Article de méthode

Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

DOI :

10.3791/57040

⸱

10 mai 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, 3Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cultures d'organoïdes intestinaux offrent une occasion unique d'étudier la biologie intestinale des cellules souches et des cryptes in vitro, bien que des approches efficaces pour manipuler l'expression des gènes chez les organoïdes aient fait des progrès limités dans ce domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une édition génomique précise des cellules pour la génération d'organoïdes, cette stratégie nécessite une sélection et un dépistage approfondis par analyse de séquences, ce qui est à la fois long et coûteux. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction virale efficace des organoïdes intestinaux. Cette approche est rapide et très efficace, réduisant ainsi le temps et les dépenses inhérents à la technologie CRISPR/Cas9. Nous présentons également un protocole pour produire des sections congelées des cultures organoïdes intactes pour une analyse plus approfondie avec la coloration immunohistochimique ou immunofluorescente, qui peut être employée pour confirmer l'expression ou le silence de gène. Après la transduction réussie des vecteurs viraux pour l'expression ou le silence de gène est réalisé, la fonction intestinale de cellules souches et de crypte peut être rapidement évaluée. Bien que la plupart des études organoïdes utilisent des tests in vitro, les organoïdes peuvent également être livrés à des souris pour des analyses fonctionnelles in vivo. En outre, nos approches sont avantageuses pour prédire les réponses thérapeutiques aux médicaments parce que les thérapies actuellement disponibles fonctionnent généralement en modulant l'expression des gènes ou la fonction protéique plutôt que de modifier le génome.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacité de culture de la souris ou des cryptes humaines cellules comme des organoïdes tridimensionnels (3D) de l'intestin grêle ou du côlon sur de longues périodes de temps a fourni une percée majeure parce que ces cultures affichent des caractéristiques déterminantes de l'épithélium intestinal in vivo 1 Fois , 2 (en) , 3. Les organoïdes dérivés des cryptes primaires sont capables d'auto-renouvellement et d'auto-organisation, présentant des fonctions cellulaires semblables à leurs tissus d'origine. En effet, les organoïdes récapitulent non seulement l'organisation structurelle des cryptes in vivo, mais aussi de nombreuses caractéristiques moléculaires, fournissant ainsi des outils utiles pour étudier la biologie normale et les états de la maladie. Pour illustrer, les études organoïdes ont révélé de nouvelles voies moléculaires impliquées dans la régénération des tissus1,2,3,4,5 ainsi que des médicaments qui pourraient améliorer la fonction dans les milieux pathologiques6,7.

L'étude des cellules souches intestinales est d'un intérêt particulier parce que la muqueuse intestinale est parmi les tissus mammifères les plus fortement régénératrices, se renouvelant tous les 3-5 jours pour protéger l'organisme contre les bactéries, les toxines et autres agents pathogènes au sein de la lumens intestinaux. Les cellules souches intestinales (ISC) sont responsables de cette remarquable capacité de régénération et fournissent ainsi un paradigme unique pour l'étude de la fonction des cellules souches adultes1,2. Des expériences de traçage de lignée chez la souris ont démontré que les cellules souches isolées lgr5-positives peuvent être cultivées pour produire des organoïdes 3D ou « mini-guts » in vitro où elles reflètent étroitement leurs homologues in vivo. Les cultures organoïdes peuvent également être dérivées d'isolats cellulaires de crypte intestinale composés d'ancêtres, d'ISC et de cellules Paneth, ces dernières constituant les cellules de niche épithéliales in vivo. En fait, la culture organoïde des cellules primaires de crypte intestinale a évolué en une technique relativement routinière qui est facile à mettre en œuvre dans la plupart des laboratoires utilisant des réactifs largement disponibles. Ce modèle est également favorable à l'analyse quantitative de l'expression génique par le séquençage de l'ARN (ARN-Seq) et les protéines par spectrométrie de masse, immunohistochimie, ou coloration immunofluorescente2,4,8. En outre, la génétique fonctionnelle peut être étudiée à l'aide d'approches de gain de fonction (surexpression ou expression génique d'un gène mutant activant) ou de perte de fonction (silençage génétique ou expression d'un mutant en perte de fonction)approche 2.

