Article de méthode

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

DOI :

10.3791/57080

⸱

29 décembre 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine des histones modifiées de la levure Saccharomyces cerevisiae. ADN immunoprécipitée est ensuite utilisé pour la PCR quantitative pour interroger l’abondance et la localisation des modifications post-traductionnelles des histones dans tout le génome.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiquement, modifications post-traductionnelles des histones (MEA), tels que l’acétylation, méthylation et phosphorylation, sont régies par une série d’enzymes permettant d’ajouter ou de supprimer ces marques en réponse aux signaux reçus par la cellule. Ces SPTM est les principaux contributeurs à la régulation des processus tels que le contrôle d’expression de gène et de réparation de l’ADN. Immunoprécipitation de la chromatine (chIP) a été une approche instrumentale pour disséquer l’abondance et la localisation de nombreux SPTM histone dans tout le génome en réponse aux perturbations diverses à la cellule. Ici, on décrit une méthode polyvalente permettant d’effectuer la puce des histones modifiées post-traductionnellement de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Cette méthode s’appuie sur la réticulation des protéines et l’ADN à l’aide de traitement de formaldéhyde des cultures de levures, génération de lysats de levure par perle battant, la solubilisation des fragments de chromatine par nucléase micrococcique et immunoprécipitation d’ADN-histones complexes. ADN, associée à la marque d’histone d’intérêt est purifié et soumis à l’analyse PCR quantitative pour évaluer son enrichissement à plusieurs loci dans tout le génome. Des expériences représentatives sonder la localisation des marques histone H3K4me2 et H4K16ac dans le type sauvage et levure mutante sont discutés pour démontrer l’interprétation et l’analyse des données. Cette méthode convient à une variété de l’histone SPTM et peut être effectuée avec différentes souches mutantes ou en présence de diverses contraintes environnementales, ce qui en fait un excellent outil pour l’étude des changements dans la dynamique de la chromatine dans des conditions différentes.

Introduction

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La modification post-traductionnelle dynamique (PTM) des histones est un mécanisme réglementaire clé pour de nombreux processus basé sur un modèle ADN, y compris la transcription, de réplication et de réparation de l’ADN1,2. La capacité de déterminer l’abondance et la localisation précise des histones modifiées concomitantes avec ces processus est donc essentielle pour comprendre leur régulation dans des conditions différentes dans la cellule. Le développement de l’immunoprécipitation de la chromatine (chIP) comme une méthode largement découlé des études biochimiques des interactions des protéines avec de l’ADN, notamment en vitro méthodes à l’aide d’agents réticulants chimiques, conjuguée à la nécessité d’évaluer la nature dynamique des interactions protéine-ADN in vivo et à des régions spécifiques du génome3,4,5. L’avancement des technologies de séquençage et de PCR quantitative (qPCR) a également développé la capacité d’effectuer des expériences de puce avec des comparaisons quantitatives et à travers des génomes entiers, ce qui en fait un outil puissant pour disséquer les interactions ADN-protéines à plusieurs niveaux.

Actuellement, la puce est une méthode obligatoire pour tout groupe de recherche intéressé par la chromatine-régulation du génome qu’il ne sont a pas de méthodes comparables pour interroger directement le lien physique entre une histone modifié et un locus génomique spécifique dans vivo. Bien qu’il existent des variantes de cette méthode à l’aide de séquençage de la génération suivant pour mapper les modifications d’histone dans tout le génome6,7 , ces approches peuvent aborder différentes questions scientifiques et leur échelle, les coûts et ressources techniques peuvent être limitée pour certains groupes de recherche. En outre, puce-qPCR ciblée est nécessaire pour compléter ces approches en fournissant des méthodes à la fois optimiser le protocole puce avant de séquençage et de valider les résultats de l’épigénomique datasets. Approches fondées sur la spectrométrie de masse pour déterminer l’effectif complet de l’histone marques associées aux régions génomiques ont également émergé8,9,10,11, cependant, ces approches ont certaines limites concernant les régions du génome peuvent être sondées et dont ils ont besoin de compétences techniques et l’instrumentation qui ne seront pas disponible pour tous les groupes de recherche. Par conséquent, la puce reste une méthode fondamentale pour analyser l’abondance et la distribution des modifications d’histone dans des conditions diverses pour tous les groupes de recherche intéressés de l’épigénétique, la chromatine et la régulation des fonctions génomiques.

