Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.
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Article de méthode
Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La constitution génétique des acides aminés non canoniques (ANAC) via la suppression de codon stop ambre est une technique puissante pour installer des sondes artificiels et réactives moitiés sur protéines directement dans les cellules vivantes. Chaque ncAA est constituée par deux (RAA) orthogonal dédié suppresseur-/ amino-acyl-ARNt-synthétase de tRNA qui est importé dans l’organisme hôte. L’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut diffèrent grandement et insatisfaisante dans certains cas. Orthogonaux paires peuvent être améliorées en manipulant les RAA ou l’ARNt. Cependant, évolution dirigée des ARNt ou RAA à l’aide de grandes bibliothèques et les méthodes de sélection morts/vivants ne sont pas réalisables dans les cellules de mammifères. Est présenté ici, un essai basés sur la fluorescence facile et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales en cellules mammifères. Le test permet de dépistage des dizaines ou des centaines de variantes de RAA/ARNt avec un effort modéré et dans un délai raisonnable. Utilisation de ce test pour générer de nouveaux ARNt qui améliorent considérablement l’efficacité du système orthogonal pyrrolysine est décrite, ainsi que l’application de l’ANAC à l’étude des protéines G récepteurs couplés (RCPG), qui contestent les objets de la ncAA mutagenèse. Tout d’abord, en intégrant systématiquement les une ncAA photo-réticulation tout au long de la surface extracellulaire d’un récepteur, les sites de liaison des ligands différents sur le récepteur intact sont mappés directement dans les cellules vivantes. Deuxième, incorpore un RCPG de dernière génération ANAC, ultrarapide récepteur sans catalyseur marquage avec un colorant fluorescent est démontrée, qui exploite bioorthogonal cycloaddition contrainte-favorisé inverse Diels Alder (SPIEDAC) sur les cellules vivantes. ANAC peut être généralement appliquée à n’importe quelle protéine indépendamment sur sa taille, la méthode est d’intérêt général pour un certain nombre d’applications. En outre, incorporation de ncAA ne nécessite pas d’aucun équipement spécial et est facilement effectuée dans les laboratoires de biochimie standard.
Introduction
L’incorporation génétique des sondes chimiques dans les protéines est une méthode puissante pour faciliter l’étude des aspects structurels et dynamiques de la fonction des protéines directement dans le contexte autochtone de la cellules vivantes. De nos jours, des centaines d’amino-acides non canoniques (ANAC) équipés de groupes chimiques plus disparates peuvent être relativement incorporés dans les protéines par biosynthèse1,2,3,4. Entre eux, on trouve photosensibles ANAC comme photo-agents réticulants5, mis en cage-....
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Protocole
1. fluorescence-based Screening des efficacités d’Incorporation (Figure 1)
- Maintenir les cellules HEK293 dans le milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM ; taux de glycémie élevé, 4 mM de glutamine, pyruvate) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
- Les cellules des graines la veille de la transfection.
- Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet e....
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Résultats
Les grandes lignes de l’essai de fluorescence sont représenté dans la Figure 1. Le dosage est utilisé dans trois applications. En premier lieu, un certain nombre de variantes de l’ARNt pour incorporation de Lys(Boc) par la paire orthogonale Pyl est examiné. Lys(BOC) est un acide aminé stériquement semblable à Pyl. Pyl n’étant pas disponible dans le commerce, Lys(Boc) est couramment utilisé comme substrat standard pour la PylRS. Les ARNt filtré sont basées sur.......
