Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

Selon l’Organisation mondiale de la santé, il y a 212 millions de nouveaux cas de paludisme dans le monde en 2015 et environ 429 000 personnes sont mortes, principalement des enfants moins de cinq ans d’âge¹. Les mécanismes conduisant à une maladie grave, qui est souvent associée à une dysfonction vasculaire, restent mal définis². Plasmodium- iRBCs sécrètent des sphères petit bi-lipides membranaires appelées vésicules extracellulaires (EVs). On sait que ces véhicules électriques sont susceptibles d’être pertinents pour le processus d’infection et de la réponse immunitaire de hôte à l’infection ; Cependant, on connaît la fonction exacte de ces petites vésicules au cours de l' infection de paludisme³. Il est possible qu’ils jouent deux rôles importants : d’une part, ils pourraient contribuer à la pathogenèse en activant des macrophages^4,5; et d’autre part, ils pourraient agir comme médiateur communication cellulaire entre les parasites et entre les parasites et hôte^6,7. En fait, parasites peuvent transférer des protéines ou des acides nucléiques entre eux via EVs. Par exemple, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs peut transférer le facteur de virulence Serum Resistance-Associated (SRA) et peut également cibler les autres T. brucei et hôte érythrocytes⁸. En outre, à P. falciparum- iRBCs communiquer entre eux par le transfert d’acides nucléiques dans les véhicules électriques. Cela permet les parasites d’optimiser et de synchroniser sa croissance. En fait, les EVs pourraient être le principal régulateur de la conversion gamétocyte et donc contribuer à la régulation de la transmission Etape⁷.

Non seulement EVs réglementent les parasites, ils véhiculent aussi des interactions hôte-parasite. Nous avons récemment découvert que EVs d’iRBCs contiennent des dérivés hôte le microARN (miARN ; petites espèces d’ARN dans la fourchette de 21 à 25 nucléotides⁹) qui était absorbés par les cellules endothéliales humaines. Les miARN du serveur virtuel Exchange forme un complexe avec Ago2 stable (membre de la RNA-induced silencing complex), qui, une fois livré à des cellules réceptrices, est capable de plus précisément faire taire l’expression des gènes et qui affectent les propriétés barrières des cellules¹⁰. Protocoles standards ont été développés pour étudier la fonction du SVE. Nous décrivons ici tout d’abord un protocole qui permet le marquage fluorescent de EVs pour enquêter sur leur absorption par les cellules réceptrices. En outre, en utilisant un microscope confocal, il est possible de suivre le sort de l’EV à l’intérieur de la cellule. Plusieurs colorants fluorescents peuvent être utilisés pour suivre les EVs. Le colorant réactif-amine, 5-(and-6)-carboxyfluorescéine diacétate Succinimidyl Ester (CFSE) et fluorescentes de calcéine-AM deviennent une fois à l’intérieur des vésicules. Nous préférons utiliser le label amphiphiles, PKH, parce qu’il donne un signal plus lumineux et plus uniform. Cette approche fournit des informations importantes pour comprendre les interactions entre les véhicules électriques et de cellules réceptrices. Tandis que dans certains cas, EVs se lient à la surface des cellules, des vésicules sont rapidement absorbés. Après absorption, EVs livrent leur cargaison aux cellules, dans lequel ils exercent leurs fonctions de réglementation.

Nous décrivons ici un protocole visant à mesurer la fonction barrière de la cellules endothéliales in vitro en quantifiant le transfert d’un dextran fluorescent à travers une couche cellulaire. Traceurs plus sensibles peuvent être utilisées comme marqueurs radioactifs. Toutefois, dont ils ont besoin de précautions spéciales pour utilisation. Autres tests existent pour mesurer la fonction de barrière en vitro telles que la résistance électrique transendothéliale (TEER), qui mesure l’intégrité de la jonction serrée. Enfin les visualisation ZO-1, une protéine de jonction serrée, par immunofluorescence permet d’évaluer de l’intégrité de la jonction serrée comme bien¹⁰. EVs étant des entités complexes et hétérogènes contenant plusieurs cargaisons avec caractéristiques réglementaires potentielles, il est utile de surexprimer un ARN spécifique pour étudier ses effets sur la cellule receveuse. Par conséquent, nous définissons également un protocole qui vise à produire des lignées cellulaires stables exprimant la miRNA d’intérêt¹⁰.

