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Article de méthode

Fractionnement pour la résolution des espèces de la huntingtine solubles et insolubles

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DOI :

10.3791/57082

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27 février 2018

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1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

On décrit une méthode pour le fractionnement de la huntingtine mutante solubles et insolubles espèces de souris cérébrale et la culture cellulaire. La méthode décrite est utile pour la caractérisation et la quantification des flux de protéine huntingtine et sida en analysant l’homéostasie des protéines dans la pathogenèse de la maladie et en présence de perturbations

Résumé

L’accumulation de protéines mal repliées est au cœur de la pathologie de la maladie de Huntington (MH) et de nombreuses autres maladies neurodégénératives. Plus précisément, une caractéristique pathologique de la HD est l’accumulation aberrante de la protéine mutante de HTT (mHTT) dans des complexes de poids moléculaire élevé et inclusions intracellulaires composé de fragments et d’autres protéines. Les méthodes conventionnelles pour mesurer et comprendre que les contributions des diverses formes de mHTT contenant des agrégats incluent la microscopie en fluorescence, analyse par western blot et filtre piègent essais.

Cependant, la plupart de ces méthodes est la conformation spécifique et donc ne peut pas résoudre l’état complet du flux protéine mHTT en raison de la nature complexe de la solubilité globale et la résolution.

Pour l’identification des mHTT agrégée et les diverses formes modifiées et complexes, la séparation et la solubilisation des agrégats cellulaires et des fragments est obligatoire. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et visualiser mHTT soluble, monomères, oligomères, fragments, et un haut poids moléculaire insoluble (HMW) accumulé mHTT espèces. HMW mHTT des pistes avec la progression de la maladie, correspond avec lectures de comportement de la souris et a été bénéficiaire modulée par certaines interventions thérapeutiques1. Cette approche peut être utilisée avec le cerveau de souris, les tissus périphériques et culture cellulaire, mais peut être adaptée à d’autres systèmes modèles ou les contextes de la maladie.

Introduction

La perturbation des réseaux de contrôle de la qualité de protéines qui assurent le repliement adéquat et la dégradation des protéines cellulaires sont probablement centrale au département de pathologie de la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et autres « repliement » troubles de2,3. Une compréhension détaillée des composants réseau protéostasie et de leurs contributions à la pathologie sont donc cruciaux pour développer des interventions thérapeutiques améliorées. HD est causée par la dilatation anormale d’une répétition CAG dans le gène HD résultant dans un tronçon élargi de polyglutamines (polyQ) dans les protéines de la huntingtine (HTT)4. Une caractéristique constante pathologique de la pathogenèse de la HD est la résultante mauvais repliement, l’accumulation et l’agrégation de HTT dans certaines régions du cerveau et dans les tissus périphériques, qui s’est avéré interférer de plusieurs manières avec la fonction et l’homéostasie cellulaire normale 5 , 6. HTT tandis que s’exprime de façon ubiquitaire, moyennes neurones épineux dans le striatum sont sélectivement vulnérables et plus ouvertement touchés avec atrophie corticale notable, également associée à la pathogenèse de la HD.

Un marqueur de proxy pour la progression de la maladie et dominant négatif gain de fonction pour mHTT7a été généralement la formation d’agrégats de HTT dans le cerveau des patients de la HD et des modèles animaux. Bien que les mécanismes précis par quelles protéines mauvais repliement et agrégation peuvent contribuer à la toxicité induite par le mHTT demeurent obscures, la formation de ces inclusions dans le cerveau de patients HD et divers modèles animaux est une caractéristique invariante et inévitable. Inclusions semblent se composent en grande partie d’accumulé HTT fragments contenant du N-terminal élargi polyQ, indiquant que la protéolyse et traitement de pleine longueur HTT ainsi que8,d’épissage alternatif9 peut jouer un un rôle important dans la pathogenèse des fragments HTT HD. N-terminal peut constituer une forme pathologique de HTT pouvant regrouper rapidement, noyaux et accélérer ou propager l’agrégation processus10.

Toutefois, la présence de ces inclusions n’est pas nécessairement proportionnelle avec la toxicité induite par HTT ou cellule mort11. HTT a été proposé de subir un processus d’agrégation d’un monomère soluble par espèce oligomérique soluble et feuillet β fibrilles insolubles des agrégats et des inclusions12. Résoudre ces espèces de protéines différentes via des épreuves biochimiques standards a été un défi dans le domaine en raison de leur stabilité dans le tampon de lyse de la basse-détergent et difficulté à visualiser à l’aide des épreuves biochimiques standards. Ainsi, considérations méthodologiques sont essentielles pour détecter le degré et le mode de mHTT accumulé et agrégée.

Le protocole présenté ici permet de visualiser plusieurs intermédiaires de HTT, spécifiquement la formation d’une espèce de HMW HTT insoluble qui semble suivre de près avec HD pathogenèse et maladie progression1,13 ,14. Être capable de résoudre et de suivre les multiples espèces de mHTT fournit aux chercheurs un outil biochimique pour étudier la pathogenèse de la maladie et évaluer des interventions thérapeutiques potentielles par le biais de leur modulation et leur impact sur la pathogenèse de la maladie.

