Échantillonnage de Sap de phloème de Brassica napus pour 3D-PAGE des protéines et des Complexes ribonucléoprotéiques

Les conduites sur de longues distances du phloème sont essentiels pour la répartition des nutriments organiques chez les plantes supérieures, mais sont également impliqués dans la régulation de nombreux processus différents importants pour la croissance et développement, défense de l’agent pathogène et l’adaptation aux effets indésirables conditions environnementales. Outre petits effecteurs tels que les ions, phytohormones ou métabolites eux-mêmes, les macromolécules comme les protéines et les ARN ont récemment émergé comme signaux potentiels.

Des études ont montré que le chargement de phloème des protéines est taille dépendant et contrôlé par la limite d’exclusion de taille (SEL) des unités pore-plasmodesmal reliant les cellules compagnes (CC) et filtrez les éléments (SE) qui sont typiquement de l’ordre de 10 à > 67 kDa^{1 , 2 , 3}. Toutefois, malgré ces protéines plus grandes limites de taille et de protéines complexes ont été découverts dans le système de phloème contestant l’idée d' exclusion de taille⁴et perte même non spécifique des protéines du CC pour soi a été suggérée⁵ .

Des complexes ribonucléoprotéiques multiprotéiques ainsi que de grandes jouent un rôle essentiel dans la biosynthèse et le maintien de l’intégrité structurale de la cellule⁶. On constate qu’il existe des complexes protéine-protéine et ribonucléoprotéique phloème-mobile^4,7, mais à ce jour, on sait peu sur leur fonction. En éléments criblés du phloème RNP complexes et protéines : les protéines ont été impliqués avec transport à longue distance et / ou signalisation^8,9. Pour démêler les fonctions des translocations complexes, étudier leur composition sous des variables environnementale ou des conditions de stress est nécessaires. Pour y parvenir, natives complexes doivent être isolés et leurs composants doivent être séparés avec une résolution suffisante.

Pour isoler des complexes de poids moléculaire élevé de phloème, il faut d’abord obtenir des échantillons de sève en qualité et en quantité suffisante. La technique qui peut être utilisée pour l’échantillonnage de phloème dépend de l’espèce végétale d’intérêt. Trois méthodes principales pour obtenir la sève existent ¹⁰: insectes stylectomie¹¹, facilitées par EDTA exsudation¹²et exsudation spontanée¹³.

Échantillons de phloème d' Arabidopsis thaliana (a. thaliana), l’usine modèle majeur dans les laboratoires du monde entier, ne peuvent être obtenues que par l’EDTA-facilité exsudation ou puceron stylectomie^14,15. Les deux méthodes conduisent à sève hautement diluées ou montants d’échantillon très faible. Exsudation facilitées par EDTA est également sujette à la contamination et ne peut pas représenter le phloème véritable composition¹⁶. Exsudation spontanée de phloème se limite à planter des espèces comme les cucurbitacées, lupin ou yucca, où couper les parties de la plante entraîne une émission spontanée de sève qui peut être facilement collectées^{13,17,18, 19}. Nous avons récemment mis en place les colzas (Brassica napus) comme un système de modèle approprié pour l’analyse de phloème, puisque c’est un proche parent du thaliana et plusieurs microlitres de sève peuvent être obtenus auprès de petites incisions qui s’est avéré être de grande pureté^4,8,20. En outre, la séquence du génome de b. napus sortit en 2014²¹.

À l’exception des pucerons stylectomie, toutes les méthodes de collecte de phloème décrites comprennent endommager des tissus sur le site d’échantillonnage environnants, et la composition de la sève peut changer en réponse à une lésion. Il est donc indispensable de vérifier la qualité des échantillons de phloème, quelle que soit la méthode d’échantillonnage appliquée. Il existe différentes méthodes pour le contrôle de la qualité de sève recueillies, par exemple par détermination de la RNase activité^22,23, RT-PCR avec des amorces contre Rubisco^8,24ou l’analyse du sucre composition⁸.