Fait important, la faible efficacité et la toxicité élevée de l'ADN plasmide standard ou des protocoles de transduction virale avec du polybrene demeurent un obstacle majeur dans le domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une modification précise du génome, cette approche nécessite une sélection longue suivie d'une validation de séquence9. Ici, nous présentons un protocole de transduction virale pour les organoïdes intestinaux primaires qui optimise la livraison des particules virales par conjugaison aux nanoparticules magnétiques et l'application d'un champ magnétique. Les principales modifications apportées aux protocoles antérieurs4,5,10,11,12,13 et des recommandations pour améliorer l'efficacité sont fournies. Nous décrivons également une approche pour produire des sections congelées des organoïdes intacts cultivés dans le matrigel 3D (maintenant désigné sous le premier sous-sol matrice ou matrice de membrane) pour l'analyse plus approfondie avec l'immunohistochimie ou la coloration immunofluorescente.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole a été approuvé par le Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Ce protocole est modifié à partir d'une méthode déjà publiée10,11,12,13.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparer le milieu frais 293T plusieurs heures à l'avance et réchauffer à 37 oC dans un bain d'eau pendant au moins 10 min avant utilisation (tableau 1).
  2. Préparer plasmide ADN2,13,14 pour l'emballage viral. (Tableau 2).
  3. Acquérir tous les autres matériaux requis (Tableaudes matériaux).

2. Lentivirus ou rétrovirus Production de particules

  1. Rein d'embryon humain (HEK) 293T ensemencement cellulaire (Jour 1)
    1. Préparer un plat de culture de 150 mm en enrobant de 50 g/mL de poly-lysine dissous dans du phosphate tamponné salin (PBS; 10 ml/plat) pendant 1 h à température ambiante (RT).
    2. Retirer le phosphate tamponné saline (PBS)/poly-D-lysine et laver le plat enduit deux fois avec 5 mL de PBS.
    3. Seed 293T cells (8-u201210 x 106) in 293T medium (tableau 1) to a total volume of 15 mL.
    4. Culture 293T cellules du jour au lendemain dans un incubateur de culture tissulaire standard (37 oC, 5 % CO2).
  2. HEK 293T transfection cellulaire (Jour 2)
    1. Effectuer la transfection une fois que les cellules ont atteint 70-80% confluence (généralement environ 24 h après l'ensemencement 8-u201210 x 106 cellules).
    2. Préparer le mélange de transfection à l'aide d'une approche efficace telle qu'une formulation commerciale de liposome cationic (Tableaux 1-u20122, Tableau des matériaux)2.
      1. Diluer l'ADN des lentilles construit12 (ADN plasmide total de 24 g, tableau 2) dans 1,2 ml de milieu de transfection et incube pendant 5 min à RT dans des tubes de 1,5 mL (Tableau des matériaux).
