Article de méthode

Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

DOI :

10.3791/57053

⸱

23 janvier 2018

 ,  ,  , 
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Haute résolution respirométrie permet la mesure de la consommation d’oxygène des mitochondries isolées, les cellules et les tissus. Cellules bêta jouent un rôle essentiel dans l’organisme de contrôle de la glycémie par le biais de la sécrétion d’insuline en réponse à des concentrations élevées de glucose. La sécrétion d’insuline est contrôlée par le métabolisme du glucose et de la respiration mitochondriale. Mesurer la respiration de la cellule bêta intacte est donc essentiel d’être en mesure d’améliorer la fonction des cellules bêta comme traitement pour le diabète. En utilisant intact 832/13 INS-1 dérivé des cellules bêta, nous pouvons mesurer l’effet de l’augmentation de la concentration de glucose sur la respiration cellulaire. Ce protocole permet de mesurer la respiration cellulaire bêta en présence ou en absence de composés différents, permettant de déterminer l’effet de donné composés sur la respiration cellulaire intacte. Nous démontrons l’effet de deux composés naturels, épicatéchine monomère et curcumine, sur la respiration des cellules bêta sous la présence de faible (2,5 mM) ou des conditions de forte concentration de glucose (16,7 mM). Cette technique peut servir à déterminer l’effet de divers composés sur la respiration de la cellule bêta intacte en présence de différentes concentrations de glucose.

Introduction

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L’objectif principal de la cellule bêta pancréatique est de maintenir la normoglycémie système par le biais de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Les cellules bêta du sens des changements physiologiques dans le glucose en grande partie en raison de la faible affinité, transporteur de glucose de haute capacité GLUT2 circulant (Glucose Transporter 2 Km 16,7 mM)1. Augmentation des niveaux de glucose circulatoire, ce transporteur de faible affinité de grande capacité facilite une augmentation proportionnelle de glucose intracellulaire au sein de la cellule bêta. Glucose est métabolisé par la glycolyse et le cycle de Krebs (cycle des acides tricarboxyliques), la respiration mitochondriale entraînant des concentrations élevées d’ATP (adénosine triphosphate) cellulaire. La concentration élevée d’ATP bloque les canaux ATP sensibles K+ , ce qui entraîne une dépolarisation membranaire. Dépolarisation membranaire provoque l’ouverture des canaux de Ca2 + voltage dépendant et la libération subséquente de vésicule lié l’insuline granules2. Dysfonction des cellules bêta est une caractéristique du diabète de Type 2 (T2D) et se traduit par la sécrétion d’insuline diminuée et mal maîtrisée et, finalement, de la mort de cellules bêta3. Mécanismes de maintiennent ou d’améliorer la fonction des cellules bêta pourraient servir comme traitement pour T2D.

Des études ont démontré les effets bénéfiques de l’origine naturelle des composés à base de plantes sur les cellules bêta du pancréas4. Ces composés peuvent avoir leur effet par la prolifération de cellules bêta croissante, la survie ou la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. À titre d’exemple, des études récentes ont démontré que monomère épicatéchine améliore la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par l’augmentation de la respiration mitochondriale et augmentant l’ATP cellulaire niveaux5. Par conséquent, comprendre comment ces composés peuvent augmenter fonctionnelle des cellules bêta masse est important de tirer parti de ces composés comme agents thérapeutiques potentiels.

La respiration cellulaire peut être mesurée par un certain nombre d’outils. Utilisation d’un respiromètre haute résolution permet pour le titrage des modulateurs chimiques pour une population de cellules perméabilisées ou intact6. Cet outil permet l’ajout de composés divers, à des concentrations différentes, donnant ainsi un large éventail d’informations.

Étant donné le lien intime entre le métabolisme du glucose et la fonction des cellules bêta, mesures de la respiration cellulaire sont essentiels. Mesures de la respiration cellulaire peuvent se faire à l’aide de cellules bêta perméabilisées soit intacts, avec chacun ayant son propre ensemble d’avantages et inconvénients7,8. Alors que la perméabilisation des cellules bêta permet de mesurer les différents aspects de la chaîne de transport d’électrons, il le fait sans ce qui concerne le mécanisme d’induction de la respiration dans la cellule bêta, la captation du glucose et le métabolisme. Utilisation de la respiration des cellules bêta unpermeabilized est donc une technique très utile pour déterminer la réponse des cellules bêta à divers niveaux de glucose, à l’aide de la consommation d’oxygène comme la lecture.