Différentes méthodes pour isoler et séparer des complexes protéiques peuvent être appliquées, y compris chromatographie d’exclusion, ultracentrifugation de densité de saccharose ou échantillon filtration à travers des membranes avec des poids moléculaires distinctes coupe offs. Cependant, ces approches ne permettent pas de haute résolution. La technique appelée bleue PAGE native (BN-PAGE), d’abord décrit par Schägger et al. ²⁵, est supérieure en termes de résolution. Il a été utilisé avec succès pour déterminer le poids moléculaire de complexes de grosse protéine native de divers organites ou de lysats cellulaires et leur abondance relative^26,27.

Pour plus amples élucider la composition complexe de complexes protéiques, il est nécessaire de séparer les différents composants dans des conditions, conduisant à un démontage complet des composants complexes dénaturantes. Ceci peut être réalisé par une deuxième dimension du SDS-PAGE ^28,29 , ou, pour obtenir une résolution plus élevée, par une deuxième dimension de l’isoélectrofocalisation (IEF) suivie d’une third dimension de SDS-PAGE³⁰ et l’identification ultérieure des les protéines par spectrométrie de masse.

Dans ce protocole, nous décrivons le prélèvement de sève pure de b. napus plantes et l’analyse des protéines complexes de ces échantillons de phloème en utilisant une approche électrophorétique 3D combinant BN-PAGE avec Tris-Tricine-urée-PAGE et SDS-PAGE. Les protéines séparées des composants complexes sont par la suite identifiés par spectrométrie de masse. En outre, nous introduisons bleu natif northern Blot comme une méthode permettant la détection d’ARN en grandes RNP complexes⁴, étendre l’applicabilité de l’approche.

1. l’échantillonnage et préparation de sève de b. napus plantes ^4,8,20

1. Pour sève d’échantillonnage, utilisez bien arrosées 8 semaines cette floraison initial seulement voir l’afin d’éviter des contaminations de pollen de plantes de b. napus .
2. Utiliser une aiguille hypodermique (Ø 0,8 mm) et ponctuée de l’inflorescence la tige plusieurs fois. Répétez à plusieurs autres tiges d’inflorescence et sur d’autres plantes pour obtenir assez sève (Figure 2 a).
   Remarque : Pour des analyses complexes, il est recommandé de commencer au moins 600 µL de sève. 4 à 5 plantes produiront entre 200 et 700 µL de sève.
3. Essuyer la première goutte sur les sites accidentés avec filtre papier. Principalement, ces gouttes contiennent des matières hautement contaminés d’entourant les tissus lésés et doivent être jetés.
4. Recueillir les gouttes suivants de pipetage et stocker l’exsudat recueilli dans un tube à essais préalablement réfrigérées conique 1,5 mL à-20 ° C à l’aide d’un système de refroidissement sans glace.
5. Poursuivre la collecte jusqu'à ce qu’aucune autre formation de goutte n’est observable, mais pas plus de 1 h. Cette procédure peut être répétée après deux jours sans perte significative de sève recueillie.
   Remarque : La sève recueillie peut être utilisée immédiatement ou stockée à-80 ° C pour des analyses. Pour le stockage de-80 ° C,-congélation le tube de réaction dans l’azote liquide.
6. Concentrer l’échantillon de phloème à environ 1/6^ème de son volume initial à l’aide de concentrateurs centrifuges avec un poids moléculaire coupé (MWCO) de 10 000 Daltons (Da). Centrifuger l’échantillon concentré à 4 ° C et 20 000 x g pendant au moins 15 min enlever les particules de poussière.
   NOTE : Concentration de sève de phloème ne conduit pas à une perte importante de protéines.
7. Pour leur analyse complexe, passez à l’étape 3.1.