      2. Diluer le régent de transfection (36 oL) dans 1,2 ml de milieu de transfection (Tableau des matériaux)et couver dans des tubes de 5 ml pendant 5 min selon les instructions du fabricant.
      3. Ajouter le réactif lentivirus (étape 2.2.2.1) au réactif de transfection (étape 2.2.2.2) et mélanger doucement en pipetting lentement vers le haut et vers le bas à l'aide d'un tuyauterie de 5 ml.
      4. Incuber le mélange pendant 20 min à RT.
    3. Laver délicatement les cellules 293T avec 5 ml de milieu de transfection et remplacer par 10 ml de milieu de transfection.
    4. Ajouter les complexes ADN-lipide (à partir de l'étape 2.2.2.3) goutte à goutte au milieu des cellules 293T et mélanger soigneusement les milieuis dans les plats de culture en se déplaçant dans des directions horizontales et verticales pour assurer une distribution égale des complexes ADN-lipide dans chaque plat.
    5. Incuber pendant 6 h dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).
    6. Après l'incubation, remplacer les médias par un milieu de collecte de virus frais de 20 ml (tableau1).
  3. Collecte de virus (Jours 3-u20125)
    1. Recueillir les médias antivirus dans des tubes de 50 ml et les conserver dans un réfrigérateur de 4 oC pour une concentration plus poussée.
    2. Remplacer 20 mL de virus frais collecte moyenne tous les 24 h et la culture du jour au lendemain (24 h). Répétez la collecte des médias au cours des 2 prochains jours (Jours 4-u20125).
    3. Veiller à ce que le volume total de milieu recueilli après le jour 5 soit de 60 ml (20 ml/jour x 3 jours).
  4. Concentration de virus (Jour 5)
    1. Centrifuger le support collecté (60 ml) pendant 5 min à 400 x g. Ensuite, passez le supernatant à travers un filtre (0,45 m pores) pour enlever les débris cellulaires.
  5. Concentrez le virus en ajoutant 15 ml de milieuis de virus filtrés dans une unité de filtre centrifuge (Tableau des matériaux). Centrifugeuse à 2 500 x g pendant 15 min à 4 oC. Parce que le virus ne peut pas passer à travers ce filtre, il sera concentré dans la chambre supérieure du filtre.
    1. Aspirez le flux à travers le tube (chambre inférieure) et ajoutez un autre 15 ml de plus de supernatant de milieu de collecte virale restant à la même unité de filtre centrifuge. Centrifugeuse comme ci-dessus (2 500 x g pendant 15 min à 4 oC) pour concentrer le virus supplémentaire du supernatant.
    2. Répétez le processus à l'aide du même filtre pour un support de 60 ml à partir d'une seule plaque transductible jusqu'à ce que la concentration désirée soit atteinte (100 fois).
      Remarque : Nous concentrons généralement 60 ml de supports de collecte de virus à 600 l.
    3. Retirez le virus concentré de la chambre supérieure du filtre à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml, puis en adhérence et entreposez-le dans des tubes de 1,5 ml (50'u201260 'L/tube) à -80 'C pour une utilisation ultérieure. Entreposez les particules concentrées jusqu'à 6 mois et demi.