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Discussion
Le protocole décrit une analyse simple et fiable pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales pour l’incorporation de l’ANAC protéines exprimées dans des cellules de mammifères. Le principal avantage de cette méthode en ce qui concerne les tests couramment issu des FACS est qu’il permet la préparation simultanée et la mesure d’un plus grand nombre d’échantillons et fournit des données qui sont analysées facilement à l’aide d’un logiciel ordinaire. La disponibilité d’une méthode de débit moyen pour analyser des paire.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été fondé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au titre de subventions CO822/2-1 (programme Emmy Noether) et CO822/3-1 à c. i.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Produits chimiques | |||
| Acryamide/Bisacrylamide 30 % (37,5:1) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Persulfate d’ammonium (APS) | Carl Roth | 9592.2 | |
| p-Azidophénylalanine (Azi) | Bachem | F-3075.0001 | |
| Acide borique | Sigma Aldrich | B6768 | |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Carl Roth | 8076.2 | |
| Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) | NovaBiochem | 8540430100 | |
| Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) | Sichem | SC-8000 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| DTT | Carl Roth | 6908.1 | |
| réactif de chimiluminescence amélioré (ECL) ; | 10 mg/l de luminol dans 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l ; acide p-coumarique dans le DMSO ; 30 % H2O2 (1 000 : 100 : 0,3) | ||
| Gibco) | 10270106 | ||
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher (Gibco) | A1896701 | |
| Glycérol | Carl Roth | 7533.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| KCl | Carl Roth | 6781.3 | |
| Lipofectamine 2000 ; | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Luminol | Applichem | A2185,0005 | |
| Méthanol | Carl Roth | 0082.3 | |
| MgCl2 | Carl Roth | 2189.2 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Na-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| NaOH | Grü ; ssing | 121551000 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Acide p-coumarique | Sigma-Aldrich | C9008-1G | |
| poly-D-chlorhydrate de lysine | Corning | 354210 | |
| PEI | Polysciences | 23966 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Thermo Fisher (Gibco) | 11548876 (15140-122) | |
| PMSF | Carl Roth | 6367.1 | |
| PNGase F | NEB | P0704L | |
| Inhibiteur de protéase | Roche | 11873580001 | |
| Membrane PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Lait écrémé en poudre ; | Sigma | 70166 | |
| Dodécylsulfate de sodium (FDS) | Carl Roth | CN30.2 | |
| Tetrazine-Cy3 | Jena Bioscience | CLK-014-05 | |
| Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | |
| trans-Cyclooctène-L-lysine (TCO*K) | Sichem | SC-8008 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Trypsine 2.5 | %Thermo Fisher (Gibco) | 15090046 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.2 | |
| Wasserstoffperoxid (30 %) | Merck | 1.07210.0250 | |
| Cell lines | |||
| HEK293 cells | Collection allemande de Micro-organismes et cultures cellulaires GmbH (DSMZ) | ACC-305 | |
| HEK293T cellules | Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH (DSMZ) | ACC-635 | |
| Equipment | |||
| Crosslinker Bio-Link 365 nm | Bio-Budget Technologies GmbH | 40-BLX-E365 | 5 tubes de 8 watts |
| Lecteur de plaques BMG LABTECH FLUOstar Omega ; | BMG LABTECH | ||
| strong>Plasmides | |||
| Plasmide E2AziRS | Le gène huminisé de E2AziRS a été synthétisé par Geneart (Life Technologies) | Plasmide contenant 4 copies en tandem de l’ARNt suppresseur Bst-Yam piloté par le promoteur U6 humain et une copie d’un gène humanisé pour la variante améliorée de l’Azi-tRNA synthétase (EAziRS) pilotée par un promoteur | |
| PGKplasmides mutants POI-TAG | Plasmide codant pour le POI piloté par le promoteur CMV, fusionné C-terminalement au FLAG-tag, portant un codon TAG à la position souhaitée ; | ||
| CRF1R-95TAG-EGFP | Cloné dans le MCS de pcDNA3.1 | ||
| HA-PTH1R-79TAG-CFP | Cloné dans le MCS de pcDNA3.1 | ||
| Arrestin3-FLAG | synthétisé par Genart (Life Technologies) | Cloné dans le MCS de pcDNA3.1 | |
| Antibodies | |||
| Anti-FLAG-HRP M2 conjugué ; | Sigma-Aldrich | A8592 ; | monoclonal, produit dans le clone de souris M2 |
| Anticorps anti-HRP de chèvre | Santa Cruz | sc-2004 | |
| Anticorps anti-CRF de lapin | PBL #rC69 | polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., et Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999) | |
| Anticorps anti-Ucn1 de lapin | PBL | #5779 | polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., et Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999) |
Références
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-....
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Réimpressions et autorisations
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