Nous décrivons ici une méthode pour modèle de puce à l’aide de la levure de bière Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pour étudier la distribution des histones SPTM à la chromatine. Cette approche s’appuie sur un certain nombre d’éléments de base des protocoles de puce développée chez la levure et également appliquées au modèle divers systèmes12,13. Interactions entre les histones modifiées et de l’ADN dans la cellule sont conservées par réticulation avec le formaldéhyde. Après préparation de lysate, fragments de la chromatine sont solubilisées en fragments de taille uniforme par digestion avec la nucléase micrococcique. Immunoprécipitation des histones modifiées est réalisée avec des anticorps soit commerciales soit généré par lab et tout associé à l’ADN est isolé et analysé pour enrichissement à certaines régions génomiques à l’aide de qPCR (Figure 1). De nombreuses modifications d’histone, la quantité d’ADN obtenu à partir de ce protocole est suffisante pour les essais de plus de 25 différents locus génomiques par qPCR.

Cette méthode de puce est très polyvalente pour surveiller la distribution d’une modification des histones unique en plusieurs souches mutantes ou les conditions environnementales, ou pour les tests multiples modifications d’histone dans les cellules de type sauvage à un certain nombre de locus génomiques. En outre, de nombreuses composantes du protocole sont facilement réglables pour optimiser la détection des deux marques histone fortement ou faiblement-abondantes. Enfin, effectuer la puce des histones modifiées dans la levure de bière offre la possibilité d’utiliser des contrôles clés pour la spécificité de l’anticorps qui sont en grande partie non disponible dans d’autres systèmes. À savoir, souches de levure peuvent être générés qui portent des mutations ponctuelles dans les résidus d’histones qui sont visés par la modification, et, dans certains cas, il n’y a seulement une seule enzyme qui catalyse la modification sur un résidu d’histone particulière (par exemple. lysine histone méthyltransférases). Par conséquent, puce peut être effectuée soit l’histone mutant ou enzyme suppression souches d’analyser la mesure dans laquelle liaison non spécifique de l’anticorps peut être survenus et générant des résultats faussement positifs. Ce contrôle est particulièrement utile pour les anticorps nouvellement développé et peut même être utilisé pour valider la spécificité de l’anticorps pour des modifications d’histone conservée avant des utiliser dans d’autres systèmes. Cette approche vient compléter d’autres méthodes pour tester la spécificité des anticorps qui permettent de distinguer entre les États de modification différents (tels que les mono-, di - et tri-méthylation), y compris les tableaux de peptides modifiés de palpage et effectuer des transferts western des histones ou nucléosomes avec modifications déterminées. Dans l’ensemble, la puce dans la levure de bière est une méthode puissante pour évaluer la dynamique de l’histone SPTM dans tout le génome et disséquer les mécanismes régissant leur règlement.

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Protocole

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1. lier les anticorps à billes magnétiques