Globules rouges humains ont été extraites du sang de donneurs sains, conformément aux directives de Swissethics (swissethics.ch).

NOTE : Cultures de parasite P. falciparum (3 7) et de la production de EV ont été décrites précédemment dans sebastien, et al. ¹¹ parce que P. falciparum est un pathogène humain, consulter la réglementation locale pour la manutention. Les cultures doivent être conservés stérile tout le temps.

1. fluorescence étiquetage des véhicules électriques

Remarque : La procédure suivante prend avantage de la technologie d’étiquetage de manière stable incorporer un colorant fluorescent vert (PKH67) avec des grandes queues aliphatiques dans la région de lipides de la membrane de l’EV. La réaction est effectuée dans une coloration volume contenant une concentration finale de 20 µM de PKH67 final de 200 µL. Effectuez toutes les opérations à température ambiante (20-25 ° C)

1. Place 100 µg d’EVs dans 1 mL de PBS dans un tube de microcentrifuge.
2. Centrifuger le serveur virtuel Exchange dans un tube de microcentrifuge à vitesse maximale (20 000 x g) 7 mn pour granuler.
   NOTE : Hémozoïne étant présent dans les véhicules électriques, une pastille brunâtre de rouge-foncé doit être observée. Si le surnageant est rougeâtre, puis le serveur virtuel Exchange est lysées.
3. Après centrifugation, aspirer le surnageant avec soin, afin d’éviter de supprimer n’importe quel serveur virtuel Exchange.
   Remarque : Réduire la quantité de tampon reste présent avant resuspendant EVs dans C diluant afin d’augmenter la reproductibilité et l’efficacité de la coloration.
4. Resuspendre le culot d’EV dans 100 µL de diluant ch. (2 X Suspension EV) et doucement la pipette afin d’assurer la diffusion complète.
5. Préparer un nouveau tube de microcentrifuge et ajoutez 4 µL de la solution éthanolique de colorant de PKH67 à 100 µL de diluant Vortex C. bien mélanger. Préparer cette solution de colorant 2 x (40 µM) immédiatement avant la coloration.
   Remarque : Pour éviter de tacher hétérogènes, ne pas ajouter la solution éthanolique de colorant de PKH67 directement au culot EV.
6. Rapidement, les 100 µL de 2 X EV Suspension (étape 1.4) associent les 100 µL de 2 X solution de colorant (point 1.5). Ensuite, mélanger l’échantillon en pipettant également monter et descendre de 10 fois.
7. Incuber la suspension EV/colorant de l’étape 1.6 pour 5 min protégée contre la lumière et mélanger au vortex 3 - 4 fois durant l’incubation de 5 min.
   Remarque : En incubant la suspension EV/colorant pour les plus longs n’offre aucun avantage, car la coloration est si rapide.
8. Arrêter la réaction de coloration en ajoutant un volume égal (200 µL) de sérum et incuber pendant 1 min permettre la fixation du colorant excédentaire.
   Remarque : Avant d’arrêter la coloration, appauvrissent le sérum de EVs par centrifugation à 20 000 x g pendant 20 min.
9. Laver 3 fois avec du PBS et centrifuger à 20 000 x g pendant 5 min. remettre en suspension l’EVs dans 100 µL de PBS pour atteindre une concentration finale de 1 µg/µL.

2. visualiser l’absorption du SVE par microscopie confocale

Remarque : Le protocole suivant décrit le suivi de l’internalisation EV par les cellules endothéliales cultivées sur des lamelles de verre. Les cellules endothéliales sont les cellules de la moelle osseuse endothéliales humaines semi immortalisés comme décrit dans¹².