2. contrôle de pureté du phloème sap à l’aide de la reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ^4,8,20

1. Isoler l’ARN total de sève à l’aide d’une méthode d’extraction de RNA standard pour matières liquides (p. ex. TRIzol ou phénol-chloroforme extraction suivie d’isopropanol précipitation de la phase aqueuse et d’éthanol lavage étapes selon la Protocole du fabricant).
   ATTENTION : Phénol-chloroforme est toxique. Travailler sous une hotte avec équipement de protection individuelle appropriés. L’ARN extrait peut être conservée dans l’éthanol à-80 ° C pendant jusqu'à six mois.
2. Élimination des contaminants de l’ADN par digestion avec la DNase I (1 u/µg) pour 45 min à 37 ° C et inactiver les enzymes en ajoutant EDTA à une concentration finale de 5 mM et incuber l’échantillon à 75 ° C pendant 10 min.
3. Pour obtenir des RNA pur, purifier et concentrer l’échantillon par une autre étape de purification (par exemple à l’aide de Kits de nettoyage de RNA, selon les instructions du fabricant).
4. Effectuer une reverse transcriptase PCR (RT-PCR) pour la synthèse de cDNA avec un kit de synthèse de cDNA en utilisant 150 ng d’ARN pur tel que décrit par le fabricant du protocole.
   Remarque : L’ADNc peut être stocké à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
5. Utiliser 5 µL de l’ADNc comme modèle pour une réaction de PCR standard tel que spécifié par le fabricant, pour amplifier les transcriptions de compartiment spécifique et vérifier par électrophorèse sur gel d’agarose. Confirmer la pureté des échantillons de phloème par exemple à l’aide d’amorces pour la petite sous-unité de rubisco, thiorédoxine h et la protéine de capside du pollen (Figure 1 b, tableau 1).

3. bleu natif PAGE ^4,25,26,31

1. Utiliser soit coulé des gels natifs de dégradé comme décrit ailleurs²⁷ ou commerciales gels de gradient de Bis-Tris.
2. Charge de 20 à 30 µg de l’échantillon de concentré de protéine / puits sur le gel en triplicates au moins.
3. Exécutez le gel à 4 ° C et 150 V à l’aide de buffer de cathode bleu foncé B et anode (tableau 2) jusqu'à ce que l’échantillon passé 1/3^rd du gel (env. 20 à 30 min, Figure 3 a).
   Remarque : Pour le transfert de Northern, une voie unique de gel est suffisante, tandis que pour l’analyse de la composition en protéines par PAGE 3D et spectrométrie de masse qu'il est recommandé de combiner la même bande de jusqu'à dix voies de gel pour concentrer les protéines moins abondantes.
4. Interrompre la course et échange cathode bleu foncé tampon B cathode bleu clair tampon B/10 (tableau 2) et continuer la course. Terminer le gel exécuté au démarrage de la façade bleue éluer hors gel (environ 120 à 180 min, Figure 3 a).
   Remarque : Le gel natif bleu fini peut être stocké à 4 ° C pendant au moins une semaine. Une conservation prolongée peut conduire à diffuser des bandes et devrait être évitée. Tampon bleu foncé B puisse être réutilisé.

4. facultative : Détection de l’ARN à l’aide de bleu natif du Nord buvard ⁴

1. Découper des bandes distinctes ou utiliser la voie de tout gel de gel bleu natif et transférez-les sur une membrane de nylon par demi-sec buvard à 3,5 mA/cm² pour 60 min et marquer la frontière gel supérieur et inférieur avec un crayon sur la membrane (Figure 4 a).
2. Après avoir éponger, laver la membrane avec de l’eau traitée DEPC et sécher entre deux papiers filtres.
3. Effectuer des UV-réticulation de la membrane buvardages avec 120 000 MJ/cm² (85 s si vous utilisez la RETICULATION dans la Table des matières).
4. Les hybrider la membrane avec 6 mL de tampon d’hybridation (commercial ou autodidacte) pendant 60 min à 68 ° C dans un four à hybridation (Figure 4 a).
5. Ajouter 1 mL d’un tampon d’hybridation contenant 4 µL de sondes de 3'-biotinylé supplémentaire (100 nM).
6. Incubez la membrane avec la sonde du jour au lendemain, en refroidissant le four de 68 ° C à 37 ° C.
7. Nettoyer la membrane avec un tampon contenant 2 SDS x SSC et 0,1 %, pendant 5 min à température ambiante pour retirer les sondes liés besoin.
   ATTENTION : SDS peut causer des irritations. Porter des gants et blouse de laboratoire lorsque vous travaillez avec le SDS et SDS contenant des solutions.
8. Effectuer la détection des sondes de 3'-biotinylé sur la membrane par exemple avec un conjugué streptavidine-HRP et le luminol comme substrat peroxydase de raifort (HRP) raifort, entraînant une réaction chimiluminescente sensible (Figure 4 a).

