L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

Ozlem Yaren; Barry W. Alto; Kevin M. Bradley; Patricia Moussatche; Lyudmyla Glushakova; Steven A. Benner

doi:10.3791/57051

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Article de méthode

L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

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DOI :

10.3791/57051

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13 mars 2018

Ozlem Yaren¹ , Barry W. Alto² , Kevin M. Bradley³ , Patricia Moussatche³ , Lyudmyla Glushakova³ , Steven A. Benner¹^,³

¹Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), ²Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, ³Firebird Biomolecular Sciences LLC

Dans cet article

Résumé

Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.

Résumé

Zika, virus chikungunya et la dengue sont transmis par les moustiques, responsables de maladies ayant des symptômes similaires de patients. Cependant, ils ont des potentiels de transmission différent de patient à l’autre en aval et nécessitent des traitements pour les patients très différents. Ainsi, les flambées récentes de Zika qu’il est urgent de développer des outils qui sont discriminatoires rapidement ces virus chez les patients et pris au piège à moustiques, de sélectionner le bon traitement des patients et à comprendre et à gérer leur épidémiologie en temps réel.

Malheureusement, les tests de diagnostic actuels, y compris les urgences 2016 récepteur utiliser autorisations et accélérée statut, détecter l’ARN viral par reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), qui exige d’instrumentation, formation utilisateurs, et préparation de l’échantillon considérable. Par conséquent, elles doivent être transmises à des laboratoires de référence « approuvés », exigeant des temps. En effet, en août 2016, le Center for Disease Control (CDC) demandait les femmes enceintes qui avait été piqué par un moustique et présenté une éruption de Zika-indiquant d’attendre un inacceptable de 2 à 4 semaines avant d’apprendre qu’elles étaient infectées. Nous avons tellement besoin de tests qui peuvent être faits sur place, avec peu de ressources et par un personnel qualifié, mais pas nécessairement sous licence.

Cette vidéo montre un test répondant à ces spécifications, travaillant avec l’urine ou de sérum (pour les patients) ou de carcasses de moustiques écrasés (pour la surveillance de l’environnement), tout cela sans beaucoup de préparation échantillon. Carcasses de moustique sont capturées sur papier portant des groupes de d’ammonium quaternaire (papier Q) suivies par un traitement de l’ammoniaque pour gérer les risques biologiques. Ceux-ci sont ensuite directement, sans isolement d’ARN, mis dans des tubes à essai contenant des réactifs lyophilisés nécessitant aucune chaîne du froid. Une forme modifiée de la transcription inverse boucle-mediated amplification isotherme avec sondes déplaçables fluorescent étiquetés spécifique à la cible produit lecture, en 30 min, comme un signal de fluorescence trois couleurs. C’est visualisé avec un dispositif de poche, piles, avec un filtre orange. Contamination directe est empêchée avec des tubes scellés et l’utilisation de thermolabile uracile DNA glycosylase (UDG) en présence de dUTP dans le mélange d’amplification.

Introduction

Infections à virus transmises par les moustiques, y compris virus Zika, chikungunya et la dengue sont sur les stratégies de prise en charge immédiate de montée et de la demande. Virus de la dengue et le chikungunya sont déjà endémiques dans nombreuses régions tropicales où Zika se répand maintenant dans l' hémisphère occidental¹. Zika virus, comme la dengue, est membre de la famille des Flaviviridae et est originaire d’Afrique avec un asiatique et deux lignées génétiques africaine². Même si l’identification du virus Zika remonte à 1947, Zika infection chez l’homme est restée sporadique pendant un demi-siècle ava....