1. Travailler dans un environnement stérile, couche de lamelles couvre-objet avec un excès de 0,01 % poly-L-lysine pendant 10 min à température ambiante (RT).
2. Aspirer la solution de la poly-L-lysine et laisser les lamelles couvre-objet sécher complètement.
3. Effectuez un comptage des cellules endothéliales viables utilisant le bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre.
4. 1 x 10⁵ cellules endothéliales dans 1 mL de Endothelial Cell croissance milieu complet contenant le mélange de supplément à la poly-L-lysine-coated lamelles couvre-objet et laisser les cellules poussent à une monocouche de transfert.
   NOTE : Le support contient des facteurs de croissance qui permettent aux cellules pour former une monocouche et pour former des jonctions serrées.
5. Une fois que les cellules forment une monocouche, aspirer le support avec précaution et ajouter 1 mL de milieu frais pour laver les cellules. Répéter une fois de plus le lavage. Ajouter 50 µg de SVE PKH67 marqués et incuber pendant 4 h.
   Remarque : Pour trouver le point de temps optimal d’absorption, une évolution temporelle peut être effectuée.
6. Après 4 h, aspirer le milieu et laver les cellules 3 fois avec du PBS pour supprimer les excès et unbound EVs. Fixer les cellules avec une solution de paraformaldéhyde de 3 % dans du PBS pendant 15 min.
   NOTE : Méthanol peut perturber l’actine au cours du processus de fixation ; par conséquent, il est préférable d’éviter toute méthanol contenant des fixateurs ou autres fixateurs à base de solvant. Il est recommandé d’utiliser le formaldéhyde exempt de méthanol comme fixatif.
7. Laver les cellules 3 fois avec du PBS. Ajouter délicatement 250 µL de 0,1 % Triton X-100 dans du PBS pour permeabilize des cellules. Incuber 5 min à RT.
8. Laver 3 fois avec du PBS. Ajouter 400 µL de tampon de blocage (5 % de BSA dans du PBS) pendant 30 min à RT pour bloquer les liaisons non spécifiques.
9. Laver les cellules une fois avec du PBS. Préparer la solution colorante en diluant 5 µL de la solution mère de phalloïdine dans 200 µL PBS/1% BSA par chaque lamelle. Pipeter 200 µL de la solution colorante sur la lamelle couvre-objet et incuber pendant 20 min à température ambiante.
10. Laver 3 fois avec du PBS. Contre-coloration l’ADN pendant 30 s avec Hoechst 33342 à une concentration finale de 2 µg/mL dans 200 µL de PBS.
11. Laver 2 x la lamelle couvre-objet en ajoutant 400 µL de PBS. Avec précaution, prenez la lamelle avec une pince et inverser sur le dessus une goutte d’antifade support de montage sur une lame de verre. Retirez doucement le support excédent avec un mouchoir en papier et sceller chaque côté avec vernis à ongles.
12. Stocker les lames à l’abri de la lumière à 4 ° C.
13. Visualiser les cellules à l’aide d’un microscope confocal laser excitations 405, 488 et 543 nm et un 63 X, objectif à huile 1,3 NA avec émissions fluorescentes au 450-470 nm (bleu), 505-530 nm (vert) et 620 nm.
    NOTE : Actine F typique coloration résultats sont présentés dans la Figure 1.

3. endothélial perméabilité

Remarque : La perméabilité cellulaire endothéliale est évaluée en mesurant le transfert de la rhodamine B isothiocyanate-dextran (moyenne MW 70 000) à travers la couche de cellules endothéliales. Dextran fournit un excellent outil pour étudier la perméabilité vasculaire.

1. Compter les cellules endothéliales viables à l’aide de 0,4 % le bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre.
2. Plaque de cellules endothéliales à une densité de 0,6 x 10⁵ cellules à confluence dans inserts de culture de tissu de 24 puits (taille des pores 0,4 µm) et laisse intacte pendant au moins 5 jours former les monocouches différenciées. Actualiser le support tous les deux jours.
3. Une fois les cellules atteignent une monocouche, charger les EVs (50 µg dans 1 mL) à la chambre haute. Ajouter la rhodamine-dextran au puits supérieur à une concentration finale de 20 mg/mL. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
4. Surveiller le transfert de la dextrane fluorescent au fond bien en mesurer l’émission de fluorescence de 40 µL d’extraits moyen. Configurer le lecteur de microplaque multimarques à 544 nm excitation et 590 nm d’émission pour les mesures.
   Remarque : La quantité de dextran diffuse peut être quantifiée à l’aide des courbes d’étalonnage mis en place avec la solution mère. En outre, les expériences cinétiques peuvent être effectuées en enlevant les petits échantillons du milieu chambre extérieure pendant un temps (Figure 2). Même sans aucun traitement, le dextran diffusera à travers la couche de cellules.