  1. Bien mélanger les billes magnétiques de protéine A/G et transférer 20 µL de billes magnétiques par une immunoprécipitation (IP) échantillon dans un tube de 1,5 mL.
    Remarque : Lors du pipetage perles, utilisez large calibre, faible rétention conseils.
  2. Placer le tube avec des perles dans un support magnétique et permettent des perles recueillir sur le côté du tube. Retirez le surnageant.
  3. Laver les billes 3 fois avec 1 mL de froid-tampon Tris salin (SCT) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 millimètres de NaCl).
  4. Ajouter 200 µL du SCT de perles et de la quantité appropriée d’anticorps. Tourner à 8 tr/min pendant une nuit à 4 ° C.
    Remarque : Pour de nombreux anticorps PTM anti-histone, 1-3 µg d’anticorps par IP est suffisante. Toutefois, les expériences de titrage sont recommandés afin de déterminer les concentrations appropriées. Les concentrations recommandées pour les anticorps PTM histone bien caractérisés et commercial sont souvent précises et se trouvent dans les rapports publiés ou de la documentation sur le produit.
  5. Placez les perles sur un support magnétique et éliminer le surnageant. Lavez-les avec 1 mL du SCT.
  6. Remettre en suspension les perles dans 20 µL du SCT par exemple IP plus un supplémentaire 5 µL (en cas d’erreur de pipettage) du SCT.
    Remarque : Les perles peuvent être stockés à court terme à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

2. la croissance de cellules de levure

  1. Ensemencer 10 mL de la DPJ (extrait de levure 10 %, 20 % de peptone et 20 % de dextrose) avec une seule colonie de la souche appropriée et développez-le à 30 ° C durant la nuit dans un incubateur à agitation à 220 tr/mn.
  2. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) de la culture de levure à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer la culture à une OD600 = 0,2 dans 100 mL de la DPJ dans un ballon jaugé de nouveau.
  3. Cultiver les cellules à 30 ° C dans un incubateur à agitation à 220 tr/min jusqu'à ce qu’ils atteignent la phase logarithmique (OD600 = 0,6-0,8).

3. in Vivo la réticulation des protéines de l’ADN

  1. Quand les cultures atteignent la phase logarithmique, ajouter 2,7 mL de 37 % de formaldéhyde directement sur le support, pour une concentration finale de 1 % de formaldéhyde. Transférer la fiole dans un shaker à 25 ° C (ou à température ambiante) et agiter à 50 tr/min pendant 15 min.
  2. Ajouter 5 mL de glycine de 2,5 M au milieu et continuer à trembler à 50 tr/min à température ambiante pendant 5 min étancher le formaldéhyde.
  3. Transférer les cellules pour centrifuger les bouteilles et faire tourner les cellules à 5800 x g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le liquide surnageant.
    1. Laver les cellules par leur resuspendant dans 45 mL de SCT froid et transférer la suspension dans un tube conique de 50 mL. Tourner le tube à 2800 x g pendant 3 min à 4 ° C. Retirez le surnageant.
    2. Laver que les cellules dans 10 mL de froid puce tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), de 1 mM 1 % nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), conservé à 4 ° C).
    3. Faire tourner les cellules à 2800 x g pendant 3 min à 4 ° C. Retirez le surnageant.
      Remarque : Les cellules peuvent être gelés à l’azote liquide et stockées à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.

4. faire des lysats de levure

  1. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de lyse puce froid avec le fluorure phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 1 mM et une dilution de 1 : 1 000 de l’inhibiteur de protéase de levure cocktail. Transférer la suspension dans un tube à bouchon à vis 2,0 mL contenant 200 µL de perles de verre.
  2. Les cellules de transfert à un cordon battant l’appareil pour une agitation à haute vitesse à 4 ° C et Perle a battu 6 fois pour 30 s de chaque. Garder les cellules sur la glace pendant au moins 1 min entre chaque perle battant.
  3. Transférer le lysat dans un tube de 1,5 mL à l’aide de gel conseils de chargement. Centrifuger le lysat à 15 500 x g pendant 20 min à 4 ° C.
  4. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 250 µL de tampon de Digestion MNase (10 millimètres Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1 % NP-40, stockés à 4 ° C) par pipetage doucement verticalement.
  5. Ajouter 2,5 µL de MNase dans les réactions. Mélanger doucement en retournant le 4 - 6 fois et immédiatement il incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 20 min.
    Remarque : Les conditions de recueil doivent être optimisées quand un nouveau stock de MNase est utilisé. Voir l’étape 10 pour le protocole.
  6. Placer immédiatement les tubes sur la glace pour arrêter la réaction et ajouter 5 µL de EDTA 0,5 M pour une concentration finale de 10 mM EDTA. Mélangez-les délicatement par inversion.
  7. Centrifuger la réaction à 15 500 g pendant 15 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    NOTE : Chromatine (digérée) Soluble sera dans le surnageant. Le granule contient des débris cellulaires rien non digérés et insoluble.