3. Isoler les cryptes

  1. Euthanasiez les souris en utilisant le CO2 selon les directives locales de l'IACUC.
  2. Placez l'animal euthanasié sur son dos et lavez l'abdomen en pulvérisant 70 % d'éthanol.
  3. Effectuer une incision longitudinale de la ligne médiane du sternum à l'aine, inciser la peau d'abord, puis le tissu sous-cutané.
  4. Retirer l'intestin grêle de l'estomac au cecum.
  5. Identifier les régions d'intérêt au sein de l'intestin grêle; les cryptes peuvent être isolées du duodénum, du jejunum et de l'ileum.
  6. À l'aide d'une seringue de 10 ml, rincer l'intestin grêle isolé avec un tampon de dissociation de la crypte (PBS préréfrigéré contenant 1 mM de dithiothreitol (TNT), 1 % de pénicilline/streptomycine (no Ca2 et Mg2)dans un plat de culture tissulaire de 10 cm (Tableau 1) )
  7. Enlever les tissus adipeux périphériques et ouvrir ou « fileter » le tissu intestinal longitudinalement sur une plaque de verre stérile (15 cm x 15 cm).
  8. Gratter délicatement les villosités épithéliales intestinales à l'aide d'un grattoir cellulaire.
  9. Couper l'intestin grêle en sections de 2'u20123 cm dans le sens de la longueur.
  10. Transférer le tissu dans un tube de 15 ml contenant du PBS préréfrigéré à l'aide de forceps plats (116 mm). Laver les fragments de tissu en secouant vigoureusement à la main pendant 30 s (déplacer le tube dans des directions opposées 60 fois).
  11. Rafraîchir le PBS et répéter le lavage jusqu'à ce que le PBS devienne clair.
    Remarque : Nous lavons généralement les fragments 2 fois.
  12. Incuber le tissu dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de tampon de dissociation de crypte (tableau 1) pendant 10 min à 4 oC sur un shaker orbital à vitesse moyenne une fois que le PBS est clair.
  13. Secouez vigoureusement le tube à la main pendant 30 s (directions opposées 60 fois) et transférez le tissu à l'aide de forceps plats vers un autre tube conique de 15 ml contenant 10 ml de tampon de dissociation de crypte. Incuber cette fraction sur la glace. N'utilisez pas la première fraction pour la culture organoïde, car elle contient principalement des villosités.
  14. Répétez les étapes 3.11'u20123.13 pour 3'u20124 fois, collecte de chaque fraction et les plaçant sur la glace.
  15. Sélectionnez la fraction qui est enrichie avec le pourcentage le plus élevé de cryptes intestinales en scannant 200 échantillons de L de chaque fraction sous un microscope inversé (4x). Identifier les cryptes par la morphologie typique décrite précédemment (Figure 1A)10.
    REMARQUE: Ils apparaîtront de forme ronde ou ovale et contiendront des cellules panétoytes granulées. En revanche, les villosités sont des structures ressemblant à des doigts dépourvues des cellules granulaires de Paneth (Figure 1B).
  16. Passez la fraction sélectionnée à travers une passoire cellulaire de 40 m pour obtenir des cryptes de taille similaire si nécessaire. Sinon, isolez les cellules souches Lgr5MD en fonction de la cytométrie d'écoulement pour les protéines fluorescentes vertes (GFP) siles souris sont croisées sur le fond EGFP-Lgr5MD ou sur un autre modèle approprié qui permet d'identifier les cellules Lgr52 .
  17. Comptez le nombre total de cryptes dans la fraction sélectionnée comme suit.
    1. Pipette 50 l de la fraction sélectionnée dans un hémocytomètre et compter le nombre de cryptes à l'aide d'un microscope à lumière inversée (4x). Placez 100 cryptes par puits lors de l'utilisation d'une plaque de 48 puits pour permettre les expériences de transduction dans lesquelles les puits de 3-u20126 seront cédés par condition expérimentale pour le silençage génétique ou la surexpression.
    2. En fonction du nombre de cryptes par 50 L, calculez le volume de tampon de dissociation de crypte nécessaire et transférez ce volume dans un tube de 1,5 ml.
      Remarque : Par exemple, 10 cryptes pour 50 L sont comptées, 6 x 50 L ou 300 L sont nécessaires pour 300 cryptes.
  18. Centrifuger les cryptes dans les tubes de 1,5 ml à 300 x g pendant 5 min.
  19. Jetez soigneusement le supernatant en tafilant doucement la couche liquide supérieure et resuspendez la pastille dans 100 ll de matrice de membrane réduite de la membrane du sous-sol sur la glace (Tableau des matériaux).
  20. Ensemencez les cryptes contenant de la matrice dans une plaque de 48 puits préréchauffée de 37 oC (30 l/puits, 100 cryptes/puits). Incuber la plaque dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant 5'u201215 min pour permettre la gélification de matrice (37 oC, 5% CO2).
  21. Regroupez chaque gel d'un milieu de culture organoïde de 250 l (ENR) (tableau1) et placez les plaques de 48 puits dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2). Vérifiez les cultures pour l'organisation de crypte dans de petites formes rondes et cystiques après 24 h ; bourgeons se formeront après 2'u20125 jours.
  22. Remplacez délicatement les supports ENR tous les 3 jours. Retirez les vieux supports ENR avec une aspiration douce, en prenant soin de ne pas toucher la matrice lors du remplacement des médias.
  23. Les cultures organoïdes de passage tous les 4 jours 20127 comme précédemment décrit11.