Cette technique vise à mesurer la consommation d’oxygène intact INS-1 dérivé de cellules bêta 832/13. Cette technique nous permet de déterminer la réponse des cellules bêta aux conditions unstimulatory de glucose (glycémie 2,5 mM) ainsi que les conditions de stimulateur de glucose (glycémie 16,7 mM). Alors que les cellules unpermeabilized ne nous permettent pas de tester individuellement les complexes I, II ou III de l’électron chaîne de transport, la technique permet-elle de mesures portant sur la respiration de l’inhibition (oligomycine A), dételle complexe IV (FCCP-Carbonyl cyanide- 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone) et inhibe complètement la respiration (l’antimycine A). Cette étude démontre l’efficacité de la mesure de la respiration chez les cellules bêta du pancréas unpermeabilized intactes, ainsi que l’effet de deux composés naturels, épicatéchine monomère et curcumine, sur la respiration cellulaire bêta.

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Protocole

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1. Culture cellulaire

  1. Dérivée de la culture INS-1 832/13 cellules bêta RPMI 1640 additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine, 10 mM HEPES, 2 mM de Glutamine, 1 mM de Pyruvate de Sodium et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol9,10,11 ,12,13.
  2. Éliminer les cellules 832/13 un flacon T75 avec 2 mL de 0,25 % de trypsine, incubation à 37 ° C pendant 10 min. neutraliser la trypsine en ajoutant 8 mL de médias RPMI 1640.
  3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer 100 µL du volume cellulaire d’étape 1.2 dans 900 µL de PBS.
  4. Cellules de plaque 832/13 à une densité de 2 x 106 cellules/mL dans un 6 bien plat.
  5. Cellules en culture pendant 48 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO2 avant de commencer des expériences de la respiration.

2. préparation des cellules pour la respirométrie haute résolution

  1. Traitement de cellules de 832/13 avec cacao épicatéchine dérivée monomère.
    1. La culture 832/13 cellules pendant 24 h après l’ensemencement dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2à humidifié.
    2. Changer les médias 24h après l’ensemencement et traiter les 832/13 cellules avec le contrôle du véhicule (3 puits) ou 100 monomère nM cacao (3 puits), suivie de la culture pendant 24 h supplémentaires (48 h au total) dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2à humidifié.
    3. Laver les cellules 832/13 en 1 x bas Glucose sécrétion du tampon (SAB) pour 5 min. aspirer tampon et incuber les cellules 832/13 à 1 x faible concentration de Glucose SAB pendant 3 h, remplaçant 1 x faible concentration de Glucose SAB toutes les heures.
      1. Faire 10 x SAB avec 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0,7 g de MgSO4 et H2O s’ajoute un volume final de 500 mL. Filtre stérile la solution finale.
      2. Faire 1 x faible concentration de Glucose SAB avec 10 mL de 10 x SAB, 100 µL de 45 % de glucose, 2 mL de 1 M HEPES, 1 mL de 0,25 M CaCl2, 0,57 mL de solution de BSA de 35 %, 0,21 g de NaHCO3 et ajouter H2O pour un volume final de 100 mL. Filtre stérile la solution finale.
  2. Traitement de cellules de 832/13 avec la curcumine.
    1. La culture 832/13 cellules pendant 48 h après l’ensemencement dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2à humidifié.
    2. Laver les cellules 832/13 en 1 x faible concentration de Glucose SAB pour 5 min. aspirer tampon et incuber les cellules 832/13 à 1 x faible concentration de Glucose SAB pendant 3 h, remplaçant 1 x faible concentration de Glucose SAB toutes les heures.
    3. Après 2,5 h de l’incubation de 3 h dans 1 x faible concentration de Glucose SAB, aspirer tampon et incuber les cellules en 1 x bas Glucose SAB avec contrôle du véhicule ou de 40 µM curcumine pendant 30 min. Après incubation, aspirer la mémoire tampon.
  3. Récolte des cellules avec de la trypsine pour respirométrie haute résolution
    1. Après l’incubation de 3 h dans 1 x faible concentration de Glucose SAB, enlever les cellules de la plaque avec 250 µL de 0,25 % de trypsine par puits.
    2. Combiner les cellules en trypsine provenant de 3 puits traités avec contrôle du véhicule ou du composé d’intérêt avec 4 mL de SAB dans un tube conique de 15 mL.
    3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer 100 µL du volume cellulaire d’étape 2.3.2 dans 900 µL de PBS.
    4. Diluer le nombre de cellules dans 1 x faible concentration de Glucose SAB pour faire 3 mL à la concentration appropriée pour chaque chambre. Les données démontrent qu’une concentration de 1 x 106 cellules/mL est le plus efficace.
  4. Récolte des cellules avec dissociation mécanique pour respirométrie haute résolution
    1. Après l’incubation de 3 h dans 1 x faible concentration de Glucose SAB, ajouter 1 mL de 1 x bas Glucose SAB à chacun doucement et bien souffler la plaque avec dissociation mécanique des cellules en pipettant également, avec une pointe de pipette 1000 µL.
    2. Combiner des cellules de 3 puits traités avec contrôle du véhicule ou du composé d’intérêt pour un total de 3 mL SAB dans un tube conique 15 mL pour la respiration.