5. immunoprécipitation (IP) modification des Histones

  1. Déterminer la concentration de la protéine de chaque fraction de chromatine MNase-réalisé à l’aide d’une analyse de Bradford. Ajouter 1 mL de réactif de Bradford à chacun des 8 cuvettes jetables plus 1 cuve supplémentaire pour chaque échantillon de protéine à tester.
    1. Préparer une solution de 2 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA).
    2. Ajouter le volume approprié pour atteindre les concentrations suivantes de BSA dans 1 mL de réactif de Bradford : 0 µg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 µg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL et 10 μg/mL. Ajouter 2 μL de la fraction de la chromatine MNase-réalisé dans les cuvettes supplémentaires.
    3. Couvrez le dessus de chaque cuve avec un petit morceau de parafilm et inverser les cuvettes de 4 à 6 fois pour bien mélanger la solution. Incuber les cuves à température ambiante pendant 15 min.
    4. À l’aide d’un spectrophotomètre de lumière visible, mesurer l’absorbance à 595 nm pour la courbe d’étalonnage et les échantillons expérimentaux.
      Remarque : Utilisez la cuvette sans BSA (0 μg/mL) à blanc le spectrophotomètre avant de prendre la première mesure.
    5. Tracer une courbe d’étalonnage en utilisant les valeurs d’absorbance pour les différentes concentrations de BSA sur les logiciels associés avec le spectrophotomètre ou tableur. Basé sur la courbe d’étalonnage et le facteur de dilution utilisée (1/500), utiliser les valeurs d’absorbance pour calculer la concentration de protéine pour chacun des échantillons de fraction la chromatine.
  2. Pour chaque adresse IP, ajoutez 50 µg de protéines totales de la fraction de la chromatine MNase-réalisé à tampon de lyse ChIP pour atteindre un volume final de 1 mL.
    Remarque : Si la mise en place plus d’une IP par lysat, faire un mélange maître du lysat et ChIP tampon de lyse et aliquote de 1 mL à tubes individuels pour la période d’enquête.
  3. Retirer 100 µL du mélange IP à traiter que l’échantillon d’entrée. Congeler l’échantillon d’entrée à-20 ° C jusqu'à l’étape 7.1.
    Remarque : N’importe quel échantillon restant de la chromatine aussi peut être congelé à-20 ° C et utilisée pour une adresse IP suivante si vous le souhaitez.
  4. Ajouter 20 µL de billes magnétiques de A/G de protéine préalablement lié avec anticorps à chaque échantillon IP.
Faire tourner l’échantillon à 8 tr/min pendant 3 h (standard) ou jusqu’au lendemain (si vous préférez) à 4 ° C.