5. deuxième dimension : Tris-Tricine-urée PAGE ^4,28

1. Des bandes individuelles de gel bleu natif de l’accise. Combiner les bandes d’échantillons sur des voies parallèles pour atteindre une concentration supplémentaire de protéines complexes (Figure 5).
   NOTE : Bandes excisées peuvent être stockés dans tubes de réaction unique jusqu'à utilisation ultérieure à 4 ° C.
2. Versez un gel de Tris-Tricine-urée de 12 % (épaisseur de 1 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (largeur x longueur)). Préparer le gel de séparation (tableau 2), 10 mL de la solution de gel A verser entre deux plaques de verre et de superposition avec de l’isopropanol. Supprimer l’isopropanol après que la polymérisation est terminée et le transfert de 4 mL de solution de gel B (tableau 2) pour le gel de concentration sur le gel et insérer qu'un 10 bien peigner.
   ATTENTION : L’acrylamide non polymérisée peut être neurotoxique et TEMED est nocif par inhalation. Toujours porter un équipement de protection individuelle et travailler sous une hotte.
3. Transférer les bandes de gel excisées dans un tube de réaction de 1,5 mL et ajouter 1 mL de 2 x SDS solution tampon pour l’équilibration des pièces gel (Figure 5, tableau 2).
   1. Incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante, avant de faire bouillir dans un bloc chauffant (95 ° C) ou dans un four à micro-ondes et incuber les échantillons à nouveau à température ambiante pendant 15 minutes supplémentaire.
   2. Empilez plusieurs morceaux de gel équilibré qui représente le même complexe dans un gel unique poche.
   3. Effectuer l’électrophorèse de l’anode et la cathode exécutant des tampons à 150 V pendant 45 à 60 min et la voie gel toute l’accise.
4. Incuber la voie coupée pendant 20 min dans un tampon acide (Tris, d’acide acétique 100 mM 100 mM) et équilibrer en 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 pendant 20 min (Figure 5).

6. troisième dimension : SDS-PAGE ^4,32

1. Versez une SDD 15 % séparant gel selon Laemmli³² (épaisseur : 1,5 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (largeur x longueur)) (tableau 2) et ajoutez une fine couche d’un 4 % gel ci-dessus d’empilage.
   ATTENTION : SDS, l’acrylamide et TEMED sont toxiques et nocives. Travailler sous une hotte et porter des équipements de protection individuelle.
2. Transférer la voie gel équilibré sur le gel SDS et couvrir le gel d’agarose de 0,5 % (p/p) 1 x SDS tampon additionné d’une trace de bleu de bromophénol (Figure 5).
3. Faire bouillir le SDS exécutant tampon avec agarose dans le four à micro-ondes avant chargement dans le gel.
4. Pour faire fonctionner un marqueur protéique pour estimer le poids moléculaire des composants simples, insérez un morceau de papier filtre sur une extrémité du gel jusqu'à ce que l’agarose solidifié ou utilisez un peigne spécial, généralement utilisé pour les gels de l’IPG.
5. Exécutez le gel à 150 V pour 60 min et tache le gel colloïdal Coomassie, tache argentée ou toute autre coloration méthode d’analyse par spectrométrie de masse ultérieure.
6. Analyser les taches de protéines visibles en utilisant des approches par spectrométrie de masse comme du désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) temps de vol ou de CL-SM/SM spectrométrie de masse.
   Remarque : Nous recommandons d’utiliser le bleu de Coomassie colloïdal coloration comme déjà décrit³³. Dans nos mains, encore moins abondantes protéines peut être suffisamment coloré et permet une analyse par spectrométrie de masse avec la qualité des données raisonnables.

