La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Summary

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

Abstract

La microglie, les cellules immunitaires résidents dans le cerveau, sont les premiers intervenants à l’inflammation ou de lésions au système nerveux central. Recherches récentes ont révélé des microglies d’être dynamique, capable d’assumer des phénotypes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Les M1 (pro-inflammatoires) et M2 phénotypes (pro-réparatrice) jouer un rôle important dans les conditions thérapeutiques tels que les lésions cérébrales périnatales et différant de la pièce fonctionne en réponse à certains stimuli de l’environnement. La modulation de l’activation des microglies a été notée pour conférer la neuroprotection, suggérant ainsi la microglie peut avoir potentiel thérapeutique dans les traumatismes crâniens. Cependant, plus de recherches sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle des microglies dans la maladie, et qui facilite le présent protocole. Le protocole décrit ci-dessous associe un procédé de centrifugation en gradient de densité afin de réduire les débris cellulaires, avec séparation magnétique, produisant un échantillon très pur des microglies primaire qui peut être utilisé pour l’expérimentation in vitro , sans le besoin de 2-3 semaines de culture. En outre, les étapes de la caractérisation d’obtenir des données fonctionnelles robustes sur la microglie, aidant les études afin d’améliorer notre compréhension de la polarisation et l’amorçage de ces cellules, qui a des implications fortes dans le domaine de la médecine régénérative.

Introduction

Dommages acquis durant la période périnatale de l’inflammation, hypoxie-ischémie et hémorragie peuvent avoir un tableau des séquelles à long terme. La physiopathologie complexe de lésion cérébrale périnatale est théorisée à impliquer l’inflammation et l’ischémie avec qui a suivi la mort neuronale et axonale¹. La réponse immunitaire innée joue un rôle important dans la cascade d’événements menant à dommage².

La microglie, les cellules immunitaires résidents dans le système nerveux central (CNS), sont les premiers intervenants à³de la blessure. La microglie sont des types....

Protocol

Les procédures suivantes ont été approuvés par le Comité d’éthique animale à l’Université de Monash. Des souris C57Bl6/J P3-6 nouveau-né non traitée en bonne santé ont servi à produire les résultats représentatifs.

1. enzymatique Digestion

Remarque : Il est important de tenir compte de la stérilité en isolant et en cultivant des cellules primaires. Tout en assurant que l’environnement est aussi stérile que possible, la dissection initiale et la récolte des cerveaux murins peuvent être complétés à l’extérieur d’une hotte à flux alvéolaire, avec toutes les étapes effectuées dans une hotte à flux laminaire.

Results

Utilisant les méthodes décrites ici, les populations pures des microglies peuvent être isolées et peuvent être prêtes pour la caractérisation à l’aide de in vitro et analyse de FACS. Dans un premier temps, jusqu'à 18 animaux peut être utilisé par l’abattage sélectif, avec un rendement attendu d’environ 450 000-600 000 de cellules microgliales. Il est crucial d’abord s’assurer de la pureté des cellules isolées, et pour ce faire, FACS analyse a été réalisée par coloration pour les .......

Discussion

Microglies ont la capacité d’être pro - et anti-inflammatoires, altéré par des stimuli de l’environnement. Des études antérieures ont montré que la modulation de l’activation des microglies peut conférer la neuroprotection. Leur capacité à protéger les neurones et réparer les blessures nécessite plus de recherche pour approfondir la compréhension actuelle de ces cellules complexes. Ainsi, isolement des microglies primaire de haute pureté est une technique importante et utile. Il s’agit d’une méthode relativement rapide à.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, faible teneur en glucose, pyruvate	Gibco	11885084
Antibiotique-Antimycosique (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grade II du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	10104159001
Papaïne du latex de papaye, solution aqeueuse tamponnée	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Sérum fœtal bovin, qualifié, inactivé par la chaleur	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Solution saline équilibrée Hank’s (1X)	Gibco	14175-103
Solution saline équilibrée Hank’s (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection	Kit StemCell Technologies	18770	EasySep variante magnétique
Aimant EasySep	StemCell Technologies	18000
Tampon EasySep	StemCell Technologies	20144
Dulbecco’s Saline tamponnée au phosphate	Gibco	14040182
Trypsine (2.5 %) (10X)	Gibco	15090-046
Chat purifié Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block&trade ;)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL Tube à essai PP à fond rond haute clarté, avec capuchon à pression,	Corning	352063
175cm ² ; Fiole de culture cellulaire à col coudé avec capuchon d’aération	Corning	431080
Lipopolysaccharides d’Escherichia coli O127 :B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 Puits TC-Treated Microplaques taille 96 puits, transparent, polystyrène, fond rond	Corning	CLS3799
Paraformaldéhyde (poudre, 95 %)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Lapin Anti-IBA1	Wako	01919741  ;
Chèvre Anti-Lapin IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
FACS Antibodies	>Company	Numéro de catalogue
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b  ;	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Solution d’iodure	Miltenyi Biotech	130-093-233