6. Lavez les IPs et éluer Complexes ADN-histones

  1. Placer les tubes dans un support magnétique et laisser les perles à percevoir sur les bords du tube. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Laver les billes successivement avec 1 mL de chacune des tampons ci-dessous.
    1. Effectuer chaque lavage en tournant à 8 tr/min pendant 5 min à 4 ° C, placer les perles sur un support magnétique, éliminer le surnageant et l’ajout de tampon suivant : x 2 - tampon de lyse puce, 2 x - haut sel lavage tampon (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, EDTA 1 mM 1 % NP-40, stockés à 4 ° C), 1 x - tampon de lavage LiCl/détergent (10 mM Tris-HCl pH 8,0, LiCl, EDTA, 1 % NP-40, désoxycholate de sodium à 1 %, de 1 mM à 250 mM stocké à 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, conservé à 4 ° C) et 1 x - TE.
    2. Avec dernier lavage TE, transférer des perles dans un nouveau tube à l’aide de 0,5 mL de TE à transférer la plupart des perles, puis une autre 0,5 mL de TE laver le tube et transférer des perles restantes.
  2. Ajouter 250 µL de tampon d’élution fraîchement puce (1 % SDS, 1 mM NaHCO3). Vortex la solution brièvement. Faire pivoter les échantillons à 8 tr/min pendant 15 min à température ambiante.
  3. Placer le tube sur un support magnétique et collecter les perles. Avec précaution, transférer le surnageant dans un nouveau tube et éviter les perles.
    Remarque : L’éluat contient immunoprécipitée protéines et l’ADN associée.
  4. Ajouter un autre 250 µL de tampon d’élution puce à perles. Faire pivoter les échantillons à 8 tr/min pendant 15 min à température ambiante.
  5. Transvaser avec soin le surnageant dans le tube contenant l’élution en premier. Le cas échéant, retirer un plus petit volume (240 µL) pour toutes les adresses IP pour ne pas perturber les perles.

7. inverser les liaisons protéine-ADN

  1. Décongeler les échantillons d’entrée et ajouter 400 µL de tampon d’élution de puce à chaque entrée.
  2. Pour les entrées et les échantillons de la propriété intellectuelle, ajouter 20 µL de 5 M de NaCl, 5 µL de glycogène de 20 mg/mL et 12,5 µL de 20 mg/mL mélange de protéinase K. bien en inversant ou en effleurant les tubes. Incuber les échantillons dans un bain d’eau de 65 ° C pendant la nuit.

8. purifier et de se concentrer d’ADN

  1. Ajouter 10 µL de 10mg/mL RNase A à l’entrée et les échantillons de la propriété intellectuelle. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min.
  2. Ajouter 600 µL d’alcool phénol : chlorofrom:isoamyl (25:24:1 PCI) dans la solution aqueuse et mélangez-les bien. Les tourner à 15 500 g pendant 5 min à température ambiante.
    1. Retirer la couche aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter 600 µL de PCI et mélangez-les bien. Tourner le tube à 15 500 g pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.
      ATTENTION : Travailler sous la hotte et porter un équipement de protection individuelle approprié lorsque vous travaillez avec PCI. Éliminer les déchets liquides et solides tel qu’indiqué par les lignes directrices.
  3. Ajouter 0,1 x volume d’acétate de sodium 3M et 1 mL d’éthanol froid de 100 % à précipiter l’ADN. Inverser le tube de 4 à 6 fois pour bien mélanger la solution. Incuber à-20 ° C jusqu’au lendemain.
    1. Tourner le tube à 15 500 x g pendant 20 min à 4 ° C. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette.
    2. Laver le culot dans 1 mL d’éthanol à 70 % froid. Le tourner à 15 500 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette.
    3. Sécher à l’air des granulés dans la hotte pendant environ 20 min (jusqu'à ce que complètement sec). Remettre en suspension dans 50 µL d’eau exempte de nucléase échantillons IP et remettre en suspension les échantillons d’entrée dans 100 µL d’eau exempte de nucléase. Conserver les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu'à l’exécution de qPCR.