Nous présentons ici un protocole qui permet l’analyse des protéines : protéines ainsi que des complexes protéine-ARN dans des échantillons de phloème de Brassica napus. Le flux de travail est illustré à la Figure 1. Un avantage majeur de b. napus sur autres organismes modèles est la possibilité de prélèvement d’échantillons de phloème relativement facile de petites perforations dans la tige de l’inflorescence. Cela permet d’obtenir des échantillons de phloème pure en relativement grande quantité. Lors de l’échantillonnage du phloème, il est toujours conseillé de rechercher des contaminations, par exemple par RT-PCR8. Un résultat représentatif obtenu auprès d’un échantillon de phloème pure est représenté à la Figure 2. Échantillons de phloème non-contaminés devraient montrer une bande visible pour la thiorédoxine h, alors qu’aucun signal de la rubisco et la protéine de capside de pollen ne doit apparaître. La petite sous-unité de rubisco peut servir comme un contrôle dans les échantillons de feuilles, les tiges de l’inflorescence ou pollen. Thioredoxin h devrait être détectable dans tous les échantillons, puisque son ARNm a été trouvé dans le phloème de différentes espèces, tandis que la transcription de protéine de manteau de pollen ne devrait être visible dans les échantillons de bourgeons floraux. Des contaminations peuvent se produire lors du phloème est réalisée entièrement angiospermes (protéine de capside du pollen) ou lorsque les gouttelettes premières de phloème d’échantillonnage crevaisons sont rejetées pas correctement (rubisco).

BN-PAGE intempestive, il est obligatoire de concentrer la sève. Chaque puits, avec 20 à 30 µg de protéines, au moins quatre bandes de complexes protéiques majeurs seront visibles qu’après BN-PAGE de b. napus sève, trop faible ou trop fortes concentrations ne permettent pas une séparation claire des complexes (Figure 3). Il est recommandé de charger plusieurs bandes de gel représentant le même complexe dans une poche unique du gel seconde dimension de concentrer davantage les protéines de chaque complexe unique pour fins d’identification par spectrométrie de masse et de traitement en aval.

Pour identifier les composants individuels des complexes macromoléculaires de phloème, nous combinée de la BN-PAGE initiale avec une deuxième dimension Tris-Tricine-urée et une troisième dimension SDS-PAGE, pour obtenir une séparation de protéines simples. Ici, on peut observer une séparation avec une haute résolution en raison des comportements de migration différentes protéines urée et gels SDS-PAGE. En règle générale, les protéines appartenant à un seul complexe sera visibles comme une ligne diagonale à travers le gel. Les protéines au-dessus de cette ligne ont une hydrophobie accrue, tandis que les protéines au-dessous du seuil représentent plus hydrophiles28 (Figure 5, Figure 6).

Pour la caractérisation des complexes de RNP, nous avons utilisé une partie d’un gel de BN-PAGE pour effectuer le transfert de Northern BN. Après avoir éponger d’une allée entière sur une membrane de nylon et la réticulation par irradiation UV, l’ARN peut être visualisée à l’aide de sondes spécifiques RNA, tel qu’illustré à la Figure 4. Ici, il est démontré qu’un ARNt spécifique n’est présent que dans un seul complexe spécifique. Les constituants protéiques de ce complexe ARNt-liaison peuvent être étudiées plus loin en utilisant la méthode gel 3D décrite ci-dessus. Les analyses par spectrométrie de masse ont montré que ce complexe contienne principalement ARNt-ligases ce qui confirme l’activité de liaison ARNt trouvée par BN northern blot.

