Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

Summary

Nous avons conçu la protéine de capside du virus de l’hépatite E comme une NANOPARTICULE théranostiques (HEVNP). HEVNP auto assemble dans une cage icosaédrique stable en livraison muqueuse. Nous décrivons ici la modification de HEVNPs pour tumeur ciblage par mutation exposés à la surface des résidus cystéines, qui conjugue des ligands synthétiques qui lient spécifiquement les cellules tumorales.

Abstract

Pseudo-particules virales (VLP) ont servi de nanocarriers à afficher des épitopes étrangers et/ou livrer de petites molécules dans la détection et le traitement de diverses maladies. Cette application s’appuie sur la modification génétique, l’auto-assemblage et conjugaison de cystéine pour remplir l’application ciblage tumoral de recombinant VLP. comparés avec génétique modification seul, chimique conjugaison de peptides étrangers les PPV offre une significative avantage car elle permet une variété d’entités telles que les peptides synthétiques ou des oligosaccharides, à être conjugués à la surface du PPV de manière modulée et flexible, sans altération de l’Assemblée VLP.

Ici, nous démontrons comment utiliser la virus de l’hépatite E virus NANOPARTICULE (HEVNP), une capsule de théranostiques modularisée, comme un transporteur livraison multifonctionnel. Les fonctions de HEVNPs incluent ciblage tissulaire, l’imagerie et livraison thérapeutique. Basé sur les recherches structurales bien établie de HEVNP, les résidus structurellement indépendants et exposés à la surface ont été sélectionnés pour le remplacement de la cystéine comme sites de conjugaison pour groupes chimiques maléimide liés par l’intermédiaire de liens thiol-sélective. Une notamment cystéine-modification HEVNP (remplacement de l’asparagine à 573 Cys aa HEVNP - 573C) était conjugué à un ligand spécifique des cellules du cancer du sein LXY30 et marqués par agent de fluorescence proche infrarouge (NIR) (Cy5.5), rendant la tumeur ciblées HEVNPs sous forme de capsules de diagnostics efficaces (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ingénierie des stratégies similaires peuvent être utilisés avec d’autres complexes macromoléculaires avec la structure atomique bien connue à explorer des applications potentielles dans la livraison de théranostiques.

Introduction

Le développement de vecteurs de taille nanométrique dans livraison thérapeutique et diagnostique, connu comme nanotheranostics, a déplacé une grande partie du domaine biomédical, loin des traitements généralisés sur CIBLEE¹. Livraison nanotheranostic ciblées intègre des vecteurs de taille nanométrique (nanoparticules) avec des molécules de théranostiques pour diriger stablement théranostiques molécules à un tissu malade spécifique ou voie biochimique^2,3,4 . Nanomédecine est venu au premier plan de l’administration ciblée parce que la tailles optimale d....

Protocol

1. HEVNP Production dans des cellules d’insecte

NOTE : Tous les étapes suivants devraient être effectuées sous une hotte de culture cellulaire. Se référer à notre publication précédente pour plus d’HEVNP production procédures¹¹.

1. Culture de cellules Sf9 dans médias cell insecte (voir Table des matières) à la confluence de 50 à 75 % en plaques 6 puits.
2. Utilisant des réactifs de transfection de cellules insectes selon les protocoles du fabricant, transfecter Bacmids contenant HEVNP - 573 C ORF2 dans Sf99 cellules pour produire des baculovirus recombinant. Incuber les cellules transfe....

Results

S’apparente à la HEV-VLP, Cys tous modifiés capsides icosaédriques solubles HEVNPs formés et ne pas agréger en solution au cours de la production ou la purification. Avant et après modification de conjugaison seule étape maléimide-biotine, chacun de la Cys HEVNPs étaient impossibles à distinguer de la HEV-PPV dans la tache négative EM (Figure 2). Efficacité de conjugaison maléimide-biotine à Cys mis à jour le HEVNPs a été tout d’abord testé avec Éponger occid.......

Discussion

Contrairement à la procédure de votre temps de génie génétique, qui prend généralement semaines, nous démontrons simple en deux étapes et procédures de conjugaison chimique en une seule étape, ce qui peuvent être complétées en 3 jours, d’ajouter le cancer en ciblant les ligands et/ou colorant de détection fluorescence aux sites Cys/Lys de HEVNPs. La technique peut être utilisée pour dépister la meilleure cible de ligand d’un bassin de candidats et donc met à profit les services de synthèse disponibles peptide/petite molé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Unités de dialyse, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini unité de dialyse
High Five Cells Thermo	Fisher Scientific	B85502	Tn5
cellules SF9 Cellules  ;	Thermo Fisher Scientific	11496015	Cellules Sf9
Système d’expression de baculovirus Bac-à-Bac Système d’expression de baculovirus	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Système d’expression de baculovirus
Bac-à-Bac Life	Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Systèmes d’expression de milieux cellulaires	d’insectes LLC	96-001-01	insecte milieux cellulaires
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Colonnes de dessalage par spin, 40K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	87766	colonne de dessalage par spin
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Centrifugeuse ultra-claire Tubes ultra-centrifuges à paroi mince	Beckman Coulter, Inc	dépend du rotor	tube ultracentrifuge
NuPage 4-12 % Bis-Tris Gel de protéines	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	Gel de protéines SDS
Réactif Cellfectin II Réactif	Thermo Fisher Scientific	10362100	Réactif de transfection
EMS	Microscopie électronique Science		déchargeur de luminescence