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Protocole

Énoncé d’éthique animale - expériences ont été réalisées en stricte conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health et un protocole de recherche animale approuvés par l’animalier institutionnel et Comité d’urbanisme ( IACUC) à l’Université de Californie, Irvine, un AAALAC accrédités par institution. Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances animales.

1. préparation des mémoires tampons de Lysis

  1. Préparer « Solubles » tampon de lyse (10 mM Tris pH 7,4, 1 % Triton X 100, 150 mM NaCl, 10 % de glycérol) et filtrer sur filtre à 0,22 µm stérile.
    1. Pour un tampon de lyse « Solubles » travail, mesurer le N-éthylmaléimide (NEM) et soigneusement dissoudre dans 100 mM phenylmethysulfonyl fluor (PMSF) dissous dans 100 % EtOH.
      Remarque : Inhibiteurs de tampon lyse : (i) 20 mM N-éthylmaléimide (NEM) ; (ii) 0,2 mM PMSF ; (iii) 1 mM orthovanadate de Sodium (Na3VO4) ; (iv) 1 µg/mL leupeptine ; (v) 1 µg/mL aprotinine ; (vi) 20 mM le fluorure de Sodium (NaF).
      ATTENTION : Porter un masque lorsque vous travaillez avec NEM dans tout le protocole. Tampon de lyse de travail doit être faite frais afin d’assurer des inhibiteurs actifs.
    2. Pour le tampon de lyse soluble avec des inhibiteurs de protéase, ajouter inhibiteurs dans l’ordre suivant : fluorure de Sodium (NaF), au volume avec de tampon de lyse froid, orthovanadate de Sodium (Na3VO +4), aprotinine et leupeptine.
  2. Pour « Insoluble » tampon de lyse, complément à 4 % SDS en ajoutant 500 µL de 20 % SDS à 2 mL de tampon de lyse « Soluble ». Laisser à température ambiante.
    NOTE : SDS se précipiter lorsqu’ils sont conservés à 4 ° C ; Gardez ceci à température ambiante. Composition de tampon de lyse finale : 10 mM Tris (pH 7,4) ; X-100 de 1 % de Triton ; 150 mM NaCl ; 10 % de glycérol ; 4 % SDS (Insoluble uniquement).

2. solubles/insolubles fractionnement protocole

Remarque : Voir la Figure 1 pour une représentation schématique.

  1. Deux séries de tubes pour chaque échantillon de l’étiquette : « Soluble » et « Insolubles ».
  2. Ajouter X-µL glacée travail soluble de tampon de lyse additionné d’inhibiteurs de la protéase (voir point 1.1.1) au tissu.
    Remarque : X = Volume varie en fonction des tissus ; Voir le tableau 1.
  3. Pour le tissu de cerveau de souris (c.-à-d., striatum), dounce lentement 30 fois en verre 1 mL douncer et pipette dans « Insoluble » étiqueté tube (restez sur la glace).
    Remarque : Veillez à ne pas à briser la surface de liquide après le démarrage de douncing, comme bulles seront forme et peuvent produire une homogénéisation incomplète.
  4. Pour les cellules (c.-à-d., HeLa, HEK293T), rincer les cellules une fois avec le froid, 1 x PBS. Enlever des PBS et appliquer un volume minimal de tampon de lyse aux cellules et soulever avec grattoir de cellules.
    Remarque : Pour au-dessus des lignées de cellules, cellules ont été plaqués à 5 x 105 cellules / plaque bien 6 et atteint près de confluence. L’un est bien comparable aux volumes utilisés pour souris striatum.
  5. Transfert de homogénat ou cellule lysat en intitulée, « Insolubles » tubes et lyse sur glace 1 h (horloge après transformée de tube final).
    Remarque : Pour les lysats cellulaires, triturer plusieurs fois pour briser les mottes de la cellule avant de commencer l’incubation. Eviter la formation de bulles. Vortex d’impulsion brièvement chaque échantillon pour 1 s au milieu de la lyse.
  6. Centrifuger les échantillons à 4 ° C à 15 000 x g pendant 20 min.
  7. Récupérer le surnageant comme la fraction « Soluble ».
    1. Enlever avec la pipette, veillez à ne pas déranger la couche de granulés/nuageux que cela finira par contaminer la fraction. Fraction soluble pipette dans « Soluble » étiqueté tube. Rester sur la glace.
  8. Laver le culot avec 500 µL de tampon de lyse (x2) et centrifuger à 4 ° C à 15 000 x g pendant 5 min après chaque lavage ; C’est OK si certains de la couche nuageuse est reversé au large.
  9. Après le lavage final, supprimer tous les tampon de lavage restant, laissant seulement la pastille de tissu.
    NOTE : De ce point, insoluble échantillon devra maintenant être conservé à température ambiante.
  10. Granule de remettre avec X-µL de tampon de lyse additionné de 4 % SDS (Volume peut être ajusté selon la taille de granule ; voir tableau 1).
  11. Soniquer chaque échantillon pendant 30 s à température ambiante avec un sonicateur sonde (125 Watts, 20kHz, impulsion, Amplitude 40 %, voir Table des matières).
  12. Faire bouillir les échantillons (de roulement ébullition) pendant 30 min ; Centrifuger brièvement (15 s) à 6 000 x g quant à ne pas perdre n’importe quel échantillon.
  13. Effectuer l’analyse de protéine de DC (détergent compatible) (voir la Table des matières) ou dosage protéique Lowry pour mesurer la concentration de protéines (recommandée a commencé des dilutions de 1/5 de l’échantillon dans un tampon de lyse respectifs pour la culture cellulaire et 1/10 pour lysats de tissu).
    Remarque : Les concentrations de protéines devront être lus en utilisant un dosage DC ou Lowry en raison de la forte concentration de détergent.
  14. Échantillons aliquotes en 50 lots µL pour éviter les problèmes de gel-dégel.
    NOTE : Protocole peut être suspendue ici avant plus loin l’analyse biochimique en stockant les deux fractions à-20 ° C.