Figure 1 : flux de l’analyse des complexes ribonucléoprotéiques de travail dans la sève du colza. Après échantillonnage et préparation des échantillons de phloème, BN-PAGE est effectuée pour séparer des complexes natives. Ces gels BN-PAGE permettent l’analyse parallèle des acides nucléiques par BN northern Blot et l’identification des éléments protéiques des complexes par spectrométrie de masse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : contrôle d’échantillonnage et de la pureté de la sève de b. napus. Après ponction de la tige de l’inflorescence de 8 à 10 semaine vieux oléagineux viol plantes avec une seringue hypodermique stérile, exsudat est recueilli avec une pipette et transférée dans un tube de réaction glacée (a) pour confirmer la pureté des échantillons du phloème QUE RT-PCR est réalisée, amplifier les transcriptions de thioredoxin h, petite sous-unité de rubisco et protéine de capside du pollen dans les échantillons de tissu-spécifique (b) RT-PCR sans la transcriptase inverse a été réalisée sous contrôle (-). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3: BN-PAGE. Représentation schématique du bleue PAGE native avec des échantillons de phloème concentré de b. napus. (a) après le chargement le gel protéique dégradé avec 15-20 µL de sève concentrée, BN-PAGE est réalisée avec un tampon de cathode bleu foncé 1 x B à 150 V pendant 20-30 min dans une chambre froide. Puis le tampon est échangé contre 1 tampon de cathode bleu clair x B/10 et la PAGE est terminée à 150 V 120-180 min jusqu'à ce que le bleu foncé en cours d’exécution avant courses hors gel. Les gels de BN-PAGE montrent quatre bandes distinctes représentant les quatre différents complexes de poids moléculaire élevé. (b) (c) trop peu ou trop protéines du phloème (d) de chargement réduit la visibilité des complexes individuels. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : le transfert de Northern BN. Représentation schématique de la BN du Nord buvard méthode. une ruelle de la BN-PAGE est transférée sur une membrane de nylon en semi sèche en tamponnant. Après réticulation UV et pré-hybridation, la membrane est incubée avec des sondes spécifiques d’ARN (sonde ici une méthionine ARNt spécifiques), qui sont biotinylated à l’extrémité 3'-dans un four à hybridation pendant la nuit. Sondes libres sont éliminés par étapes de lavage et la détection de l’ARN s’effectue par un conjugué streptavidine-HRP et luminol. En utilisant cette approche, nous avons observé que le complexe IV de la BN-PAGE contienne méthionine ARNt. (b) le gel teinté de bleu de Coomassie et la tache de tRNA ressemblent à deux voies différentes gel s’exécutés en parallèle afin d’éviter des différences de migration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : pages 3D. Représentation schématique de l’approche 3D-PAGE. Plusieurs bandes du même complexe sont excisés d’un gel de BN-PAGE, incubés dans le tampon de chargement et transférés dans un puits de la deuxième dimension Tris-Tricine-urée-PAGE. Après électrophorèse, gel toute voies sont découper, lavées à l’acide tampon acide, équilibrés et placés sur un gel SDS-PAGE de 15 %. Après la troisième dimension PAGE, les protéines séparées sont Coomassie souillé et analysé par spectrométrie de masse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : représentant les résultats après pages 3D. Dans la première dimension BN-PAGE plusieurs complexes est apparus. Leurs constituants protéiques pourraient être séparées par deux les PAGEs suivantes sur la dénaturation, résultant en un motif diagonale spot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : amorces utilisées pour le contrôle de pureté du phloème échantillon. Pour vérifier la pureté d’échantillon du phloème amorces spécifiques pour la petite chaîne de rubisco, thiorédoxine h et protéine de capside de pollen peuvent être utilisés pour l’amplification de l’ADNc.

Tableau 2 : Solutions et recettes tampon. Liste de tous les tampons et les solutions nécessaires pour l’analyse 3D-PAGE.

Tableau 3 : identifier les constituants protéiques du complexe IV. Plusieurs ligases tRNA et davantage de protéines ont été découverts dans le complexe de liaison ARNt analyse par spectrométrie de masse à l’aide de MALDI-TOF après 3D-PAGE.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.