9. quantitative PCR (qPCR) pour détecter les régions génomiques enrichi

  1. Faire un mélange maître de qPCR pour chaque série d’amorces. Une réaction contient 5 µL du mélange de x qPCR 2, 0,25 µL d’apprêt avant de 20 µM et 0,25 µL d’apprêt inverse de 20 µM.
    NOTE : Amorces appropriés et les essais pour qPCR expériences sont décrites ailleurs14,15,16.
  2. Faire des mélanges maîtres ADN pour chaque échantillon d’ADN. Une réaction contient 0,5 µL d’ADN et 4,0 µL d’eau exempte de nucléase.
  3. Ajouter 5,5 µL du mélange maître apprêt approprié et 4,5 µL du mélange maître ADN approprié à chaque puits sur une plaque 384 puits qPCR.
    Remarque : Démarrer avec l’ajout de 5,5 µL du mélange amorces dans chaque puits. Faites tourner la plaque à 200 x g pendant 1 min à température ambiante avant d’ajouter 4,5 µL du mélange ADN.
  4. Respecter le joint de la plaque et un essorage à 200 x g pendant 1 min à température ambiante.
  5. Effectuer qPCR utilisant un système de qPCR en temps réel avec les conditions suivantes : 95 ° C pendant 3 min ; 40 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s ; courbe de fusion 65 ° C et 95 ° C avec des intervalles de 0,5 ° C, 5 s.
  6. Pour chaque paire d’amorces, calculer l’entrée pour cent de l’échantillon de la propriété intellectuelle par rapport à l’échantillon d’entrée de 5 % utilisé dans le qPCR. Utiliser les moyens de la géométrie PCR technique pour effectuer les calculs.
    Remarque : Si une variation importante est observée dans la géométrie de la PCR, il est préférable de répéter le qPCR avec attention à la composition du mélange maître, pipetage erreurs et contamination croisée entre les puits de la plaque 384 puits.
    1. Ajustez les valeurs de Cq pour l’entrée à 100 % en soustrayant le nombre de cycles, ce qui représente le facteur de dilution des valeurs brutes de Cq.
      Remarque : L’entrée de cinq pour cent représente un facteur de dilution d’un facteur 20, ce qui équivaut à 4,32 cycles (log2 20 = 4,32).
    2. Calculer le pourcentage d’entrée comme 2 ^ (Cqentrée - CqIP) multiplié par 100.

10. Déterminez MNase Digest Conditions (recommandé avant complète la première puce Experiment)

  1. Suivez les étapes 2.1 à 4.4 du protocole précédent. Intensifier le protocole pour générer assez de lysat pour plusieurs échantillons de MNase digestion de la pastille contenant la chromatine. À l’étape 4.4, Resuspendre les pellets dans 1,25 mL de tampon de Digestion MNase. Aliquote les échantillons à 5 tubes de sorte que chaque contient 250 µL de l’extrait concentré de chromatine resuspendu dans un tampon MNase Digestion.
  2. Ajouter 0, 1.5, 2.5 ou 5 µL de MNase dans chaque tube. Mélanger doucement en retournant le 4 - 6 fois et immédiatement faire incuber les tubes dans un bain-marie à 37 ° C pendant 20 min.
  3. Arrêter les réactions en immédiatement placer les tubes sur la glace et ajouter 5 µL de EDTA 0,5 M pour une concentration finale de 10 mM.
Mélanger doucement la solution par inversion.
  • Centrifuger les tubes à 15 500 g pendant 15 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  • Ajouter SDS à concentration finale de 1 % (25 µL de solution 10 %) et de NaHCO3 à concentration finale de 0,1 M (25 µL de la solution mère de 1 M) pour les échantillons dans les tubes de 1,5 mL.
  • Ajouter 20 µL de NaCl 5M, 5 µL de glycogène et 12,5 µL de protéinase K de la 20mg/mL dans les échantillons dans les tubes de 1,5 mL. Les incuber à 65 ° C pendant la nuit.
  • Ajouter 10 µL de RNaseA 10 mg/mL. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  • Ajouter 300 µL de PCI dans la solution aqueuse et mélangez-les bien. Tourner à 15 500 g pendant 5 min à température ambiante.
    1. Enlever la couche aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter 300 µL de PCI et bien mélanger. Tourner à 15 500 g pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.
  • Ajouter 0,1 x volume d’acétate de sodium 3M (généralement ~ 30 µL) et 1 mL d’éthanol froid de 100 % à précipiter l’ADN. Inverser le tube de 4 à 6 fois pour bien mélanger. Incuber les tubes à-80 ° C pendant 1 h ou -20 ° C jusqu’au lendemain.
    1. Tourner le tube à 15 500 x g pendant 20 min à 4° C. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette.
    2. Laver les boulettes dans 1 mL d’éthanol à 70 % froid. Tourner à 15 500 g pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Laissez que les pellets sécher à l’air dans la hotte environ 20 min (ou jusqu'à ce que complètement sec). Remettre en suspension les pellets dans 30 µL d’eau exempte de nucléase.
  • Ajouter le colorant de chargement de l’ADN et exécuter 20 µL sur un gel d’agarose 2 % gel pour visualiser les ADN digéré.