3. haute résolution respirométrie

  1. Préparation de la respiromètre haute résolution.
    1. Allumez le respiromètre haute résolution et vous connecter à l’ordinateur de bureau en lançant le programme d’analyse de respiromètre.
    2. Aspirer l’éthanol à 70 % depuis les deux chambres. Faites tremper ces chambres dans l’éthanol à 70 % pour un minimum de 45 min.
    3. Laver les chambres deux fois avec de l’éthanol 70 %, aspirant après chaque étape.
    4. Laver les chambres triple avec FD2O, aspirant après chaque étape.
    5. Rincer les plongeurs de la chambre en FD2O. Cela nettoie au large de l’éthanol résiduel les pistons et le port de titane.
  2. Étalonnage des sondes d’oxygène polarographique.
    1. Ajouter 2,4 mL de 1 x tampon faible glycémie SAB à chaque chambre oxygraph, en remuant le tampon continuellement à l’aide de barres magnétiques remuer dans la chambre à 750 tr/min et 37 ° C avec un intervalle d’enregistrement des données à 2.0 s en appuyant sur la touche F7 et en ouvrant l’onglet étiqueté « Systèmes ». Repousser les pistons à fond et ensuite rentrer à la position d’aération clé. Laisser la machine à équilibrer pendant un minimum de 1 heure jusqu'à ce que le flux d’oxygène stable est obtenue.
    2. Régler la machine à 37 ° C pendant la durée de l’expérience. Régler la tension de polarisation à 800 mV, avec un gain de 2 en appuyant sur la touche F7 et en ouvrant l’onglet étiqueté « Oxygen, O2». Équilibrer la concentration d’oxygène de la mémoire tampon SAB pendant au moins 30 min, tandis que la variation de la concentration en oxygène est stable (moins de 2 pmol/(s*mL)).
    3. Après stabilisation de concentration d’oxygène, sélectionnez une région où le changement de la concentration en oxygène est stable à établir la mesure de fond des changements dans la concentration en oxygène.
      1. Sélectionnez une région en appuyant sur la touche Maj enfoncée, faites un clic gauche sur la souris et en faisant glisser la souris dans l’ensemble de la région sélectionnée. Cliquez sur la lettre associée à la région sélectionnée et le changement à « R1 » pour chaque trace, correspondant à chacune des deux chambres.
      2. Double cliquez sur la case « O2 étalonnage » en bas à gauche et droite des coins de l’écran, cliquez sur le bouton « Sélectionner la marque » d’étalonner « air » comme R1 et puis sélectionnez « calibrer et copier dans le presse-papier » pour les deux chambres.
  3. Évaluation de la respiration des cellules bêta 832/13 préparé en étapes 2.1.5 ou 2.2.5.
    1. Charger les 2,4 mL d’échantillon dans chaque chambre (une chambre avec véhicule traité hématies, une chambre avec des cellules traitées composés) dans 1 x bas Glucose SAB Conserver les 0,5 mL d’échantillon cellulaire pour le dosage de la protéine par dosage de la BCA (acide Bicinchoninic) si vous utilisez l’approche mécanique de dissociation (congélation à-20 ° C pour la mesure plus tard).
      1. Enfoncer complètement le piston et aspirer le volume résiduel. Remuer les cellules en continu tout au long de l’expérience à 750 tr/min et 37 ° C pendant toutes les étapes subséquentes. Faire une marque en cliquant sur F4 et étiquetage comme « cellules » lorsque les échantillons sont chargés.
      2. Mesurer les échantillons pendant 30 min. Après la stabilisation du signal, sélectionnez une région du changement dans la concentration en oxygène correspondant à des conditions de faible concentration de glucose (2,5 mM de glucose), tel que décrit au point 3.2.3.
    2. Après que stabilisation du signal est atteinte, ajouter 12,5 µL d’une solution de 45 % de glucose stérile (concentration finale de 16,7 mM) dans chaque chambre à travers le titane à l’aide d’une seringue de port de chargement. Faire qu'une marque mesurée « Glucose » comme décrit dans 3.3.1 lorsque le traitement est ajouté. Signal de laisser stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à l’obtention d’un flux d’oxygène stable. Sélectionnez cette région du changement dans la concentration en oxygène, comme décrit au point 3.2.3. C’est la lecture de Glucose 16,7 mM et correspond aux conditions stimulant7.
    3. Après que stabilisation du signal soit atteinte, ajouter 1 µL de 5mM l’oligomycine une (2,5 µM concentration finale) dans chaque chambre à travers l’orifice de chargement. Faire qu'une marque mesurée « OligoA » comme décrit dans 3.3.1 lorsque le traitement est ajouté. Signal de laisser stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à l’obtention d’un flux d’oxygène stable. Sélectionnez cette zone de la courbe comme décrit au point 3.2.3. Oligomycine A inhibe l’ATP synthase et seul flux d’oxygène se produisant est donc par l’intermédiaire de fuite des électrons et non de la phosphorylation oxydative7.
