloberflä ; Chen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Lamelles pour sticky slides ; | Ibidi | 10812 | |
| Collagène de type I, queue de rat | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Humain recombinant TNF-&alpha ; | Peprotech | 300-01A | |
| Activateur du récepteur de la thrombine pour le peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 coloration d’acide nucléique fluorescente verte | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks' solution saline équilibrée 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES solution tampon 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumine, 25 % ; | Baxter | 60010 | |
| Eau injectable | B. Braun | 3624315 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | Merck | 102382 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Milieu de croissance des cellules endothéliales endothéliales (prêt à l’emploi) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Cellules endothéliales primaires de l’aorte humaine (HAoEC) | ATCC& | nbsp ; PCS-100-011 | |
| Milieu basal des cellules vasculaires ; | ATCC | PCS-100-030 | |
| Kit de croissance des cellules endothéliales-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Cellules musculaires lisses de l’aorte humaine primaires (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Kit de croissance des cellules musculaires lisses vasculaires | ATCC | PCS-100-042 | |
| Lignée de cellules endothéliales humaines, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco’s Milieu d’Eagle modifié (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Lignée cellulaire endothéliale de souris, SV 40 transformée (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Lignée cellulaire monocytaire humaine, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 avec ultra-glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Monocyte/macrophage de souris RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), teneur élevée en glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD ; Vacutainer Tubes de prélèvement sanguin en plastique avec héparine de sodium | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Citrate de sodium de coagulation 3,2 % ; | Greiner Bio | 455322 | |
| mélange HCl/EtOH (1,2 mol/L de HCl et 50 % d’éthanol) dans de l’eau | Sigma-Aldrich Chemie | Préparez en mélangeant 0,3 L de HCl (4 mol/L) avec 0,7 L d’éthanol à 70 % v/v dans une hotte |
Références
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leuko....
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Réimpressions et autorisations