4. Préparation de fragment organoïde

  1. Transduce organoïdes une fois qu'ils se forment (dans les 1'u20122 semaines) ou après avoir été adoptés. Pour une seule expérience de transduction, préparez 2 puits d'organoïdes cultivés dans une plaque de 48 puits par condition avec des organoïdes/puits de 200 ou 200 ou 200'u202600 par état de transduction expérimentale.
  2. Échangez ENR avec des supports de transduction de 250 l (tableau 1) et de la culture dans les supports de transduction pendant 3 jours ou plus ou jusqu'à ce que les organoïdes adoptent une morphologie kystique. Inclure à la fois l'inhibiteur Wnt3a et l'inhibiteur rock (Y27632) dans le milieu de transduction pour augmenter le nombre de cellules souches et paneth; Nicotinamide (Nic) améliore l'efficacité de la culture (voir le milieu de transduction dans le tableau 1).
  3. Rompre mécaniquement la structure de la membrane de membrane du sous-sol en forme de dôme avec des supports et une pointe de pipet à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml.
  4. Transférer les organoïdes et les médias dans un tube stérile de 1,5 ml.
  5. Perturber mécaniquement la matrice plus loin en pipetting avec un tuyaude de 200 l 10 'u201215 fois.
  6. Centrifugeles les fragments d'organoïdes à RT à 500 x g pendant 5 min.
  7. Jeter le supernatant soigneusement à l'aide d'une pipette et resuspendre la pastille dans un milieu DMEM/F12 de 1 ml (tableau1).
  8. Ajouter Dispase I (6 l à 10 mg/mL) et DNase I (2,5 l à 10 mg/mL). Bien mélanger en pipetting doucement à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml.
  9. Incuber les organoïdes à 37 oC pendant 20 min dans le tube de 1,5 ml.
  10. Ajouter 500 l de supports ENR pour mettre fin à la réaction de dissociation; le sérum dans l'ENR met fin à la réaction.
  11. Passer les cellules organoïdes à travers une passoire à cellules de 20 m et centrifuger les fragments d'organoïdes à 400 x g pendant 5 min.
  12. Resuspendre les fragments d'organoïdes avec un milieu de transduction de 150 l (tableau 1).

5. Génie génétique des organoïdes ou des cellules cryptiques par transduction virale

REMARQUE: Voir Figure 2.

  1. Clusters de cellules organoïdes de graines avec 200 l transduction moyenne/bien dans une plaque de 48 puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2). Vous pouvez également placer des cellules cryptiques fraîchement isolées (1 000 cryptes) dans un milieu/puits de transduction de 200 l dans une plaque de 48 puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).
  2. Décongeler les flacons de virus pour la transduction, ce qui permet de défonçage 50 ll de virus concentré pour la transduction de chaque puits dans des plaques de 48 puits ou 100 l de virus concentré par puits dans des plaques de 24 puits.
  3. Incuber le virus avec 12 l de solution de nanoparticules magnétiques pendant 15 min à RT dans un tube de 1,5 ml (tableau 3).
  4. Ajoutez la solution magnétique de nanoparticules/mélange de virus aux cellules à transduire.
  5. Placer la plaque de culture cellulaire sur une plaque magnétique et incuber pendant au moins 2 h (et jusqu'à 6 h) dans un incubateur standard de culture tissulaire (37 oC, 5 % CO2).

6. Ensemencement de fragments d'organoïdes infectés

  1. Transférer les amas de cellules organoïdes infectés et les supports de transduction de chaque puits dans un tube de 1,5 ml.
  2. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.
  3. Jeter le supernatant avec une aspiration douce et refroidir le tube contenant le granule sur la glace pendant 5 min.
  4. Ajouter 120 l de matrice de membrane de sous-sol et resuspendre le granule en pipetting lentement de haut en bas.
  5. Graines de 30 l gouttes du mélange matrice-cellule dans une nouvelle plaque de 48 puits.
  6. Incuber la plaque à 37 oC pendant 5'u201215 min jusqu'à ce que la matrice se solidifie.
  7. Ajouter le milieu de transduction à chaque puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant 3'u20124 jours (37 oC, 5% CO2).
  8. Après 3 jours 20124, inspectez les cultures au microscope léger (10x) pour assurer l'organisation des grappes cellulaires en structures organoïdes. Ensuite, remplacez délicatement les supports de transduction par un support ENR de 250 l.
  9. Remplacez les médias tous les 3 jours et plus.