    4. Après que stabilisation du signal soit atteinte ajoute 1 mM FCCP par incréments de 1 µL, jusqu'à obtention d’un taux maximal de la respiration. Il s’agit de la respiration maximale découplée. Entre 3 et 4 µL FCCP est suffisante (1,5 à 2,0 µM concentration finale) pour induire la respiration découplée maximale des cellules de l’INS-1 832/13. Faire une marque étiquetée « FCCP » comme décrit dans 3.3.1 lorsque le traitement est ajouté. Signal de laisser stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à l’obtention d’un flux d’oxygène stable. Sélectionnez cette zone de la courbe comme décrit au point 3.2.3. FCCP est un agent découplant. Cela permet de mesurer la respiration découplée7.
    5. Après que stabilisation du signal soit atteinte, ajouter 1 µL de 5 mM l’antimycine A (concentration finale de 2,5 µM) dans chaque chambre à travers l’orifice de chargement. Faire une marque étiquetée « AntiA » comme décrit dans 3.3.1 lorsque le traitement est ajouté. Signal de laisser stabiliser et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à l’obtention d’un flux d’oxygène stable. Sélectionnez cette zone de la courbe comme décrit au point 3.2.3.
      Remarque : Antimycine A lie cytochrome C réductase, inhibe l’oxydation de l’ubiquinone et bloque la respiration tous. Cela nous permet d’arrêter complètement la respiration7.
  4. Mesure des cellules bêta 832/13 pour la normalisation de la respiration et de concentration protéique.
    1. En utilisant le 0,5 mL de l’échantillon retenu au chargement, l’échantillon de protéine de mesure à l’aide de la méthode de la BCA13.
    2. Exécuter chaque échantillon en triple exemplaire, sans dilution, suivant les instructions du fabricant.
  5. 832/13 cellules bêta des calculs de la respiration des cellules trypsinisés.
    1. Entrez le nombre de cellules par mL utilisation dans l’essai en appuyant sur la touche F3 du programme analyse respiromètre. Régler l’unité de cellules/mL, entrez la concentration cellulaire et changer de milieu SAB à
    2. Sélectionnez les lectures de fond pour normaliser les données en sélectionnant et en entrant dans l’O2 formulaire d’étalonnage comme indiqué au point 3.2.3.
    3. Effectuez des sélections de lectures de Glucose, 16,7 mM Glucose, oligomycine A, FCCP et l’antimycine A comme décrit dans 3.3.1 2,5 mM.
    4. Le programme d’analyse respiromètre, exportez les valeurs fournies pour chaque chambre après l’entrée de concentration en protéines et en sélectionnant les valeurs moyennes appropriées pour chaque traitement lors de la mesure de la respiration. Cela se fait en cliquant sur F2, puis en poussant la « copie à fonction presse-papiers ». Cette opération exporte les données pour une utilisation dans d’autres programmes d’analyse. Utilisez les valeurs « O2 pente nég. » pour les calculs.
    5. Compiler les données pour les 3-5 essais indépendants de véhicules traitement contrôles et naturelles composés de cellules traitées pour déterminer l’effet sur la respiration cellulaire intacte des cellules bêta INS-1 832/13.
  6. calculs de la respiration de cellules bêta 832/13 de dissocient mécaniquement les cellules.
    1. Entrer dans les calculs de la protéine de l’essai de la BCA en appuyant sur la touche F3 du programme analyse respiromètre. Régler l’unité de mg, entrez la concentration BCA et changer de milieu SAB à
    2. Sélectionnez les lectures de fond pour normaliser les données en sélectionnant et en entrant dans l’O2 formulaire d’étalonnage comme indiqué au point 3.2.3.
    3. Effectuez des sélections de lectures de Glucose, 16,7 mM Glucose, oligomycine A, FCCP et l’antimycine A comme décrit dans 3.3.1 2,5 mM.
    4. Le programme d’analyse respiromètre, exportez les valeurs fournies pour chaque chambre après l’entrée de concentration en protéines et en sélectionnant les valeurs moyennes appropriées pour chaque traitement lors de la mesure de la respiration. Cela se fait en cliquant sur F2, puis en poussant la « copie à fonction presse-papiers ». Cette opération exporte les données pour une utilisation dans d’autres programmes d’analyse. Utilisez les valeurs « O2 pente nég. » pour les calculs.
    5. Compiler les données pour les 3-5 essais indépendants de véhicules traitement contrôles et naturelles composés de cellules traitées pour déterminer l’effet sur la respiration cellulaire intacte des cellules bêta INS-1 832/13.