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    Résultats

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Un élément clé de ce protocole est l’optimisation de la concentration de la nucléase micrococcique (MNase) utilisée pour digérer la chromatine en fragments solubles, tel qu’indiqué à l’étape 10. Cela est essentiel pour obtenir des données de haute résolution concernant la répartition des modifications d’histone à régions génomiques d’intérêt. Un titrage MNase devrait être effectuée pour déterminer la concentration plus appropriée pour atteindre principalement mono-nucléosomes avec une pet...

    Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    La procédure décrite ici permet la récupération efficace des ADN associé à des histones modifiées dans les cellules de levure par immunoprécipitation. Elle est suivie de qPCR en utilisant des amorces qui amplifient des régions d’intérêt pour déterminer un enrichissement local ou l’appauvrissement des modifications des histones spécifiques. En dépit d’être mis au point il y a près de 20 ans, puce reste le test décisif pour enquêter sur le statut de modification des histones à différentes régions génomiques et dans des con...

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    Déclarations de divulgation

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Remerciements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire vert pour discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions NIH R03AG052018 et R01GM124342 à E.M.G.

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Extrait de levureResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptoneResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldéhydeSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylphényl-polyéthylène glycolSigma-Aldrich74385Equivalent à NP-40
    MgClThermoScientific S25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    Dodécylsulfate de sodiumAmrescoM107-1KG
    Désoxycholate de sodiumSigma-Aldrich30970-100G
    Acétate de sodiumSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Cocktail inhibiteur de protéase de levureVWR10190-076
    25 Phénol :24 Chloroforme :1 Alcool isoamyliqueVWR Life Science97064-824
    ÉthanolSigma-AldrichE7023
    Eau sans nucléaseVWR100720-992
    NucléasemicrococciqueWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A  ;Sigma-AldrichR6513-50MG
    Réactif de dosage BradfordThermoScientific23238
      ; BSA Standard 2 mg/mLThermoScientific23210
    &alpha ; H4EMD Millipore04-858
    &alpha ; H4K16acEMD MilliporeABE532
    &alpha ; H3Abcamab1791
    &alpha ; H3K4me2Motif Actif39142
      ; Mélange qPCR High RoxAccuris qMax Vert, Mélange qPCR Low RoxACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetic BeadsThermoScientific88803
    Support magnétique pour tubes de 1,5 mLFisher ScientificPI-21359
    Billes de verre lavées à l’acideSigma-AldrichG8772
      ; Homogénéisateur de microtubesBenchmarkD1030
    Tubes à bouchon à vis de 2,0 mL avec bagues d’étanchéitéSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Embouts de chargement de gelFisher Scientific07-200-288
    CuvettesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    Tubes coniques de 50 mLFisher Scientific14-432-22
    Plaque PCR à 384 puitsFisher ScientificAB-1384W
      ; Agitateur de sol giratoireNouveau-Brunswick Modèle scientifiqueG10
    SpectrophotomètreThermoScientificND-2000c
      ; Système de détection PCR en temps réelBio-Rad1855485

    Références

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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    Nucl ase micrococciquePCR quantitativelysat de levurer ticulation au formald hydebilles magn tiquesH3K4me2H4K16ac

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