7. Sélection (le cas échéant)

  1. Après 2 jours 20123, ajouter des antibiotiques ou des hormones pertinents pour la sélection au milieu de transduction si approprié.
    REMARQUE: Nous avons utilisé la puromycine (2 g/mL) pour la sélection de la transduction lentivriale parce que les plasmides abritait un gène de résistance à la puromycine2,14.

8. Confirmation d'une transduction réussie et d'expression génique ou de silence

  1. Si vous utilisez fuGW lentivirus2,14, estimer l'efficacité de la transduction en mesurant les signaux GFP via le microscope fluorescent ou la cytométrie de flux.
  2. Valider la surexpression ou le silence génétique à l'aide d'une réaction quantitative en chaîne de transcriptase inversée (RT-PCR) pour la comparaison quantitative de l'ARNm dans les cultures organoïdes témoins et expérimentales.
  3. Confirmer les niveaux de protéines pour l'expression des gènes codant les protéines ou le silence par Western Blot ou immunostaining2.

9. Cryosection organoïde dans la matrice de membrane de sous-sol

REMARQUE: Voir Figure 3.

  1. Retirez le milieu ENR par une aspiration douce, en prenant soin de ne pas perturber la matrice de membrane du sous-sol et en lavant doucement une fois avec 500 L de PBS.
  2. Fixer les organoïdes avec 1,0 ml de 4% paraformaldehyde (PFA) solution (Tableau des matériaux) à RT pour 30 min.
  3. Retirer le PFA par aspiration et laver délicatement deux fois avec 1 mL de PBS.
  4. Retirez le PBS par aspiration et ajoutez 1,0 ml de tampon de saccharose de 30 % à chaque échantillon. Incuber les organoïdes fixes dans le saccharose pendant 1 h à 4 oC dans une chambre froide, un réfrigérateur ou sur de la glace pour déshydrater les échantillons.
  5. Enlever le tampon de saccharose par aspiration et ajouter juste assez de composé d'emcasterie (Tableau des matériaux) pour couvrir la couche de matrice (300 l/puits) dans chaque puits.
  6. Incuber à RT pendant 5 min.
  7. Placer les échantillons dans un congélateur de -80 oC pendant 10 min, ou jusqu'à ce que le composé d'incorporation devienne solide et blanc.
  8. Placez le plat avec le composé d'incorporation congelé à RT pour permettre la fonte minimale du composé le long des bords. Utilisez un scalpel pour séparer le bloc des parois du puits.
  9. Retirez le bloc composé d'intégration de matrice à l'aide de forceps et placez-le dans un bloc de spécimens (p. ex. cryomold), en travaillant rapidement pour empêcher la fonte.
  10. Remplir complètement le moule d'un composé d'incorporation et congeler à -80 oC pendant 30 min.
  11. Utilisez le bloc est pour la section ou le stockage dans le congélateur de -80 oC pour une utilisation ultérieure.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons une technique de transduction rapide et très efficace qui exploite les nanoparticules magnétiques exposées à un champ magnétique pour délivrer le lentivirus aux cellules d'intérêt. Avec des outils facilement disponibles, nous avons appliqué cette approche non seulement pour transduire des cellules cryptiques fraîchement isolées (Figure 1A), mais aussi pour les organoïdes (Figure 2) et d'autres cellules qui son...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La culture primaire de l'épithélium intestinal adulte comme organoïdes fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de cellules souches, l'homéostasie épithéliale intestinale, et la pathologie1,2,3, 4. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 puisse être utilisée pour modifier génétiquement les organoïdes9, elle est limitée pa...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), du Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de l'American Lung Association, de l'Allegheny Health Network - Johns Hopkins Research Fund et le Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMThermo Fisher Scientific11965092Milieu de base pour cellules 293T