4. déterminer la sensibilité de la puromycine

Remarque : Avant transduction les lignées cellulaires avec lentivirus, il est important de déterminer la courbe de tuer d’un médicament sélectionné pour cette ligne de la cellule particulière. Pour déterminer le montant minimal de la concentration du médicament nécessaire pour tuer toutes les cellules, réaliser une expérience de réponse de dose en utilisant des doses supplémentaires du médicament sélectionné. Parce que chaque ligne de cellules de mammifère a une sensibilité différente, avant expérimentation, déterminer la concentration optimale de l’antibiotique en développant le titrage de courbe de tuer tel que décrit ci-après.

1. Compter les cellules à l’aide de l’hémocytomètre. Remettre en suspension les cellules endothéliales, à une concentration de 1 x 10⁵ cellules/mL dans le complet milieu de croissance cellulaire endothéliale contenant le mélange de supplément.
2. Plaque de 1 x 10⁴ cellules dans une plaque à 96 puits en un volume final de 100 µL de milieu de croissance cellulaire endothéliale.
3. Ajouter 100 µL de milieu contenant les antibiotiques pour obtenir une concentration de 0,1 à 10 µg/mL (voir Figure 3).
4. Examiner la viabilité de la cellule tous les 2 jours sous un microscope optique avec un objectif 20 X. La culture de cellules de 10 à 14 jours et remplacer le support contenant la puromycine tous les 2-3 jours selon la croissance cellulaire.
5. Ajouter 10 µL/puits MTS réactif dans chaque puits, mix et incuber pendant 4 h à 37 ° C dans des conditions de culture standard.
6. Secouer la plaque brièvement sur un agitateur et mesurer l’absorbance de cellules traitées et non traitées à l’aide d’un lecteur à 490 nm (Figure 3).

5. transduction des cellules endothéliales avec vecteur Lentiviral

1. Plaque de 1 x 10⁵ cellules endothéliales dans 1 mL de milieu complet la veille de la transduction. La transduction lorsque les cellules ont atteint confluence de 50 à 80 %.
2. Décongeler le lentivirus sur la glace et faire des aliquotes des stocks virales d’éviter les cycles de gel-dégel. Tournez en bas le matériel à 200 x g pendant 30 s, dans des tubes avant de l’ouvrir afin d’éviter les déversements au cours.
3. Ajouter le bromure de hexadimethrine aux cellules à une concentration finale de 8 µg/mL.
   Remarque : Le bromure de Hexadimethrine contribue à l’efficacité de la transduction, cependant dans certains cas, il pourrait être toxique pour les cellules. Par conséquent, la concentration optimale doit être déterminée en effectuant une courbe de meurtre devant la transduction.
4. Agiter la plaque doucement pour mélanger. Ajouter la quantité appropriée de particules virales (entre 0,5 à 2 x 10⁶ particules) multiplication adapté de l’infection (MOI) et agiter la plaque doucement pendant 30 s à mélanger.
5. Centrifuger le mélange de la particule virale à la cellule dans la centrifugeuse à ta pendant 45 min à 300 g pour augmenter l’efficacité de la transduction. Incuber le mélange de particules virales cellule à 37 ° C pendant la nuit.
6. Retirez délicatement le support contenant des particules viral et jeter de façon appropriée. Remplacez-le par le milieu de culture complet frais, préchauffé.
7. Commencer la sélection avec la puromycine le deuxième jour : enlever le support et le remplacer par un milieu frais contenant la concentration correcte de puromycine déterminée précédemment dans la section 4 (Figure 3).
8. Récolter les cellules après sélection de la puromycine et isoler l’ARN à l’aide d’un ARN isoler kit suivant les instructions du fabricant.
9. Effectuer la synthèse de cDNA avec le kit de miARN utilisant une transcription inverse (voir la Table des matières).
10. Mettre en place la réaction de qPCR selon le protocole cité¹³.

Nous décrivons ici les protocoles afin d’étudier les interactions des véhicules électriques avec les cellules hôtes. L’absorption du SVE fluorescent étiquetés est surveillée par microscopie confocale (Figure 1). Les cellules endothéliales relever efficacement EVs, cependant le temps d’incubation avec EVs peut être optimisé afin de suivre l’absorption. Pour une meilleure localisation des véhicules électriques à l’intérieur des cellules, tache actine avec la phalloïdine. Ensuite, nous utilisons une membrane de filtre au sommet de laquelle se développe une monocouche de cellules endothéliales. La rhodamine B isothiocyanate-dextran est appliqué sur la chambre supérieure de la membrane du filtre, et puis la perméabilité de la monocouche endothéliale est mesurée en surveillant le transfert de la dextrane fluorescent dans le bas du réservoir (Figure 2 a). En règle générale, la perméabilité des cellules endothéliales est affectée lors de l’incubation avec un nombre croissant d’EVs (Figure 2 b). Il est important de cultiver les cellules pendant plusieurs jours pour s’assurer qu’ils formeront une monocouche, autrement que le colorant se diffusera rapidement à travers les puits. Il est important de noter que même sans traitement, le dextran diffusera lentement par le biais de la monocouche cellulaire.