3. quantification et Western Blot

  1. Effectuer des transferts western comme il est indiqué ailleurs1,13 par dilution de 30 µg d’échantillon 1:1 en chargement tampon (1.6 x colorant, 1 x réduction de chargement).
    Remarque : 30 µg de protéines par fraction est suffisante, mais peut être ajustée pour une résolution optimale. 3 - 8 % Tris-acétate poly-acrylamide gels doivent être utilisés pour la fraction insoluble. 4 à gels de bis-Tris de 12 % sont recommandés pour la fraction soluble.
  2. Faire bouillir les échantillons (ébullition) pendant 5 min. Centrifuger brièvement (15 s) à 6 000 x g pour recueillir l’échantillon.
  3. Analyser les fractions par SDS-PAGE et tache occidentale, selon le protocole du fabricant pour les échantillons réduits.
    Remarque : La fraction Insoluble résout mieux lorsqu’il est transféré sur une membrane de nitrocellulose 0,45 µM. 0,45 ou 0,2 nitrocellulose µM peut être utilisé pour la fraction soluble, selon la taille de la protéine d’intérêt. Certaine optimisation peut être exigée pour le meilleur transfert de matériaux HMW.
  4. Souillez membrane avec taches de protéines entières (p. ex., MEMcode, voir la Table des matières) pour visualiser les protéines efficacité de chargement.
    Remarque : Les transferts Western peuvent être analysés par intensité moyenne pixel. Fractions solubles peuvent être normalisées à une protéine de ménager mieux adaptée pour le système expérimental. La fraction insoluble comme l’abondance relative de protéines a été vérifiée par coloration réversible des protéines ou Histone 3 normalisation sur la tache distincte.

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Résultats

Résolution de lysats cellulaires solubles et insolubles après fractionnement peut être détectée à l’aide de tests Ouest analyse et filtre de retard (Figure 2). À titre d’exemple, cellules HEK293T ont été transfectées utilisant le réactif de transfection (p. ex., lipofectamine 2000), avec exon HTT 1 cDNA codant contenant 97 glutamine répète15 suivie de la région riche en proline poly et ces cellules ont été autorisés à Express ...

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Discussion

Quelques précautions sont nécessaires pour les protocoles ci-dessus garantir des résultats cohérents et quantitatives. Tout d’abord, mHTT dans les deux fractions sera spontanément forment des agrégats au fil du temps sur plusieurs cycles de gel dégel, notamment lorsque, dans une concentration élevée. Il est donc essentiel pour geler les aliquotes des protéine preps et décongeler uniquement le volume nécessaire avant d’exécuter l’essai tel que décrit dans le protocole ci-dessus. En outre, si la fraction insoluble donne bl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les NIH (RO1-NS090390). Nous tenons également à remercier le Dr Joan Steffanfor assistance technique et la discussion lors de l’élaboration de ce test.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre stérileMilliporeSCGP505REBouchon à vis, filtre stérile sous vide
1 mL Broyeur de tissus, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModèle Q125
DC Protein AssayBiorad5000111Comparable à Lowry
assay Tris 1M solution tamponAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M solutionTeknovaS0251
GlycérolFisherBP229-1
20 % SDS solutionTeknovaS0295
N-éthylmaléimideSigmaE1271
Phénylméthylsulfony fluorureSigmaP7626créer 100mM solution mère en 100 % EtOH, stocker à 4° ; C
Orthovanadate de sodiumSigmaS6508Créer une solution mère de 0,5 M dans l’eau
LeupeptinSigmaL2884Créer une solution mère de 10 mg/ml dans l’eau
AprotininSigmaA1153Créer une solution mère de 10 mg/ml dans l’eau
Fluorure de sodiumSigmaS4504Créer une solution mère de 500 mM dans l’eau
Anti-HTTMilliporeMAB5492Utiliser 1:1000 pour le western blot, 1:500 pour le test de retard de filtre
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Utiliser 1:1000 pour le western blot soluble

Références

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