DMEM/F12+Thermo Fisher Scientific12634010Milieu de base pour milieu de culture d’organoïdes et tampon de digestion d’organoïdes
OPTI-MEMThermo Fisher Scientific11058021Virus Milieu de transfection
Sérum fœtalbovin Corning35-011-CVComposant du milieu de collecte de virus et du milieu 293T
Pen/StrepThermo Fisher Scientific15140122Composant du milieu de culture organoïde et du tampon de dissociation de la crypte
PBS (sans Ca2+, Mg2+)ThermoFisher Scientific10010049Un tampon de lavage et composant du tampon de dissociation de la crypte
Mem-NEAAThermo Fisher Scientific11140050Composant du milieu de culture organoïde
GlutamaxIIThermo Fisher Scientific35050061Composant du milieu de culture organoïde
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Composant du milieu de culture organoïde
EGFMillipore SigmaE9644Composant du milieu de culture organoïde
NogginPeprotech250-38 BComposant du milieu de culture organoïde
R-spondinR& D7150-RS-025/CFComposant du milieu de culture d’organoïdes
Insuline recombinante humaineMillipore SigmaI9278-5mlComposant du milieu de culture d’organoïdes
NicotinamideMillipore SigmaN3376-100GComposant du milieu de transduction
Wnt3AR& D5036-WN-010Composant du milieu de transduction
Y27632Millipore SigmaY0503-1MGComposant du milieu de transduction
0,5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020Composant du tampon de dissociation des cryptes
DTT (dithiothreitol)Thermo Fisher ScientificR0861Composant du tampon de dissociation des cryptes
Dispase IMillipore SigmaD4818-2MGComposant du tampon de digestion organoïde
DNase IMillipore Sigma11284932001Composant du tampon de digestion organoïde
matrigel(Facteur de croissance réduit)Corning356231Utilisé comme matrice pour intégrer des organoïdes
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Milieu pour la transfection dans la production virale
ViralMag R/LOz BiosiencesRL40200Particules magnétiques de transduction virale
Plaque magnétiqueOz BiosiencesMF10000Plaque magnétique pour faciliter la transduction virale
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668019Agent de transfection dans la production virale
Poly-D-LysineMillipore SigmaA-003-ERevêtement pour plaques avant ensemencement de cellules 293T
4 % de formaldéhyde SolutionBosterAR1068Solution pour fixer les organoïdes
Composé d’enrobage O.C.TThermo Fisher Scientific4583SPour l’enrobage des organoïdes
5 mL Falcon tubes en polystyrèneCorning352054
50 mL Falcon TubesSarstedt62.547.100
Orbitron rotator II Rocker ShakerBoekel Scientific260250
Microscopique inversé Olympus CK30OlympusCK30pour le balayage et le comptage des cryptes
Zeiss Axiovert 200 Fluorescence inverséeNikonAxiovert 200pour la visualisation de la fluorescence dans les cryptes
Unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-15 avec membrane Ultracel-100Milipore SigmaUFC910024Pour la concentration des virus
pluriStrainer 20 & micro ; m (Cell Strainer)pluriSelectSKU 43-50020Pour la préparation de fragments d’organoïdes
Falcon Cell StrainerFisher Scientific352340Pour la préparation de cyrpts de taille similaire après isolement de la crypte
Greiner CELLSTAR  ; plaques de culture multipuits 48 puits (TC traité avec couvercle)Millipore SigmaM8937-100EAForD2 :D37+D16 :D37g fragments d’organoïdes
Souche animale : C57BL/6JJackson Lab#000664Pour la culture d’organoïdes

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210(2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Transduction par vecteur viralculture d organo des intestinauxing nierie g n tique d organo desprotocole de cryosectionpr paration de coupes congel esmarquage immunofluorescenttransduction par vecteur lentiviralmatrice de membrane basalecryopr servation d organo des

Articles connexes