MicroARN sont des éléments clés du SVE et après transfert vers les cellules réceptrices, ils régulent l’expression de gène. Afin d’étudier plus précisément le rôle des miARN, c’est très utile pour eux surexpriment dans la ligne de la cellule receveuse. Ici, nous décrivons comment transduce miARN dans les cellules endothéliales. La première étape consiste à déterminer la concentration de puromycine qui tue les cellules endothéliales afin de sélectionner les cellules stablement transduits (Figure 4 a). Enfin, le niveau d’expression de la miARN peut être contrôlé et validé par qPCR (Figure 4 b).

Figure 1 : EVs sont absorbés par les cellules endothéliales. Purifiée EVs ont été marqués en vert avec PKH67 et incubé pendant 4 h avec une monocouche de cellules endothéliales. Les cellules endothéliales non traitées sont utilisées comme contrôle négatif. Après avoir lavé une vaste pour supprimer EVs non liés, les cellules ont été colorées avec la phalloïdine de colorer d’actine (rouge) et Hoechst 33342 pour colorer le noyau (en bleu). Les cellules ont été observés en microscopie confocale. Des images ont été prises à l’aide d’un microscope confocal laser et un objectif à huile 63 x 1.3 NA. Hoechst 33342 est excitée à 405 nm et dont les émissions recueillies au 450-470 nm (bleu) ; PKH67 est excitée à 488 nm, émissions recueillies à 505-530 nm (vert) ; et la phalloïdine-594 est excitée à 543 nm, émissions recueillies à 620 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : effet d’absorption de l’EV sur la barrière endothéliale. Schéma (A) de la diffusion de dextran rhodamine marquée : les cellules endothéliales sont cultivés au confluent sur le dessus d’une membrane filtrante, le dextran fluorescent est appliqué à la chambre supérieure et se diffuse dans le temps à travers la membrane. L’effet des véhicules électriques sur la perméabilité est évalué après l’ajout du SVE à la chambre supérieure en mesurant le taux de diffusion de la dextrane à la chambre basse. (B) une augmentation de la quantité d’EVs sont incubées avec des cellules endothéliales. Le transfert de dextran rhodamine marqués à travers une membrane trans-bien au fil du temps permet des mesures de perméabilité. Perméabilité à travers la couche endothéliale augmente significativement après 2 h d’incubation avec 50 à 100 µg/mL d’EVs. Les données représentent la moyenne (± s.e.m.) de 3 expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : titrage de puromycine. La solution mère de puromycine (10 mg/mL) est diluée dans RPMI 1640 additionné de sérum de veau 10 % inactivés par la chaleur (56 ° C, 30 min) foetale, pyruvate de sodium 1 mM, 2 mM de glutamine, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine. Un total de 15 µL est ajouté à 10 mL de milieu dans le tube A. Puis 7,5 mL de la solution de A tube est mélangé à 2,5 mL de RPMI au tube B. Enfin, 100 µL de la dilution sont ajoutés à 100 µL de cellules pour donner une concentration finale de 7,5 µL/mL, la 5,62 µL/mL et ainsi de suite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : génération de cellules endothéliales surexprimant miR451a. (A) Détermination de la courbe de l’assassinat de puromycine sur les cellules endothéliales. Les cellules endothéliales sont incubées avec la puromycine à doses croissantes. La viabilité a été mesurée par le test de MTS après 72 h. Les données représentent la moyenne (± s.e.m.) d’une expérience représentative. (B) RNAs dérivée de cellules endothéliales surexprimant miR451a ou un contrôle négatif ont été récoltés et la transcription de miR451a a été quantifiée par PCR en temps réel. résultats de qPCR sont normalisées par la méthode 2-Ct U6 comme un gène de la gouvernante et exprimées en moyenne (± s.e.m.) (n = 3 expériences). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.