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Résultats

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INS-1 832/13 des cellules bêta qui sont préparés et récoltées comme décrit dans le protocole fera la démonstration de modulation de la consommation d’oxygène basés sur les diverses interventions chimiques (Figure 1 a). On observera une augmentation de la respiration lorsque la concentration de glucose est augmentée à 16,7 mM Glucose (Figure 1 b). La respiration diminue lorsque les cellules intactes sont traités avec l’oligomycine A. Cette respiration s’appelle f...

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Discussion

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L’objectif du présent protocole est de respirométrie haute résolution permet de mesurer le taux respiratoires intactes les cellules bêta du pancréas. Cette méthode permet la mesure de la réponse de la cellule bêta à une augmentation de la glycémie. Le protocole permet également pour le prétraitement avec divers composés, comme l’a démontré dans ce protocole avec les naturels monomère épicatéchine ou curcumin4,5. Traitement avec di...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier les membres des laboratoires titi et Hancock pour adjoint et discussion scientifique. Les auteurs remercient Andrew Neilson, Ph.d. (Virginia Tech) pour la fourniture de la fraction de monomère de cacao épicatéchine dérivée. Cette étude a été financée par une subvention de la Diabetes Action Research and Education Foundation à JST.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
O2k Core : Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02Instrument pour la respirométrie à haute résolution
DatLab 6 ProgramOroboros Instruments27141-01Programme informatique pour l’analyse de la respirométrie à haute résolution
INS-1 832/13 lignée cellulaire DukeUniversity Medical CenterNONELignée cellulaire bêta, don du Dr Christopher Newgard
CurcumineSigmaC7727Prétraitement des cellules bêta
Cacao épicatéchine monomèreInstitut polytechnique de Virginie et Université d’ÉtatAUCUNPrétraitement des cellules bêta, don du Dr Andrew Neilson
TrypsineSigmaT4049Pour la culture cellulaire
RPMI-1640SigmaR8758832/13 média cellulaire bêta
Sérum fœtal bovinHycloneSH30071.03832/13 bêta cellule média composant
Pénicilline-streptomycineSigmaP4458832/13 bêta
média HEPESSigmaH3662832/13 bêta cellule média composant/ 1x tampon SAB
GlutamineCaissonGLL01832/13 bêta
Sodium PyruvateSigmaS8636832/13 bêta cellule média composant
2-MercaptoethanolSigmaM3148832/13 bêta cellule
média composant NaClFisherS271Composant de 10x tampon SAB
KClSigmaP9541Composant de 10x tampon SAB
KH2PO4SigmaP5655Composant de 10x tampon SAB
MgSO4SigmaM2643Composant de 10x tampon SAB
D-(+)-Glucose SolutionSigmaG8769Composant de 1x tampon SAB, chimique pour le dosage
la respiration CaCl2SigmaC5670Composant de 1x tampon SAB
35 % BSA SolutionSigmaA7979Composant de 1x tampon SAB
NaHCO3SigmaS5761Composant de 1x tampon SAB
200 proof éthanolSigma459844Washing Oxygraph O2k Chambres
Oligomycine ASigmaO4876Produits chimiques pour le test de respiration
FCCPSigmaC2920Produits chimiques pour le test de respiration
Anitmycine ASigmaA8674Produits chimiques pour le test de respiration
BCA Protein KitThermo Fisher23225Pour déterminer la concentration en protéines
cellule cellule média composant de

Références

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Oxygen ConsumptionGlucose ConcentrationCell PreparationRespirometer AnalysisOligomycin AFCCP

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